Pteridium aquilinum, conhecida popularmente como "samambaia-do-campo" ou simplesmente "samambaia", é considerada uma das plantas tóxicas mais importantes no mundo, não só pela sua distribuição cosmopolita e intoxicação de rebanhos em diversas partes do mundo, mas também pelo seu alto potencial carcinogênico observado em animais e seres humanos que se alimentam com esta planta. Por outro lado, não havia dados na literatura a respeito dos possíveis efeitos tóxicos desta planta sobre o sistema imune, o qual se sabe, tem papel fundamental não só para o controle de doenças infecciosas, como também, para impedir a proliferação de células mutantes e, conseqüentemente o desenvolvimento de câncer. Assim, o presente estudo avaliou os efeitos da P. aquilinum sobre as respostas imune inata e adaptativa em camundongos, através dos seguintes protocolos: produção e titulação de anticorpos T - dependente, proliferação de linfócitos T e B, resposta de hipersensibilidade tardia, fenotipagem linfocítica e citotoxicidade de células NK. Além disso, foram feitas a avaliação histológica e a contagem da celularidade dos órgãos linfóides. Resultados mostraram diminuição da resposta de hipersensibilidade tardia (resposta celular) nos grupos tratados com 10 e 30 g/kg de samambaia, redução da citotoxicidade das células NK, redução da polpa branca do baço, diminuição da camada celular do timo e desorganização dos folículos linfóides nos linfonodos mesentéricos e placas de Peyer dos camundongos tratados com a dose de 30 g/kg de samambaia e diminuição na celularidade da medula óssea em todos os grupos tratados com a samambaia, por 14 dias. Os dados obtidos na presente pesquisa permitem sugerir que a diminuição da resposta imune celular foi decorrente do efeito tóxico da P. aquilinum sobre as células NK e não um efeito tóxico direto sobre os linfócitos Th1. / Pteridium aquilinum, known popularly as \"bracken fern\" is considered one of the more important toxic plants in the world, not only for its cosmopolite distribution and poisoning of flocks in diverse parts of the world, but also for its high potential carcinogenicity observed in animals and human that feed with this plant. On the other hand, there are not data available in the literature regarding the possible toxic effects of this plant on the immune system that is fairly known to be important not also for the control of infectious illnesses but also to hinder the proliferation of mutant cells and, consequently cancer development. Thus, the present study evaluated the effect of the P. aquilinum on the innate and acquired immune responses in mice, through the following protocols: production and titer of T - dependent antibody, proliferation of T and B lymphocytes, delayed-type hypersensitivity, lymphocyte subset analysis and natural killer-cell activity. Moreover, histophatological evaluation and cellularity of the lymphoid organs were performed. Results showed reduction of the delayed-type hypersensitivity (cellular immune response) of the mice treated with 10 and 30 g/kg of bracken fern. Besides, it was observed reduction of the natural killer-cell cytotoxicity, decrease of white pulp of spleen and of the cellular layer of the thymus, disorganization of the lymphoid follicle in the mesenteric lymph nodes and Peyer?s patches of the mice treated with 30 g/kg. It was also observed decrease of bone marrow cellularity of all animals treated with bracken fern up to 14 days. Thus, these data found here permit to suggest that P. aquilinum produced reduction of the cellular immune response by a direct toxic effect on the natural-killer cells and not on the Th1 lymphocytes.

O presente estudo visou avaliar os possiveis efeitos imunotóxicos e imunoteratogênicos da integerrimina N-óxido presente no resíduo butanólico (RB) do ,Senecio brasiliensis, uma planta hepatotóxica que contém alcalóides pirrolizidínicos (APs). Tem sido relatado o uso de APs como fitoterápicos em todo o mundo e também como contaminantes de pastagens e alimentos, sendo assim responsáveis por intoxicações em animais de produção e humanos; porém, até o momento, não há relatos de sua ação sobre o sistema imune. Assim, após a extração da planta, quantificou-se no RB de Senecio brasiliensis, por meio de análise elementar e de espectro (1H e 13C), cerca de 70% de integerrimina N-óxido. O RB foi administrado a ratos Wistar machos adultos, nas doses de 3, 6 e 9 mg/kg, por gavagem, durante 28 dias. Foram avaliados o ganho de peso, o consumo de alimento, os órgãos linfóides e a fenotipagem de sua células, a atividade de fagócitos, as respostas imunes humoral e celular e atividade proliferativa de linfócitos. Já ratas gestantes, receberam as mesmas doses do RB do 6º ao 20º dia de gestação. No final da gestação, parte das fêmeas foi destinada à cesariana e as restantes prosseguiram à termo até o nascimento, para a análise das proles aos 60 dias de idade. Os fetos provenientes da cesariana foram avaliados quanto ao tamanho, peso, viabilidade e malformações externas e também submetidos à análise óssea. As mães tiveram seu desempenho reprodutivo avaliado. Naquelas proles avaliadas até 60 dias de idade, procedeu-se a avaliação dos órgãos linfóides e dos parâmetros hematológicos. O presente estudo revelou que integerrimina N-óxido promoveu diminuição no ganho de peso corporal de ratos machos adultos, redução na atividade proliferativa das células T e interfência na contagem de células sanguíneas destes animais. Por outro lado, esses mesmos animais não apresentaram diferenças na atividade de fagócitos, na fenotipagem de linfócitos e nas respostas imunes estudadas. Em ratas gestantes, o RB causou hepatotoxidade, diminuição do ganho de peso materno, diminuição no tamanho das placentas. A análise fetal revelou menor ossificação. Quando da avaliação da prole aos 60 dias de idade, não foram observados efeitos no ganho de peso atribuídos ao RB, nos órgãos linfóides, e também parâmetros hematológicos e bioquímicos. Concluindo, os estudos aqui realizados permitem sugerir que as doses baixas de integerrimina N-óxido ora empregadas, não promovem efeitos imunotóxicos significantes, bem como não apresentaram potencial teratogênico, seja por meio das avaliações clássicas de teratologia quanto naqueles protocolos de imunoteratogenicidade. / The aim of this study was to evaluate the possible immunotoxic and immunoteratogenic effects of integerrimine N-oxide content in the butanolic residue (BR) of Senecio brasiliensis, a hepatotoxic plant that contained pyrrolizidine alkaloids (PAs). PAs have been reported as a pasture and food contaminant and as herbal medicine used worldwide and are related to promote poisoning events in livestock and human beings. After the plant extraction, BR residue from Senecio brasiliensis was submitted to elemental and spectral analyses (1H and 13C ) and was found to contain approximately 70% of integerrimine N-oxide by, which was administered to adult male Wistar rats at doses of 3, 6 and 9 mg/kg for 28 days, by gavage. Body weight gain, food consumption, lymphoid organs and their cell phenotype, phagocyte analysis, humoural and cellular immune responses, and lymphocyte proliferation were evaluated. In addition, pregnant rats received the same doses of BR from the 6th to the 20th gestational day. In late pregnancy, some of the dams were destined for cesarean section and the other females followed the pregnancy until the birth for offspring analysis at 60 days old. Fetuses from cesarean section were evaluated for size, weight, viability and external malformations and also subjected to bone analysis. The reproductive performance of females were performed. The present study showed that integerrimine N-oxide could promote in adult male Wistar rats, body weight gain impairment, interference with blood cell counts and a reducing T cell proliferative; however, no differences in phagocyte activities, lymphocytes phenotyping and immune responses here evaluated were observed. In pregnant rats, BR caused hepatotoxicity, decreased body weight gain and reduced placental size. Fetus analysis showed lower ossification. When 60-days old offspring were it was not observed any toxic effects resulted from BR exposition in body weight gain, lymphoid organs, haematological and biochemical parameters of these rats. It is concluded that low doses of integerrimine N-oxide here employed did not produce marked immunotoxic effects and seems to be a teratogenic signs by both methods, the classical evaluations or by immunoteratological protocols.

O objetivo deste trabalho foi esclarecer qual das frações protéicas da soja é mais alergênica, avaliando-se sua imunogenicidade e alergenicidade por imunoensaios e teste de anafilaxia cutânea passiva. Além desse propósito, este estudo visou a produção de anticorpos monoclonais para utilizá-lo como ferramenta na padronização de um ensaio imunoenzimático com a finalidade de detectar proteínas da soja, em produtos comercializados. A purificação das frações 2S,7S e 11S da soja foi realizada com base em estudos prévios, padronizando-se a metodologia dentro das condições experimentais do laboratório. A constatação da pureza foi realizada por eletroforese em gel de poliacrilamida (gel de empilhamento a 5% e de separação em gradiente de 7 a 15%), onde se verificou as bandas protéicas características de cada fração. Evidenciou-se as subunidades α (63,17 KDa) α\' (58,06 KDa) e β (42,09 KDa), correspondentes à fração 7S da soja e as subunidades ácida (38,8 KDa) e básica (21,04 KDa), correspondentes à fração 11S da soja. A fração 2S da soja mostrou uma banda protéica de 20 KDa, nesse ensaio. Os resultados da cinética demonstraram que as frações 7S e 11S da soja são muito imunogênicas, visto que induziram uma grande produção de anticorpos das classes IgM e IgG, em camundongos BALB/c. Por outro lado, a fração 2S da soja induziu uma pequena produção de anticorpos IgG, principalmente no 30º dia após a imunização. No teste de anafilaxia cutânea passiva, quando se avaliou a capacidade das frações protéicas da soja de induzirem a produção de anticorpos IgE, em camundongos BALB/c, verificou-se que a fração 7S da soja é alergênica, nesse modelo experimental. Entretanto, as frações 2S e 11S não estimularam o sistema imunológico desses animais a produzir essa classe de anticorpo. Quando se investigou a presença de anticorpos IgE dirigidos contra as frações protéicas 2S, 7S e 11S da soja, no soro de pacientes alérgicos, obteve-se resultado negativo com todas as três proteínas estudadas. Entretanto, na análise da presença de IgG, tanto o soro dos pacientes alérgicos como o dos controles mostraram-se reativos às frações 2S e 7S da soja, sugerindo a presença do anticorpo IgG4 anafilático no soro teste. Os quatro anticorpos monoclonais reativos às frações 7S e 11S da soja, obtidos neste estudo, mostraram-se reativos até as diluições 1/8000 (2A8 e 1H4) e 1/10000 (1F9) para a fração 7S e 1/12000 (3F2) para a fração 11S da soja. A identificação dos determinantes antigênicos reconhecidos pelos anticorpos monoclonais foi realizado por Imunotransferência. Observou-se que os anticorpos monoclonais anti-fração protéica 7S da soja (1H4, 2A8 e 1F9) reconheceram as subunidades α, α e β (1F9), α\' e β (1H4) e β (2A8), além de outras proteínas. Por outro lado, o anticorpo monoclonal anti-fração protéica 11S da soja (3F2) reagiu apenas com a subunidade básica dessa proteína. A padronização do ensaio imunoenzimático com o objetivo de detectar proteínas de soja, em produtos comercializados, mostrou que os anticorpos monoclonais dirigidos contra as frações protéicas 7S e 11S reconhecem, apenas, as proteínas da soja. Em conclusão, esses resultados sugerem que as frações protéicas 7S e 11S da soja são imunogênicas em camundongos, enquanto que na espécie humana, essa resposta foi observada com as frações 2S e 7S da soja. No teste de anafilaxia cutânea passiva, a fração protéica 7S da soja mostrou a capacidade de induzir anticorpos da classe IgE em camundongos BALB/c, sugerindo que essa fração é alergênica nesse ensaio. Por outro lado, os anticorpos monoclonais reativos às frações 7S e 11S detectaram as proteínas da soja nos produtos comercializados testados. / The goal of this study was to elucidate which of the soy protein fractions is more allergenic by using enzyme immunoassays and passive cutaneous anaphylactic activity test. Furthermore, monoclonal antibodies were obtained in order to standardize immunoassays to detect soy protein fractions in commercial soy-derived products. Purification of 2S, 7S and 11S fractions from soy was based on previous studies which were adapted to our experimental conditions. Purity of the isolated fractions was determined by polyacrilamide gel electrophoresis (7-15%). The subunits α (63,17 KDa) α\' (58,06 KDa) and β (42,09 KDa), corresponding to 7S fraction as well as the acid (38,8 KDa) and basic (21,04 Kda) subunits of 11S fraction were visualized. The 2S fraction showed a 20 KDa band only. Data showed that the 7S and 11S soy fractions are immunogenic as they elicited IgM and IgG antibodies in BALB/c mice. In contrast, the 2S fraction was not immunogenic in this specie. The passive cutaneous anaphylactic activity test showed that 7S fraction is allergenic as it elicited IgE production in BALC mice. However, this test was negative for 2S and 7S fractions. No IgE reactive against the 2S, 7S e 11S was found in sera of patients (n=5) presenting previous food allergy symptoms. However, either these patients or controls (n=5) showed IgG reactive against 2S and 7S fractions in their sera. The four monoclonal antibodies obtained in this study were reactive up to 1/8000 (2A8 and 1H4) and 1/10000 (1F9) against 7S fraction, and up to 1/12000 (3F2) for 11S fraction. Immunoblot analysis showed that the monoclonal antibodies anti-7S fraction (1H4, 2A8 e 1F9) recognized the α α\' and β (1F9), α\' and β (1H4) and α (2A8) subunits. The monoclonal antibody anti-11S fraction (3F2) reacted with the basic subunit of this fraction only. By using ELISA and the monoclonal antibodies anti-7S and anti-11S it was possible to detect especifically these soy protein fractions in commercial soy-derived products. In conclusion, data suggest that 7S and 11S soy protein fractions are immunogenic in mice while 2S and 7S fraction are immunogenic in humans. The IgE response to 7S fraction in BALB/c mice showed by the passive cutaneous anaphylactic activity test indicates that this soy protein fraction is allergenic in this experimental model. Finally, the monoclonal antibodies anti-7S and anti-11S obtained in this study did not react with other vegetable or animal proteins being suitable to be used in ELISA for detection of these proteins in commercial soy-derived products.

O objetivo deste trabalho foi esclarecer qual das frações protéicas da soja é mais alergênica, avaliando-se sua imunogenicidade e alergenicidade por imunoensaios e teste de anafilaxia cutânea passiva. Além desse propósito, este estudo visou a produção de anticorpos monoclonais para utilizá-lo como ferramenta na padronização de um ensaio imunoenzimático com a finalidade de detectar proteínas da soja, em produtos comercializados. A purificação das frações 2S,7S e 11S da soja foi realizada com base em estudos prévios, padronizando-se a metodologia dentro das condições experimentais do laboratório. A constatação da pureza foi realizada por eletroforese em gel de poliacrilamida (gel de empilhamento a 5% e de separação em gradiente de 7 a 15%), onde se verificou as bandas protéicas características de cada fração. Evidenciou-se as subunidades α (63,17 KDa) α\' (58,06 KDa) e β (42,09 KDa), correspondentes à fração 7S da soja e as subunidades ácida (38,8 KDa) e básica (21,04 KDa), correspondentes à fração 11S da soja. A fração 2S da soja mostrou uma banda protéica de 20 KDa, nesse ensaio. Os resultados da cinética demonstraram que as frações 7S e 11S da soja são muito imunogênicas, visto que induziram uma grande produção de anticorpos das classes IgM e IgG, em camundongos BALB/c. Por outro lado, a fração 2S da soja induziu uma pequena produção de anticorpos IgG, principalmente no 30º dia após a imunização. No teste de anafilaxia cutânea passiva, quando se avaliou a capacidade das frações protéicas da soja de induzirem a produção de anticorpos IgE, em camundongos BALB/c, verificou-se que a fração 7S da soja é alergênica, nesse modelo experimental. Entretanto, as frações 2S e 11S não estimularam o sistema imunológico desses animais a produzir essa classe de anticorpo. Quando se investigou a presença de anticorpos IgE dirigidos contra as frações protéicas 2S, 7S e 11S da soja, no soro de pacientes alérgicos, obteve-se resultado negativo com todas as três proteínas estudadas. Entretanto, na análise da presença de IgG, tanto o soro dos pacientes alérgicos como o dos controles mostraram-se reativos às frações 2S e 7S da soja, sugerindo a presença do anticorpo IgG4 anafilático no soro teste. Os quatro anticorpos monoclonais reativos às frações 7S e 11S da soja, obtidos neste estudo, mostraram-se reativos até as diluições 1/8000 (2A8 e 1H4) e 1/10000 (1F9) para a fração 7S e 1/12000 (3F2) para a fração 11S da soja. A identificação dos determinantes antigênicos reconhecidos pelos anticorpos monoclonais foi realizado por Imunotransferência. Observou-se que os anticorpos monoclonais anti-fração protéica 7S da soja (1H4, 2A8 e 1F9) reconheceram as subunidades α, α e β (1F9), α\' e β (1H4) e β (2A8), além de outras proteínas. Por outro lado, o anticorpo monoclonal anti-fração protéica 11S da soja (3F2) reagiu apenas com a subunidade básica dessa proteína. A padronização do ensaio imunoenzimático com o objetivo de detectar proteínas de soja, em produtos comercializados, mostrou que os anticorpos monoclonais dirigidos contra as frações protéicas 7S e 11S reconhecem, apenas, as proteínas da soja. Em conclusão, esses resultados sugerem que as frações protéicas 7S e 11S da soja são imunogênicas em camundongos, enquanto que na espécie humana, essa resposta foi observada com as frações 2S e 7S da soja. No teste de anafilaxia cutânea passiva, a fração protéica 7S da soja mostrou a capacidade de induzir anticorpos da classe IgE em camundongos BALB/c, sugerindo que essa fração é alergênica nesse ensaio. Por outro lado, os anticorpos monoclonais reativos às frações 7S e 11S detectaram as proteínas da soja nos produtos comercializados testados. / The goal of this study was to elucidate which of the soy protein fractions is more allergenic by using enzyme immunoassays and passive cutaneous anaphylactic activity test. Furthermore, monoclonal antibodies were obtained in order to standardize immunoassays to detect soy protein fractions in commercial soy-derived products. Purification of 2S, 7S and 11S fractions from soy was based on previous studies which were adapted to our experimental conditions. Purity of the isolated fractions was determined by polyacrilamide gel electrophoresis (7-15%). The subunits α (63,17 KDa) α\' (58,06 KDa) and β (42,09 KDa), corresponding to 7S fraction as well as the acid (38,8 KDa) and basic (21,04 Kda) subunits of 11S fraction were visualized. The 2S fraction showed a 20 KDa band only. Data showed that the 7S and 11S soy fractions are immunogenic as they elicited IgM and IgG antibodies in BALB/c mice. In contrast, the 2S fraction was not immunogenic in this specie. The passive cutaneous anaphylactic activity test showed that 7S fraction is allergenic as it elicited IgE production in BALC mice. However, this test was negative for 2S and 7S fractions. No IgE reactive against the 2S, 7S e 11S was found in sera of patients (n=5) presenting previous food allergy symptoms. However, either these patients or controls (n=5) showed IgG reactive against 2S and 7S fractions in their sera. The four monoclonal antibodies obtained in this study were reactive up to 1/8000 (2A8 and 1H4) and 1/10000 (1F9) against 7S fraction, and up to 1/12000 (3F2) for 11S fraction. Immunoblot analysis showed that the monoclonal antibodies anti-7S fraction (1H4, 2A8 e 1F9) recognized the α α\' and β (1F9), α\' and β (1H4) and α (2A8) subunits. The monoclonal antibody anti-11S fraction (3F2) reacted with the basic subunit of this fraction only. By using ELISA and the monoclonal antibodies anti-7S and anti-11S it was possible to detect especifically these soy protein fractions in commercial soy-derived products. In conclusion, data suggest that 7S and 11S soy protein fractions are immunogenic in mice while 2S and 7S fraction are immunogenic in humans. The IgE response to 7S fraction in BALB/c mice showed by the passive cutaneous anaphylactic activity test indicates that this soy protein fraction is allergenic in this experimental model. Finally, the monoclonal antibodies anti-7S and anti-11S obtained in this study did not react with other vegetable or animal proteins being suitable to be used in ELISA for detection of these proteins in commercial soy-derived products.

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A administração de 50 mg/kg de CY nos roedores, possibilitou observar uma significativa diminuição dos parâmetros de celularidade e peso relativo dos órgãos linfóides. A imunidade humoral dos roedores sofreu supressão, visto que foi realizada a análise da titulação de anticorpos, o ensaio sobre as células formadoras de placa e o teste de hemólise. Foram realizadas quatro inoculações desse imunossupressor e a periodicidade entre as inoculações foi determinada pela recuperação dos níveis de normalidade dos parâmetros supracitados. Nas duas vezes que foi administrada a droga, houve redução no número de linfócitos e posteriormente diminuição de neutrófilos, porém somente no segundo contato com a CY foi observada a imunossupressão. A análise da genotoxicidade da ciclofosfamida (CY) foi analisada através do ensaio cometa e foi de suma importância, pois dectamos danos genômicos ocorridos no DNA , expostos às diferentes doses da ciclofosfamida (CY), que foram de 50 mg/kg nas duas primeiras fases e de 25 mg/kg nas duas últimas fases do experimento. Além disso, foi verificado que os efeitos genotóxicos são cumulativos a cada dose de CY aplicada, pois mesmo sendo administrado na terceira fase, a metade da concentração (25 mg/kg) das duas inoculações inicias CY, o índice de danos não correspondeu a metade dos índices de danos da primeira e da segunda administração. Entretanto, ao analisarmos imunologicamente e genotoxicamente os roedores, nosso trabalho possibilitará testar novos esquemas terapêuticos de imunossupressão. / The development of this work has given up due to the need to better understand the immune system, taking into account the diversity of experimental immunosuppression models as well as the variety of immunological responses and genotoxic differences these, related species, the drug and doses used. Thus, aim of this study was to analyze the effects on the immune system and genotoxic effects in Rattus norvegicus Wistar, after inoculation of the alkylating agent cyclophosphamide (CY). The administration of 50 mg / kg in rodents CY, possible to observe a significant decrease in the parameters of cellularity and relative weight of lymphoid organs. The humoral immunity of rodents has undergone deletion, since the analysis of the antibody titration was performed on the test plate forming cells and hemolysis testing. four inoculations that immunosuppressant and the intervals between the inoculations was determined by recovery of normal levels of the above parameters were performed. Both times the drug was administered, there was a reduction in the number of lymphocytes and neutrophils subsequently decreased, but only the second contact CY was observed immunosuppression. The analysis of the genotoxicity of cyclophosphamide (CY) was analyzed using the comet assay and was of paramount importance because dectamos genomic damage occurring in DNA exposed to different doses of cyclophosphamide (CY), which were 50 mg / kg in the first two phases and 25 mg / kg during the last two phases of the experiment. Furthermore, it was found that the genotoxic effects are cumulative with each CY dose applied, because even being administered in the third phase, the middle concentration (25 mg / kg) of the two inoculations initial CY the damage index does not correspond to half damage indices of the first and second vaccination. However, the analysis and immunologically genotoxicamente rodents, our work will enable testing new therapeutic immunosuppression regimens.