A pesar de los importantes avances en el conocimiento de la patogenia de las infecciones del tracto urinario (ITU) que se han producido en los últimos años, persisten aún numerosas incógnitas por despejar. A modo de ejemplo cabe señalar que desconocemos gran parte de los mecanismos por los que algunos gérmenes consiguen acantonarse en la próstata, si existen o no factores de virulencia bacterianos y/o del huésped adicionales a los ya conocidos implicados en la aparición de infecciones urinarias recurrentes (ITURs), o el mecanismo por el que ciertas pacientes presentan cuadros de ITU más graves que otras. En relación al estudio de los factores de virulencia, la implicación de la producción de biopelícula por parte de cepas uropatógenas de Escherichia coli, el germen causal más frecuente de las ITUs, en su patogenia ha sido hasta el momento poco estudiada. Si se confirmara dicha implicación, particularmente en la patogenia de las prostatitis o de las ITURs, ello permitiría por ejemplo ajustar de forma individualizada la duración óptima de los tratamientos antibióticos en función de la producción o no de biopelícula.En relación al estudio de los factores dependientes del huésped el campo de estudio es aún mayor. A modo de ejemplo, varios estudios experimentales han evidenciado la importancia de la interleuquina 8 (IL-8) y de sus receptores (CXCR1 y CXCR2) en la patogenia de las ITU, aunque estas observaciones no han podido ser confirmados en humanos. Por otra parte, a pesar de existir numerosas evidencias científicas sobre la implicación de la proteína fijadora de manosa (MBL), otro componente de la inmunidad innata, en la mayor frecuencia y gravedad de ciertos procesos infecciosos, dicha asociación no ha sido evaluada en el caso de las ITU.El objetivo de la presente tesis ha sido analizar: 1. La expresión y la presencia de polimorfismos en el gen de los receptores de la IL-8 en mujeres con ITUR y la presencia de polimorfismos en el gen de la MBL en pacientes con pielonefritis aguda y shock séptico.2. La producción de biopelícula por cepas de UPEC en las diferentes formas de ITU, incluyendo las prostatitis agudas y las ITUR.Los resultados de la presente tesis ha permitido: 1. Conocer mejor la patogenia de la infección urinaria recurrente, tanto en lo que se refiere a los factores dependientes del huésped (disminución de la expresión de CXCR2 pero no de CXCR1 y ausencia de polimorfismos significativos en el gen CXCR1), como a la demostración de la implicación de la producción de biopelícula en el caso de las cistitis recurrentes. 2. Demostrar que aquellas pacientes con una pielonefritis aguda que presentan polimorfismos en el gen de la MBL, asociados a baja producción de MBL, tienen un riesgo mayor de desarrollar un shock séptico. 3. Que las cepas de UPEC aisladas de pacientes con prostatitis aguda producen con mayor frecuencia biopelícula. / The main objective of this doctoral thesis has been to increase the knowledge on the pathogenesis of urinary tract infections (ITUs), studying not only the microorganism, Escherichia coli, but also the host. Regarding the microorganism, the mechanisms by which some remain in the prostate or cause recurrent ITUs are not well understood. Several evidence point that host genetic factors may predispose to recurrent UTIs or to severe forms of UTIs. The objective of this doctoral thesis has been to analyze: 1. The expression of CXCR1 and CXCR2 and the existence of polymorphisms in the CXCR1 gene in women with recurrent UTIs and the presence of polymorphisms in the MBL2 gene in patients with acute pyelonephritis and septic shock. 2. The synthesis of biofilm by E. coli in the different clinical forms of UTIs including acute prostatitis and recurrent ITUs.This thesis has demonstrated that: 1. Women with recurrent UTIs have a lower expression of CXCR2 but not CXCR1 and that biofilm is involved in the pathogenesis of recurrent UTIs. 2. Women with acute pyelonephritis and polymorphisms in the MBL2 gene, related low MBL concentration, have an increased risk of septic shock. 3. E. coli strains involved in acute prostatitis produce biofilm more frequently.

Klebsiella spp., particularmente Klebsiella pneumoniae, es un importante agente causal de infecciones nosocomiales. Las principales infecciones producidas por K. pneumoniae son las neumonías y las infecciones del tracto urinario.En las bacterias gram-negativas el lipopolisacárido (LPS) constituye el antígeno superficial más importante y consta de tres regiones principales: el lípido A, el núcleo del lipopolisacárido, y el antígeno O. Los determinantes genéticos de la biosíntesis del antígeno O y del núcleo del LPS han sido ampliamente estudiados en las Enterobacteriaceae y en otras bacterias gram-negativas.Un total de ocho pautas abiertas de lectura completas (ORFs) eran necesarias para la producción del antígeno O5 del LPS de K. pneumoniae cepa KT769. Mediante el uso de mutantes O5- y la correspondiente cepa salvaje y los mutantes complementados con la agrupación génica wb[O5], hallamos que la presencia del antígeno O5 de K. pneumoniae es esencial para algunas de las características patogénicas de esta bacteria.En un segundo trabajo fue descrita la agrupación génica wb responsable de la biosíntesis del antígeno O12 de K. pneumoniae. Un total de ocho ORFs eran necesarias para la producción del antígeno O12 del LPS de K. pneumoniae cepa KT776. El análisis de la agrupación génica wb[O12] de K. pneumoniae mostró interesantes coincidencias con la agrupación génica wb[O4] de Serratia marcescens. Este hecho nos llevó a estudiar las complementaciones entre las agrupaciones génicas de ambas enterobacterias utilizando mutantes de S. marcescens N28b (O4) y K. pneumoniae KT776 (O12). Los genes wzm-wzt y los genes wbbA o wbbB no eran intercambiables entre ambas agrupaciones génicas, independientemente de los elevados niveles de similitud existentes. Sin embargo, la introducción de los tres genes de una misma agrupación (wzm-wzt-wbbA o wzm-wzt-wbbB) en mutantes incapaces de producir el antígeno O permitió la producción del antígeno O específico de esa agrupación. La proteína WbbL de K. pneumoniae O12 realiza la misma función que la WbbL de S. marcescens O4 tanto en S. marcescens O4 como E. coli K-12.En nuestro último trabajo caracterizamos completamente la agrupación génica waa, implicada en la biosíntesis del núcleo del LPS de la cepa 52145 de K. pneumoniae. Esta agrupación génica presenta tres ORFs diferentes en K. pneumoniae 52145 en comparación con la agrupación waa de K. pneumoniae C3, que había sido descrita previamente. La caracterización genética de la agrupación mostró que las diferencias genéticas en la cepa 52145 implican la existencia de diferencias a nivel de la estructura química del núcleo del LPS de esta cepa.

Urinary tract infection (UTIs) is an extremely common disease. Proteus mirabilis is a common cause of UTI in individuals with functional or structural abnormalities or with long-term catheterization, it forms bladder and kidney stones as a consequence of urease-mediated urea hydrolysis. Known virulence factors, besides urease, are flagella, fimbriae, outer membrane proteins, hemolysins, amino acid deaminase, protease, capsule and lipopolysaccharide (LPS). Study of LPS core is particularly relevant for several reasons: it is a conserved region, although it is increasingly clear that there is some variability at the genus or groups of similar genera, its chemical structure modulates the endotoxic activity of lipid A, alteration of the LPS core, which generates less virulent bacteria, encourages the search of substances that interfere with the biosynthesis of this region, and conserved regions of the core LPS could be useful as antigens in preventing diseases caused by pathogens that contain these conserved regions. The specific aims of this project have been to identify and functionally characterize genes involved in core LPS biosynthesis in P. mirabilis, to elucidate the mechanism of incorporation of galactosamine (GalN) to the core LPS, to identify genes coding for phosphoethanolamine (PEtN) modifications, and to characterize and to study the biological effects of the gene encoding the PEtN transferase involved in the modification of the second heptose residue (L,D-HepII). We found that P. mirabilis has most of the genes for the biosynthesis of LPS core grouped in the waa cluster in the chromosome. Despite this, additional genes required for core LPS biosynthesis are found outside the waa cluster. The pentasaccharide of the inner core, shared by all Enterobacteriaceae, is biosynthesized in P. mirabilis, by the sequential activity of a bifunctional transferase (WaaA) and three heptosyltransferases (WaaC, WaaF, and WaaQ). These enzymes are transcribed from genes located inside the waa cluster, and are conserved in P. mirabilis strains analyzed; for more, they show a high identity and similarity level to homologues proteins of Escherichia coli, Klebsiella penumoniae and Serratia marcescens. The waaL gene, coding for the O-antigen polymerase ligase, is found adjacent to the classic waa cluster. Downstream this gene, four genes encoding enzymes belonging to the 4 (walM, walN, and WalR), and 9 (walO) glycosyltransferase family were found. Even if members of these families were related to LPS core biosynthesis in several Gram-negative bacteria, in P. mirabilis they do not appear to be involved in the biosynthesis of the reported core LPS structures. The presence of the disaccharide hexosamine (HexN)-1,4-galacturonic acid (GalA) is a feature of P. mirabilis LPS outer core. Depending on the nature of the HexN outer core residue, two different homologues for N-acetyl-hexosamine transferases are present in the waa cluster: wabH or wabP. Altought the incorporation of glucosamine into LPS core requires an acetylglucosaminyltransferase (WabH) and a deacetilase (WabN), the incorporation of GalN requires three enzymes: an acetylgalactosaminyltransferase (WabP), a deacetilase (WabN) and an epimerase (gne). An amplification test with specific primers for this two different homologues can be used to predict the HexN nature in P. mirabilis LPS cores. The strain-specific genes wamB and wamC code for a galactosyltransferase and a heptosyltransferase respectively in strain R110 of P. mirabilis. The enzyme encoded by gene wamD is a N-acetylglucosaminyltransferase, and it is found in strain 51/57 of P. mirabilis. WamA, coded by wamA gene in the waa cluster of strains R110, 50/57, TG83 and HI4320, is a heptosyltransferase responsible for the incorporation of a quarter residue of heptose (Hep), in DD configuration, to the GalA II of the outer core. In P. mirabilis strain 51/57, a gene coding a protein of the Mig-14 family was identified inside the waa cluster, this localization appears to be an exception in the Enterobacteriaceae family. Inspection of the whole genome of P. mirabilis HI4320 did not allow the identification of a mig-14 similar gene. There are three putative PEtN transferases in the genome of P. mirabilis: PMI3040, PMI3576, and PMI3104. The gene identified as eptC (PMI3104) transfers the moiety of PEtN to the O-6 position of L,D-Hep II (HepII6PEtN). The absence of the positive charge due to PEtN residue doesn't affect the bacterial growth kinetics in lab conditions in rich or defined media, but causes a moderate destabilization of the outer-membrane. Despite the lack of the PEtN residue on the Hep II in P. mirabilis LPS core, has no statistically effects during urinary tract infection assays in mouse model, the absence of this modification causes an increase sensitivity to complement in non-immune human sera. / P. mirabilis no es una causa frecuente de infecciones urinarias en el huésped normal, más bien infecta el tracto urinario con alteraciones funcionales o anatómicas, o instrumentación crónica como el cateterismo. P. mirabilis está a menudo asociado con cálculos urinarios e incrustaciones de los catéteres y es, particularmente importante, en pacientes con cateterización prolongada. Las infecciones del tracto urinario asociadas a cateterización son mundialmente reconocidas como la causa más común de infección asociada a tratamientos en ambiente hospitalario. El LPS es un factor de virulencia importante en bacterias Gram negativas patógenas. También conocido como endotoxina, es una molécula glicolipídica que constituye la estructura mayoritaria de la cara externa de la membrana externa (OM). En Proteus mirabilis la mayoría de los genes responsables de la biosíntesis de núcleo de LPS están localizados en el cromosoma, en el agrupamiento génico waa. A pesar de esto, algunos genes adicionales, necesarios para la biosíntesis del núcleo de LPS, se encuentran ubicados fuera del agrupamiento génico waa. El pentasacárido del núcleo interno, común a todas las Enterobacteriáceae, se biosintetiza en P. mirabilis, por la actividad secuencial de una transferasa bifunciona (WaaA) y tres heptosiltransferasas (WaaC, WaaF, y WaaQ). La presencia del disacárido HexN‐1,4‐GalA es característica del núcleo externo de LPS en P. mirabilis. Dependiendo de la naturaleza del residuo de HexN, se encuentran, en el agrupamiento génico waa, dos HexNAc transferasas diferentes: wabH o wabP. El gen eptC (PMI3104) codifica para la enzima que transfiere el residuo de fosfoetanolamina a la posición O-6 de la L,D-Hep II (HepII6PEtN), en el núcleo de LPS de P. mirabilis. La ausencia de la carga positiva del residuo de fosfoetanolamina no afecta a la cinética de crecimiento de las bacterias en condiciones standard de laboratorio sea en medios ricos o definidos. La ausencia del residuo fosfoetanolamina provoca una desestabilización moderada de la membrana externa que se traduce en una disminución de la MIC para SDS.