Els individus infèrtils poden presentar anomalies d'aparellament, sinapsi o recombinació dels cromosomes meiòtics i/o alteracions en la dotació cromosòmica dels espermatozoides resultants. Per aquesta raó, els protocols d'anàlisi de la infertilitat masculina sovint inclouen estudis citogenètics de la meiosi en mostres de teixit testicular i/o estudis d'hibridació in situ fluorescent (FISH) en espermatozoides en mostres de semen. Tot i així, les sèries d'individus publicades mostren una elevada variabilitat probablement deguda: al nombre d'individus analitzats, als criteris d'inclusió d'aquests, a les característiques de la població control, als criteris de valoració de les mostres o a les comparacions estadístiques realitzades. A més a més, les característiques pròpies de les mostres de teixit testicular afegeixen algunes limitacions a aquest estudi; ja sigui perquè la quantitat de mostra sovint és escassa, perquè els individus infèrtils poden presentar aturades en l'espermatogènesi que impliquen una reducció en el nombre de fases avaluables o perquè no es poden identificar els cromosomes implicats en les anomalies. Per tot això, sovint es fa difícil establir les indicacions sota les quals realitzar estudis citogènetics sobre mostres de teixit testicular i/o estudis de FISH en espermatozoides, definir un protocol estandarditzat d'anàlisi i interpretar els resultats obtinguts d'aquests estudis en el context del consell genètic reproductiu del pacient infèrtil. Així doncs, en aquest treball es va plantejar optimitzar un protocol seqüencial d'identificació i anàlisi dels cromosomes meiòtics, combinant tècniques de tinció uniforme i d'hibridació in situ fluorescent Múltiplex (M-FISH), per tal de determinar la incidència d'anomalies cromosòmiques en els espermatòcits a metafase I i a metafase II d'una sèrie d'individus infèrtils. A més a més, també analitzar la proximitat dels bivalents autosòmics al bivalent sexual a metafase I. D'altra banda, es van emprar estudis de FISH en espermatozoides per determinar la incidència d'anomalies cromosòmiques dels cromosomes X, Y, 13, 18 i 21 en els espermatozoides d'una sèrie d'individus infèrtils. En aquest treball també es va analitzar la relació entre les anomalies cromosòmiques observades en els espermatòcits i en els espermatozoides amb el seminograma, el cariotip i l'edat dels individus. Finalment, es va plantejar establir directrius per a la utilització dels estudis meiòtics i dels estudis de FISH en espermatozoides en el context de l'estudi clínic del pacient infèrtil. Per assolir aquests objectius es van analitzar les metafases I i metafases II de 37 mostres de teixit testicular i els espermatozoides de 319 mostres de semen d'individus infèrtils. L'historial clínic del pacient va proporcionar informació del seminograma, del cariotip somàtic, del cariotip meiòtic i de l'edat d'alguns d'aquests pacients. En relació a les mostres de teixit testicular, i a partir de l'estudi dels espermatòcits primaris a l'estadi de metafase I, es va avaluar el nombre de quiasmes dels 23 bivalents per cada pacient, la variabilitat entre individus i la relació entre el recompte de quiasmes i el cariotip i/o el seminograma; a més a més d'analitzar la proximitat dels bivalents al bivalent sexual en aquesta fase. També es va avaluar la morfologia dels cromosomes a l'estadi de metafase II i els resultats obtinguts es van relacionar amb els descrits a metafase I. Pel que fa a les mostres de semen, i a partir de l'anàlisi dels cromosomes X, Y, 13, 18 i 21 mitjançant FISH, es van establir les freqüències de disomies i diploïdies dels espermatozoides d'aquests individus, i es van comparar amb la població control. Les comparacions també es van realitzar en relació al seminograma, al cariotip somàtic i al cariotip meiòtic dels individus. A més a més, es va analitzar la possible correlació entre els increments d'anomalies cromosòmiques dels espermatozoides i els paràmetres de recompte espermàtic, motilitat, morfologia i l'edat del pacient. Els resultats detallats d'ambdós estudis es recullen en la memòria escrita del treball. Analitzant conjuntament els resultats obtinguts en el present estudi i els publicats a la bibliografia, es va concloure que: El 48% dels individus infèrtils presenten un percentatge d'anomalies meiòtiques a l'estadi de metafase I compatible amb el diagnòstic de "meiosi alterada". La reducció del nombre de quiasmes, la presència d'univalents i l'observació de metafases tetraploides són les anomalies més freqüents. El nombre i el tipus d'anomalies són diferents entre les cèl·lules d'un mateix individu suggerint la coexistència de línies cel·lulars de comportament meiòtic normal i línies cel·lulars amb anomalies. La presència de cromàtides separades, la pèrdua de cromàtide i l'observació de metafases aneuploides i diploides, són les anomalies més freqüents a metafase II en individus infèrtils. El 15% dels individus infèrtils presenten increments significatius d'anomalies cromosòmiques en els espermatozoides. L'increment en el nombre d'espermatozoides disòmics pels cromosomes sexuals i/o en el nombre d'espermatozoides diploides són les anomalies més freqüents. La reducció del nombre de quiasmes a metafase I i la separació de les cromàtides germanes a metafase II afecta majoritàriament els bivalents/cromosomes autosòmics de mida mitjana i gran. Ambdues observacions es podrien relacionar amb una recombinació aberrant a primera divisió meiòtica, entesa com una reducció significativa del número de quiasmes i/o la presència de quiasmes pericentromèrics. El cromosomes sexuals i els cromosomes del grup F i G, principalment el cromosoma 21, són els que s'observen amb més freqüència en forma d'univalent, els més implicats en aneuploïdies a metafase II i en anomalies cromosòmiques en espermatozoides. La presència de percentatges significatius d'espermatòcits primaris tetraploides espermatòcits secundaris diploides posa de manifest la competència meiòtica de les línies tetraploides. L'increment significatiu d'espermatozoides diploides observat en pacients infèrtils suggereix la implicació d'anomalies cromosòmiques mitòtiques en la formació de gàmetes diploides. La posició dels bivalents a la placa metafàsica no és aleatòria: els bivalents formats per cromosomes dels grups D i G, i els bivalents 15 i 22 de forma particular, s'observen preferentment propers al bivalent sexual a metafase I. Les anomalies cromosòmiques en espermatòcits primaris i espermatozoides s'associen de forma significativa amb individus oligozoospèrmics i/o pacients amb alteracions del cariotip somàtic, ja sigui amb variants polimòrfiques o anomalies cromosòmiques estructurals. L'increment significatiu d'anomalies cromosòmiques en cèl·lules germinals en individus amb alteracions del cariotip recolza l'existència d'efectes intercromosòmics entre els cromosomes implicats i altres cromosomes del complement. La freqüència d'anomalies cromosòmiques numèriques analitzada en els espermatozoides dels individus infèrtils no mostra correlació amb l'edat. L'estudi meiòtic en biòpsia testicular està indicat en individus amb baix recompte espermàtic i/o alteracions del cariotip. Tenint en compte la informació obtinguda i el cost del procediment, no es recomana la incorporació rutinària de la tècnica de M-FISH en l'àmbit clínic. Es proposa la utilització de protocols citogenètics clàssics adreçats a analitzar la mitjana individual de quiasmes. Diferències significatives entre aquest valor i la freqüència basal s'interpretaran com "meiosi alterada". Un resultat de "meiosi alterada", tot i indicar anomalies en els processos d'aparellament, sinapsi i/o recombinació dels cromosomes, en la majoria de casos no es tradueix amb un increment d'anomalies cromosòmiques en espermatozoides. L'estudi de FISH en espermatozoides està indicat en individus amb un cariotip somàtic normal i baix recompte espermàtic, en individus amb un cariotip somàtic alterat i en individus amb un cariotip meiòtic anormal. L'estudi dels cromosomes 21, X i Y permet identificar la majoria dels pacients amb probabilitat de produir espermatozoides amb anomalies cromosòmiques. Un resultat de FISH en espermatozoides alterat, independentment del valor numèric, s'interpretarà com l'evidència d'anomalies en el procés de l'espermatogènesi i per tant, proporciona informació qualitativa del procés. / Infertile males can be affected by pairing, synaptic or recombination abnormalities in the meiotic chromosomes and/or chromosomal abnormalities in the resulting spermatozoa. For this reason, screening protocols of male infertility often include meiotic cytogenetic studies in testicular biopsies and/or fluorescent in situ hybridization (FISH) studies in spermatozoa from semen samples. However, the series published up to date show high variability in the results reported. This fact could be due to the number of individuals of the series, the inclusion criteria, the characteristics of the control population, the criteria used for sample assessment or even the statistical handling of data. In addition, the intrinsic characteristics of the testicular biopsies add limitations to meiotic studies: the scarce amount of the sample, the reduce number of evaluable phases (meiotic arrest) or the unfeasibility to clearly identify the chromosomes involved in the meiotic anomalies observed. Therefore, it is difficult to establish the indications for meiotic studies in testicular samples and/or FISH studies in spermatozoa. Furthermore, it is difficult to offer standardized protocols of analysis and to interpret the results obtained from these studies in the context of the reproductive genetic counsel to be given to the infertile patients. The first aim of this work was the optimization and the application of a sequential protocol from meiotic chromosome analysis, combining uniform staining techniques and multiplex fluorescent in situ hybridization protocols (M-FISH), addressed to assess the incidence of chromosomal abnormalities in metaphase I and in metaphase II spermatocytes from an infertile male series. The vicinity of the sex chromosomes (XY) to autosomic chromosomes in metaphase I was also analyzed. Furthermore, FISH studies in spermatozoa were used to estimate the incidence of chromosomal abnormalities in chromosomes X, Y, 13, 18 and 21 in a series of infertile individuals. The relationship of the chromosomal abnormalities observed in spermatocytes and spermatozoa with the seminal parameters, the karyotype and the age of the individuals was also studied. Finally, to establish guidelines for an appropriate application of meiotic studies and sperm FISH analyses in the clinical cytogenetic evaluation of the infertile patient was also attempted. To attain these objectives, metaphases I and metaphases II of 37 testicular tissue samples and spermatozoa from 319 semen samples from infertile individuals were analyzed. Clinical records provided us with information of seminal parameters, somatic karyotype, meiotic karyotype and age of some of these patients. Analyses of primary spermatocytes in the metaphase I stage allowed establishing the chiasmata number for every bivalents and patient, the variability among individuals and the relation between chiasmata count and the karyotype and/or the seminal parameters. Moreover, the proximity of the XY bivalent to other chromosome pairs in this phase was evaluated. The morphology of the chromosomes was also analyzed in the metaphase II stage and the results obtained were compared with the ones obtained from metaphase I. Regarding the semen samples, from the FISH analysis of chromosomes X, Y, 13, 18 and 21, the frequencies of disomic and diploid spermatozoa were established, and compared to a control population. The comparisons were also carried out to the seminal parameters, the somatic karyotype and the meiotic karyotype of the individuals. Moreover, the possible correlation between increases of chromosomal abnormalities in spermatozoa and variations in sperm parameters (count, motility and morphology) and the age of the patients were evaluated. Detailed results of the studies undertaken were included in the report of this work. In view of the results obtained in the study it was concluded that: Forty-eight percent of infertile males show a percentage of meiotic abnormalities in metaphase I compatible with the diagnosis of "abnormal meiosis". The reduction in the number of chiasmata, the presence of univalents and the observation of tetraploid metaphases are the most frequent anomalies. The number and the type of anomalies are different among cells in the same individuals, suggesting the coexistence of cell lines with a normal meiotic behavior and cell lines with meiotic abnormalities. The presence of separated chromatids, chromatid loss and the observation of aneuploid and diploid metaphases, are the most frequent anomalies in metaphase II in infertile individuals. Fifteen percent of infertile males show significant increases of chromosomal abnormalities in spermatozoa. The most frequent anomalies are the increase of spermatozoa disomic for the sex chromosomes and/or the number of diploid spermatozoa. The reduction in the number of chiasmata in metaphase I and the separation of the sister chromatids in metaphase II affects mostly autosomal chromosomes of medium and large size. Both observations could correlate with aberrant recombination in the first meiotic division, knowledgeable as a significant reduction in the number of chiasmata and/or the presence of pericentromeric chiasmata. The sex chromosomes and the chromosomes of group F and G, mainly chromosome 21, are those observed with more frequency in univalent form, the ones more involved in aneuploidies in metaphase II and in chromosomal abnormalities in spermatozoa. The presence of significant percentages of tetraploid primary spermatocytes and diploid secondary spermatocytes evidences the meiotic competence of tetraploid lines. The significant increase of diploid spermatozoa observed in infertile patients suggests the implication of mitotic chromosomal anomalies in the formation of diploid gametes. The position of the bivalents in the metaphase I plate is not random: bivalents corresponding to chromosomes of groups D and G, and bivalents 15 and 22 in particular, are preferably observed in the vicinity of the XY bivalent. Chromosomal abnormalities in primary spermatocytes and in spermatozoa are significantly associated with oligozoospermic individuals and/or patients with alterations of the somatic karyotype (polymorphic variants or structural chromosomal anomalies). The significant increase of chromosomal abnormalities in individuals with alterations of the karyotype supports the existence of interchromosomal effects between the implied chromosomes and other chromosomes of the complement. The frequency of numeric chromosomal anomalies analyzed in spermatozoa of infertile males does not show any correlation with the age of the patients. Meiotic studies in testicular biopsy are indicated in individuals with low sperm counts and/or alterations of the karyotype. Taking into consideration the information obtained and the cost of the procedure, the routinely use of the M-FISH technique in the meiotic clinical analysis is not recommended. The use of classical cytogenetic protocols addressed to analyze the individual average of chiasmata is proposed. Significant differences between this value and the basal frequency will be interpreted as "abnormal meiosis". A result of "abnormal meiosis", although being indicative of pairing, synapsis and/or recombination anomalies, in the majority of cases does not lead to increases in sperm chromosome abnormalities. FISH studies in spermatozoa are indicated in individuals with a normal somatic karyotype and low sperm counts, in individuals with an abnormal somatic karyotype and in individuals with an abnormal meiotic karyotype. The study of chromosomes 21, X and Y allows the identification of the majority of the patients with probability of producing spermatozoa with chromosomal abnormalities. An abnormal result of the sperm FISH study, independently of the numerical value, will be interpreted as evidence of anomalies in the spermatogenesis and therefore, provides qualitative information of the process.

La infertilitat és una malaltia que afecta a un 15% de les parelles en edat reproductiva. En la meitat dels casos, el problema té un origen masculí. Però, tot i els avenços existents en la fisiologia de la reproducció, encara hi han un 10% de parelles amb una infertilitat d'origen desconegut. Així, aprofitant les noves tecnologies existents tal com la proteòmica (gels 2D, anàlisis per MS/MS, etc.) es va decidir realitzar un estudi de l'espermatozoide humà per tal d'aprofundir en el coneixement de les proteïnes implicades en la fertilització. Primer, es va realitzar un estudi per descriure part del proteoma de l'espermatozoide humà. Es van descriure 98 proteïnes, localitzant-les en un mapa 2D. Un 22% d'aquestes proteïnes es van descriure per primera vegada com a presents en l'espermatozoide humà. D'un 11% no se'n coneix la funció, mentre que un 23% tenen una funció relacionada amb la transcripció, la síntesi proteica o l'intercanvi proteic. Aquesta dada és sorprenent ja que, fins fa poc, es creia que l'únic objectiu de l'espermatozoide era portar el material genètic masculí fins l'oòcit femení. La resta de proteïnes tenen una funció que s'engloba dintre d'aquestes categories: 23% relacionades amb la producció d'energia; 11% relacionades amb el cicle cel·lular, l'apoptosis i l'estrès oxidatiu; 10% relacionades amb el citoesquelet, el flagel i el moviment cel·lular; 9% relacionades amb la transducció de senyal; 7% relacionades amb el reconeixement cel·lular; i, per últim, un 6% té una funció relacionada amb el metabolisme. D'aquestes 98 proteïnes (amb 3 proteïnes noves d'un altre estudi realitzat al laboratori), es va fer un estudi comparant la seva abundància relativa entre pacients astenozoospèrmics i controls (donants de semen). D'aquesta comparació, es van trobar 17 proteïnes amb una abundància relativa diferent entre pacients i donants. Aquestes proteïnes són ACTB, ANXA5, COX6B, H2A, PIP i el seu precursor,i dos punts corresponents a S100A9; totes aquestes es troben disminuïdes en els pacients. La resta de proteïnes son la forma precursora de CLU, DLD, FH, SEMG1, a més d'HSPA2, IMPA1, PSMB3, TEX12 i un punt que conté dos proteïnes: MPST i la forma precursora d'ECH1. Totes aquestes proteïnes es troben augmentades en pacients. La majoria d'aquestes proteïnes es poden agrupar en tres grans grups: proteïnes relacionades amb la producció d'energia (COX6B, DLDpre, FHpre i ECH1pre), amb l'estructura i el moviment (ACTB, PIP i PIPpre, H2A i SEMG1), i senyalització cel·lular i regulació ( ANXA5, S100A9 i IMPA1). A més, es va realitzar un estudi paral·lel estudiant les mateixes 101 proteïnes, però amb pacients normozoospèrmics (sense cap causa aparent d'infertilitat) i donants de semen de fertilitat probada. Donat el caràcter tan exclusiu de les mostres, nomès es van poder comparar sis pacients versus 5 donants. Tot i això, es van trobar dos proteïnes amb diferències a la seva abundància relativa. Aquestes proteïnes són la PDIA3 i la TEX12. Aquestes dades, però, no es poden considerar com a definitives, ja que el valor obtingut per a aquestes mostres de p (p<0.001) ens indica que un de cada 100 resultats pot ser degut a l'atzar. Així, una d'aquestes proteïnes pot ser un fals possitiu.Amb aquests valors quantitatius, es va realitzar una agrupació no dirigida per tal de veure si aquestes proteïnes ens agrupaven les mostres segons el seu fenotip. Per a la comparació "astenozoospèrmics vs donants", l'agrupació va ser possitiva; en una branca de l'arbre resultant, teníem tots els pacients i, a l'altra, tots els donants.Per últim, es va posar a punt la metodologia DIGE en mostres d'espermatozoides humans. Tot i que es necessitaran més dades per a acabar d'ajustar el procediment, els primers resultats són encoratjadors. / Infertility is a disease that affects 15% of couples at reproductive age. In about a half, the problem has a male origin. Conventional 1-DE has in the past provided a wealth of information concerning the major sperm proteins. However, so far there are relatively few reports exploiting the potential of the present proteomic tools to identify and to study additional yet-unidentified important proteins present in human spermatozoa. In this work, 2-DE of proteins from spermatozoa led to the identification of 98 different proteins. The function of these proteins turned out to be energy production (23%), transcription, protein synthesis, transport, folding and turnover (23%), cell cycle, apoptosis and oxidative stress (10%), signal transduction (8%), cytoskeleton, flagella and cell movement (10%), cell recognition (7%), metabolism (6%) and unknown function (11%). As many as 23% of the proteins identified have not been previously described as being expressed in human spermatozoa. Also, asthenozoospermia is one of the most common findings present in infertile males, but its aetiology remains unknown in most cases. Present proteomic tools now offer the opportunity to identify proteins which are differentially expressed in asthenozoospermic semen samples and potentially involved in infertility. In this work, we compared the expression of 101 sperm protein spots in 20 asthenozoospermic samples to that of 10 semen donor controls using two-dimensional proteomic analysis. This results in seventeen protein spots, that have been identified at different amounts in the asthenozoospermic samples compared with controls. These are cytoskeletal actin-B, annexin-A5, cytochrome C oxidase-6B, histone H2A, prolactin-inducible protein and precursor, calcium binding protein-S100A9 (2 spots), clusterin precursor, dihydrolipoamide dehydrogenase precursor, fumarate hydratase precursor, heat shock protein-HSPA2, inositol-1 monophosphatase, 3-mercapto-pyruvate sulfurtransferase/dienoyl-CoA isomerase precursor, proteasome subunit-PSMB3, semenogelin 1 precursor and testis expressed sequence 12. The detected amount of these proteins enabled the grouping of asthenozoospermic sperm samples in an unsupervised clustering analysis. So, in conclusion, we have identified several proteins present at different amount in asthenozoospermic sperm samples. These proteins could be candidates towards the development of diagnostic markers, and open up the opportunity to gain further insight into the pathogenic mechanisms involved in asthenozoospermia.

The knowledge of the proteins that are present in the spermatozoa is an essential step towards the comprehension of their normal function and their potential alterations associated to infertility. Although many studies have been performed in human male infertility, many of the causes still remain unknown, partly due to the fact that the proteins and the mechanisms involved in spermiogenesis and in sperm function are not known in detail. Therefore, the proteomic study of the human spermatozoa through mass spectrometry is relevant both, towards improving our fundamental knowledge and the mechanisms involved in the normal sperm physiology, as well as towards a better understanding of the male infertility. This doctoral thesis has contributed to the identification of the human sperm proteome through two-dimensional gels and mass spectrometry. Moreover, it has identified new correlations between the abundance of certain proteins and the seminal parameters related to male infertility such as the protamine content, DNA damage and sperm motility giving rise to the identification of potential diagnostic markers. In addition, the potential correlations between the protamine content and the presence of the protamine 2 precursors in the sperm cell from patients and the assisted reproductive outcomes have also been studied. Another point studied in the present thesis has been the determination, through immunofluorescent techniques, of the presence of nucleosomes and other proteins with a potential epigenetic function present in spermatozoon fractions selected through density gradients. Moreover, a protocol for the isolation of human sperm nuclei has been implemented to further identify, through mass spectrometry, minor nuclear proteins that may be important for normal sperm functioning or the embryo development.KEYWORDS: Spermatozoon, Protamines, Proteome, Male infertility, Epigenetics / El coneixement de les proteïnes que formen part de l'espermatozoide és un aspecte clau per comprendre el seu funcionament normal i les seves possibles alteracions associades a la infertilitat. Tot i la gran quantitat d'estudis sobre la infertilitat humana masculina, moltes de les seves causes es troben encara desconegudes degut, en part, a que les proteïnes i els mecanismes implicats en l'espermatogènesi i la funció de la cèl·lula espermàtica no es coneixen en detall. Per tant, l'estudi proteòmic de l'espermatozoide humà a través de l'espectrometria de masses és rellevant tant pel coneixement d'aspectes fonamentals com pel millor enteniment de la infertilitat masculina. Aquesta tesi doctoral ha contribuït a la identificació del proteoma de l'espermatozoide humà a través de gels bidimensionals i espectrometria de masses. Addicionalment s'han identificat relacions entre la abundància de certes proteïnes i paràmetres seminals relacionats amb la infertilitat masculina tals com el contingut de protamines, el dany al DNA o la motilitat dels espermatozoides donant lloc a la identificació de potencials marcadors diagnòstics. A més, s'han buscat les possibles correlacions entre el contingut de protamines i la presència de precursor de protamina 2 als espermatozoides de pacients amb els resultats de reproducció assistida. Un altre aspecte tractat ha estat la determinació, mitjançant tècniques immunofluorescents, de la presència de nucleosomes i altres proteïnes presents a fraccions d'espermatozoides seleccionades a través de gradients de densitat amb una funció potencial epigenètica. A més, s'ha implementat un protocol per aïllar nuclis d'espermatozoides humans per tal de poder identificar a través d'espectrometria de masses proteïnes nuclears minoritàries possiblement importants pel desenvolupament embrionari i el funcionament de l'espermatozoide no patològic. / RESUMEN EN CASTELLANO:El conocimiento de las proteínas que forman parte del espermatozoide es un aspecto clave para la comprensión de su funcionamiento normal i de sus posibles alteraciones asociadas a la infertilidad. A pesar de la gran cantidad de estudios sobre la infertilidad humana masculina, muchas de sus causas se encuentran aún desconocidas. Esto es debido, en parte, a que las proteínas y los mecanismos implicados en la espermatogénesis i la función de la célula espermática no se conocen en detalle. Por lo tanto, el estudio proteómico del espermatozoide humano a través de la espectrometría de masas es relevante tanto para el conocimiento de aspectos fundamentales como para el mejor entendimiento de la infertilidad masculina. Esta tesis doctoral ha contribuido en la identificación del proteoma del espermatozoide humano a través de geles bidimensionales i espectrometría de masas. Adicionalmente se han identificado relaciones entre la abundancia de ciertas proteínas i parámetros seminales relacionados con la infertilidad masculina tales como el contenido de protaminas, el daño en el DNA o la movilidad de los espermatozoides dando lugar a la identificación de potenciales marcadores diagnósticos. Además, se han buscado posibles correlaciones entre el contenido de protaminas i la presencia de precursor de protamina 2 en los espermatozoides de pacientes con los resultados de reproducción asistida. Otro aspecto tratado ha sido la determinación, mediante técnicas inmunofluorescentes, de la presencia de nucleosomas i otras proteínas presentes en fracciones de espermatozoides seleccionadas a través de gradientes de densidad con una función potencial epigenética. Además, se ha implementado un protocolo de aislamiento de núcleos de espermatozoides humanos con el objetivo de poder identificar a través de espectrometría de masas proteínas nucleares minoritarias posiblemente importantes para el desarrollo embrionario i el funcionamiento del espermatozoide no patológico. PALABRAS CLAVE: Espermatozoide, Protaminas, Proteoma, Infertilidad masculina, Epigenética