Apesar da ampla demonstração do potencial tóxico do benzeno ao sistema imune, os mecanismos envolvidos nos seus diferentes efeitos não estão totalmente esclarecidos. Desta forma, o presente trabalho avaliou a mobilização e função de leucócitos polimorfonucleares (PMN) na vigência de resposta inflamatória aguda em ratos expostos a metabólitos do benzeno. Ratos Wistar, machos foram tratados por período de tempo prolongado (50 mg/kg; i. p.; 1 uma vez ao dia, 13 ou 16 doses diárias com intervalos de 2 dias a cada 5 doses) com hidroquinona (HQ), fenol (FE) ou veículo. As respostas inflamatória inata ou adquirida foram induzidas 24 hs após a última dose dos tratamentos. Para avaliar a intensidade de intoxicação, um método analítico foi padronizado para a extração de HQ e FE da urina dos animais por microextração em fase sólida, para subseqüente análise por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa. Os dados da validação mostraram que a técnica analítica é adequada, e a análise das amostras demonstrou o aumento na concentração urinária de HQ, FE e catecol (CAT) em urina dos ratos expostos, confirmando assim a exposição ao FE ou a HQ. A avaliação da resposta inflamatória inata demonstrou que o tratamento com HQ acarretou aumento acentuado no influxo de PMN para a cavidade inflamada. A análise do leucograma mostrou que o tratamento com HQ promoveu neutrofilia, que pode ser decorrente da mobilização destas células da medula, uma vez que número menor de células segmentadas na última etapa de maturação foi encontrado nestes animais. No entanto, durante a vigência de resposta inflamatória, a neutrofilia esperada para este processo não foi detectada nestes animais. Espécies reativas de nitrogênio podem participar dos efeitos aqui detectados em animais tratados com HQ, já que valores aumentados de óxido nítrico (NO) foram mensurados no sangue após o tratamento e no exsudato inflamatório. Diferentemente da exposição à HQ, a administração de FE não alterou a migração de PMN para o foco de lesão na vigência de reposta inflamatória aguda inata. Apesar do tratamento com FE ter acarretado linfocitopenia, a produção das células brancas no compartimento medular e a leucocitose em resposta ao processo inflamatório foram equivalentes ao encontrado em animais controles. No que concerne à resposta inflamatória alérgica, ambos os tratamentos inibiram o influxo de leucócitos para o lavado bronco-alveolar (LBA) e para o tecido pulmonar. A investigação dos mecanismos envolvidos que a exposição à HQ interfere com a síntese de imunoglobulina E e, eventualmente, com a desgranulação de mastócitos. Por outro lado, a exposição ao PHE não alterou estes parâmetros. Em conjunto, os dados aqui apresentados sugerem que os tratamentos com HQ ou FE provocam efeitos distintos na gênese de respostas inflamatórias de diferentes origens quanto à migração leucocitária, e que os mecanismos envolvidos com a imunotoxicidade induzida pelo benzeno é altamente complexa. / Despite toxicity of benzene has been fully demonstrated, the mechanisms involved on its immunotoxicity are not fully comprehended. Then, the present work studied the mobilization and functions of polymorphonuclear cells (PMN) during acute inflammatory reactions in rats exposed to benzene metabolites. Male Wistar rats were treated with hydroquinone (HQ) or phenol (Phe) for prolonged period of time (50 mg/Kg; i.p.; once a day, 13 or 16 doses, 2 days intervals after each 5 doses). Innate or acquired inflammatory reactions were carried out 24 hours after the last dose of treatments. Animals treated with vehicle were employed as control. In order to determine the intensity of intoxications, an extraction method was developed in urine using a solid phase micro-extraction fiber. The subsequent analysis was performed on gas chromatography coupled to mass spectrometry. Data from validation showed the adequacy of methodology and demonstrated the presence of HQ, PHE and CAT in urine from exposed rats, corroborating the exposition to PHE or HQ. The evaluation of innate inflammatory reaction showed that HQ exposition promoted increment on the number of PMN cells to inflamed area. The leucogram demonstrated that treatment evoked neutrophilia, probably due to mobilizations of segmented cells in the last phase of maturation from bone marrow. However, during the inflammatory process, the characteristic neutrophilia was not detected. Nitrogen reactive species may participate of the intoxication, since elevated values of nitric oxide (NO) were found in blood after intoxication and in inflammatory exudates. Differentially from HQ exposition, administrations of PHE did not alter the migration of PMN into inflammatory focus. Despite the treatment promoted reductions on number of lymphocytes, the production of white cells on bone marrow and the neutrophilia during and inflammatory process were equivalent to those found in control animals. Regarding acquired inflammation, both treatments significantly inhibited the influx of leukocytes to bronchoalveolar fluid. This pattern of response did not reflect the accumulation of PMN cells on pulmonary tissue, since the myeloperoxidase activity was not higher when compared to control rats. The investigations of the mechanisms involved in the inhibited leukocyte recruitment, showed that HQ treatment probably impairs the immunoglobulin E synthesis and mast cell degranulation. On the other hand, FE exposition did not present these effects. Together, data herein suggest that HQ or PHE treatments promete singular effects on PMN recruitment during inflammatory reactions elicited by different agents, and the complexity of mechanisms responsible for the immunotoxicity induced by benzene.

Apesar da ampla demonstração do potencial tóxico do benzeno ao sistema imune, os mecanismos envolvidos nos seus diferentes efeitos não estão totalmente esclarecidos. Desta forma, o presente trabalho avaliou a mobilização e função de leucócitos polimorfonucleares (PMN) na vigência de resposta inflamatória aguda em ratos expostos a metabólitos do benzeno. Ratos Wistar, machos foram tratados por período de tempo prolongado (50 mg/kg; i. p.; 1 uma vez ao dia, 13 ou 16 doses diárias com intervalos de 2 dias a cada 5 doses) com hidroquinona (HQ), fenol (FE) ou veículo. As respostas inflamatória inata ou adquirida foram induzidas 24 hs após a última dose dos tratamentos. Para avaliar a intensidade de intoxicação, um método analítico foi padronizado para a extração de HQ e FE da urina dos animais por microextração em fase sólida, para subseqüente análise por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa. Os dados da validação mostraram que a técnica analítica é adequada, e a análise das amostras demonstrou o aumento na concentração urinária de HQ, FE e catecol (CAT) em urina dos ratos expostos, confirmando assim a exposição ao FE ou a HQ. A avaliação da resposta inflamatória inata demonstrou que o tratamento com HQ acarretou aumento acentuado no influxo de PMN para a cavidade inflamada. A análise do leucograma mostrou que o tratamento com HQ promoveu neutrofilia, que pode ser decorrente da mobilização destas células da medula, uma vez que número menor de células segmentadas na última etapa de maturação foi encontrado nestes animais. No entanto, durante a vigência de resposta inflamatória, a neutrofilia esperada para este processo não foi detectada nestes animais. Espécies reativas de nitrogênio podem participar dos efeitos aqui detectados em animais tratados com HQ, já que valores aumentados de óxido nítrico (NO) foram mensurados no sangue após o tratamento e no exsudato inflamatório. Diferentemente da exposição à HQ, a administração de FE não alterou a migração de PMN para o foco de lesão na vigência de reposta inflamatória aguda inata. Apesar do tratamento com FE ter acarretado linfocitopenia, a produção das células brancas no compartimento medular e a leucocitose em resposta ao processo inflamatório foram equivalentes ao encontrado em animais controles. No que concerne à resposta inflamatória alérgica, ambos os tratamentos inibiram o influxo de leucócitos para o lavado bronco-alveolar (LBA) e para o tecido pulmonar. A investigação dos mecanismos envolvidos que a exposição à HQ interfere com a síntese de imunoglobulina E e, eventualmente, com a desgranulação de mastócitos. Por outro lado, a exposição ao PHE não alterou estes parâmetros. Em conjunto, os dados aqui apresentados sugerem que os tratamentos com HQ ou FE provocam efeitos distintos na gênese de respostas inflamatórias de diferentes origens quanto à migração leucocitária, e que os mecanismos envolvidos com a imunotoxicidade induzida pelo benzeno é altamente complexa. / Despite toxicity of benzene has been fully demonstrated, the mechanisms involved on its immunotoxicity are not fully comprehended. Then, the present work studied the mobilization and functions of polymorphonuclear cells (PMN) during acute inflammatory reactions in rats exposed to benzene metabolites. Male Wistar rats were treated with hydroquinone (HQ) or phenol (Phe) for prolonged period of time (50 mg/Kg; i.p.; once a day, 13 or 16 doses, 2 days intervals after each 5 doses). Innate or acquired inflammatory reactions were carried out 24 hours after the last dose of treatments. Animals treated with vehicle were employed as control. In order to determine the intensity of intoxications, an extraction method was developed in urine using a solid phase micro-extraction fiber. The subsequent analysis was performed on gas chromatography coupled to mass spectrometry. Data from validation showed the adequacy of methodology and demonstrated the presence of HQ, PHE and CAT in urine from exposed rats, corroborating the exposition to PHE or HQ. The evaluation of innate inflammatory reaction showed that HQ exposition promoted increment on the number of PMN cells to inflamed area. The leucogram demonstrated that treatment evoked neutrophilia, probably due to mobilizations of segmented cells in the last phase of maturation from bone marrow. However, during the inflammatory process, the characteristic neutrophilia was not detected. Nitrogen reactive species may participate of the intoxication, since elevated values of nitric oxide (NO) were found in blood after intoxication and in inflammatory exudates. Differentially from HQ exposition, administrations of PHE did not alter the migration of PMN into inflammatory focus. Despite the treatment promoted reductions on number of lymphocytes, the production of white cells on bone marrow and the neutrophilia during and inflammatory process were equivalent to those found in control animals. Regarding acquired inflammation, both treatments significantly inhibited the influx of leukocytes to bronchoalveolar fluid. This pattern of response did not reflect the accumulation of PMN cells on pulmonary tissue, since the myeloperoxidase activity was not higher when compared to control rats. The investigations of the mechanisms involved in the inhibited leukocyte recruitment, showed that HQ treatment probably impairs the immunoglobulin E synthesis and mast cell degranulation. On the other hand, FE exposition did not present these effects. Together, data herein suggest that HQ or PHE treatments promete singular effects on PMN recruitment during inflammatory reactions elicited by different agents, and the complexity of mechanisms responsible for the immunotoxicity induced by benzene.

LOPAP (Lonomia obliqua prothrombin activator protease) é uma serino protease isolada das cerdas da Lagarta Lonomia obliqua que induz efeitos sobre a coagulação sanguínea, semelhantes ao extrato de cerdas bruto. Recentemente, foi obtido um peptídeo do LOPAP, P4, que parece possuir efeitos similares à proteína. No sentido de complementar os dados sobre estas toxinas, este estudo investigou os efeitos do LOPAP ou do P4 sobre interações leucócito-endotélio in vivo; expressão de moléculas de adesão, síntese de mediadores inflamatórios, apoptose e necrose de leucócitos e célula endotelial, além de suas possíveis ações sobre a formação de novos vasos. Aplicação tópica de 30µg/mL ou 300µg/mL (10µL) de LOPAP ou de P4 na rede microvascular do mesentério de ratos Wistar machos não alterou o diâmetro de vênulas pós-capilares, as interações dos leucócitos ao endotélio, nem a reatividade microvascular frente à acetilcolina ou noradrenalina. Somente a concentração de 1000µg/mL aumentou o número de leucócitos aderidos à parede vascular, simultaneamente a estases intermitentes nos vasos da microcirculação. Ensaios de citometria de fluxo mostraram que a incubação de LOPAP ou P4 (300µg/mL) não modificou a expressão de L-selectina e β2-integrina em neutrófilos circulantes obtidos de ratos Wistar. Por outro lado, incubações do LOPAP ou do P4 com célula endotelial (cultura primária obtida do músculo cremaster de ratos Wistar; 300µg/mL) induziram a expressão da molécula ICAM-1 , e somente o P4 promoveu a expressão de VCAM-1. Diferentemente, nenhuma das toxinas alterou a expressão de PECAM-1. Ensaios imuinoenzimáticos realizados em sobrenadantes de neutrófilos e de célula endotelial incubadas com LOPAP ou P4 (300µg/mL) mostraram que as toxinas não alteraram a secreção de interleucina-6 (IL-6), interleucina-10 (IL-10), fator de necrose tumoral-α (TNF-α) por neutrófilos; as toxinas não induziram a secreção de TNF-α pela célula endotelial, mas aumentaram a secreção de IL-6 e IL-10. A concentração de óxido nítrico (NO), quantificado pela reação de Griess, estava aumentada nos sobrenadantes dos dois tipos celulares incubados com LOPAP ou P4. A incubação de LOPAP ou P4 com neutrófilos ou célula endotelial não alterou a viabilidade celular, mas preveniu a apoptose da célula endotelial ou neutrófilo provocada pela carência de soro bovino fetal. A incubação simultânea com L-NAME (1 mM) reduziu a proteção conferida pelo LOPAP ou pelo P4. A investigação dos efeitos das toxinas sobre a formação da rede microcirculatória foi realizada em camundongos Swiss, machos, utilizando o modelo da câmara dorsal por microscopia intravital. A aplicação tópica do LOPAP ou P4 (30µg/mL, 300µg/mL; 10µL; 3 doses a cada 96 horas) no leito microvascular dorsal reduziu significantemente o número de vasos na rede microcirculatória em condições basais. Adicionalmente, o tratamento com P4 inibiu a formação de novos vasos provocada pela aplicação tópica de suplemento de fatores de crescimento vascular. O tratamento de célula endotelial de microcirculação de camundongos imortalizadas (tENd) com LOPAP ou P4 (300µg/mL) reduziu a capacidade de migração destas células. Em conjunto, os dados obtidos até o momento mostram que o LOPAP e o P4 não induziram as interações leucócito-endotélio in vivo e que a secreção de mediadores por neutrófilos e célula endotelial, como o NO, podem estar envolvidos com suas atividades anti-apoptótica. Ademais, o LOPAP e o P4 inibem o crescimento de novos vasos, e um dos possíveis mecanismos pode ser a interferência nos mecanismos de migração da célula endotelial. / LOPAP (Lonomia obliqua prothrombin activator protease) is a serine protease isolated from the crude extract of Lonomia obliqua caterpillar, which induces effects on blood coagulation comparable to the extract. Recently it was obtained a peptide fragment from LOPAP, P4, with similar activities with the protein. This study aimed to complete data about these toxins, LOPAP and P4, on in vivo leukocyte-endothelial interactions; adhesion molecule expressions, synthesis of inflammatory mediators, necrosis and apoptosis of neutrophils and endothelial cells, besides possible actions on angiogenesis. Topical applications of 30μg/mL or 300µg/mL (10µL) of LOPAP or P4 on microvascular network of mesentery of Male Wistar rats did not affect the diameter of postcapillary venules, leukocyte-endothelial interactions, either vascular reactivity to acetylcholine or norepinephrine. Only topical application of 1000µg/mL (10 µL) promoted increment on the number of leukocytes adhered to vessel wall, simultaneously to intermittent blood stasis in the microvascular network. Flow cytometry assays showed that incubations with LOPAP or P4 (300µg/mL) did not modify the expression of L-selectin or β2-integrin in neutrophils from Male Wistar rats. On the other hand, incubations of LOPAP or P4 with primary cultured endothelial cells evoked expressions of ICAM-1, and only incubation with P4 promoted expression of VCAM-1. Differently, the treatments did not affect PECAM-1 expression in endothelial cells. Immunoenzimatic assays carried out in supernatants of neutrophils and endothelial cells incubated with LOPAP or P4 (300µg/mL) showed that both toxins did not alter the basal secretion of interleukin-6 (IL-6), interleukin-10 (IL-10), tumor necrosis factor-α (TNF-α) by neutrophils; both toxins did not promote secretion of TNF-α by endothelial cells, however they enhanced the secretion of IL-6 and IL-10. Concentrations of nitric oxide (NO), quantified by Griess reaction, were enhanced in the supernatant of neutrophils or endothelial cells incubated with LOPAP or P4. LOPAP or P4 treatments did not alter the viability of neutrophils or endothelial cells, but prevented the apoptosis of both type cell caused by fetal bovine serum deprivation. Simultaneous incubation with L-NAME (1 mM) and LOPAP or P4 reduced the protection on apoptosis exerted by the toxins. The action of toxins on formation of microcirculatory network was investigated in Male Swiss mice. Topical application of LOPAP or P4 (30µg/mL, 300µg/mL; 10µL; 3 times each 96 hours) in the microvascular network significantly reduced the number of vessels in basal conditions. Additionally, treatment with P4 inhibited the new vessel formation provoked by topical application of vascular growth factor supplement. Immortalized endothelial cells of mice (tEnd) incubated with toxins presented lower migration than cells incubated with saline. Together, data herein obtained showed that LOPAP and P4 did not evoke in vivo leukocyte-endothelial interactions and secretions of chemical mediators by neutrophils and endothelial cells, as NO, seem to be related to anti-apoptotic activities. Additionally LOPAP or P4 inhibit the microcirculatory network formation, by interfering, at least in part, by altering the migration of endothelial cells.

LOPAP (Lonomia obliqua prothrombin activator protease) é uma serino protease isolada das cerdas da Lagarta Lonomia obliqua que induz efeitos sobre a coagulação sanguínea, semelhantes ao extrato de cerdas bruto. Recentemente, foi obtido um peptídeo do LOPAP, P4, que parece possuir efeitos similares à proteína. No sentido de complementar os dados sobre estas toxinas, este estudo investigou os efeitos do LOPAP ou do P4 sobre interações leucócito-endotélio in vivo; expressão de moléculas de adesão, síntese de mediadores inflamatórios, apoptose e necrose de leucócitos e célula endotelial, além de suas possíveis ações sobre a formação de novos vasos. Aplicação tópica de 30µg/mL ou 300µg/mL (10µL) de LOPAP ou de P4 na rede microvascular do mesentério de ratos Wistar machos não alterou o diâmetro de vênulas pós-capilares, as interações dos leucócitos ao endotélio, nem a reatividade microvascular frente à acetilcolina ou noradrenalina. Somente a concentração de 1000µg/mL aumentou o número de leucócitos aderidos à parede vascular, simultaneamente a estases intermitentes nos vasos da microcirculação. Ensaios de citometria de fluxo mostraram que a incubação de LOPAP ou P4 (300µg/mL) não modificou a expressão de L-selectina e β2-integrina em neutrófilos circulantes obtidos de ratos Wistar. Por outro lado, incubações do LOPAP ou do P4 com célula endotelial (cultura primária obtida do músculo cremaster de ratos Wistar; 300µg/mL) induziram a expressão da molécula ICAM-1 , e somente o P4 promoveu a expressão de VCAM-1. Diferentemente, nenhuma das toxinas alterou a expressão de PECAM-1. Ensaios imuinoenzimáticos realizados em sobrenadantes de neutrófilos e de célula endotelial incubadas com LOPAP ou P4 (300µg/mL) mostraram que as toxinas não alteraram a secreção de interleucina-6 (IL-6), interleucina-10 (IL-10), fator de necrose tumoral-α (TNF-α) por neutrófilos; as toxinas não induziram a secreção de TNF-α pela célula endotelial, mas aumentaram a secreção de IL-6 e IL-10. A concentração de óxido nítrico (NO), quantificado pela reação de Griess, estava aumentada nos sobrenadantes dos dois tipos celulares incubados com LOPAP ou P4. A incubação de LOPAP ou P4 com neutrófilos ou célula endotelial não alterou a viabilidade celular, mas preveniu a apoptose da célula endotelial ou neutrófilo provocada pela carência de soro bovino fetal. A incubação simultânea com L-NAME (1 mM) reduziu a proteção conferida pelo LOPAP ou pelo P4. A investigação dos efeitos das toxinas sobre a formação da rede microcirculatória foi realizada em camundongos Swiss, machos, utilizando o modelo da câmara dorsal por microscopia intravital. A aplicação tópica do LOPAP ou P4 (30µg/mL, 300µg/mL; 10µL; 3 doses a cada 96 horas) no leito microvascular dorsal reduziu significantemente o número de vasos na rede microcirculatória em condições basais. Adicionalmente, o tratamento com P4 inibiu a formação de novos vasos provocada pela aplicação tópica de suplemento de fatores de crescimento vascular. O tratamento de célula endotelial de microcirculação de camundongos imortalizadas (tENd) com LOPAP ou P4 (300µg/mL) reduziu a capacidade de migração destas células. Em conjunto, os dados obtidos até o momento mostram que o LOPAP e o P4 não induziram as interações leucócito-endotélio in vivo e que a secreção de mediadores por neutrófilos e célula endotelial, como o NO, podem estar envolvidos com suas atividades anti-apoptótica. Ademais, o LOPAP e o P4 inibem o crescimento de novos vasos, e um dos possíveis mecanismos pode ser a interferência nos mecanismos de migração da célula endotelial. / LOPAP (Lonomia obliqua prothrombin activator protease) is a serine protease isolated from the crude extract of Lonomia obliqua caterpillar, which induces effects on blood coagulation comparable to the extract. Recently it was obtained a peptide fragment from LOPAP, P4, with similar activities with the protein. This study aimed to complete data about these toxins, LOPAP and P4, on in vivo leukocyte-endothelial interactions; adhesion molecule expressions, synthesis of inflammatory mediators, necrosis and apoptosis of neutrophils and endothelial cells, besides possible actions on angiogenesis. Topical applications of 30μg/mL or 300µg/mL (10µL) of LOPAP or P4 on microvascular network of mesentery of Male Wistar rats did not affect the diameter of postcapillary venules, leukocyte-endothelial interactions, either vascular reactivity to acetylcholine or norepinephrine. Only topical application of 1000µg/mL (10 µL) promoted increment on the number of leukocytes adhered to vessel wall, simultaneously to intermittent blood stasis in the microvascular network. Flow cytometry assays showed that incubations with LOPAP or P4 (300µg/mL) did not modify the expression of L-selectin or β2-integrin in neutrophils from Male Wistar rats. On the other hand, incubations of LOPAP or P4 with primary cultured endothelial cells evoked expressions of ICAM-1, and only incubation with P4 promoted expression of VCAM-1. Differently, the treatments did not affect PECAM-1 expression in endothelial cells. Immunoenzimatic assays carried out in supernatants of neutrophils and endothelial cells incubated with LOPAP or P4 (300µg/mL) showed that both toxins did not alter the basal secretion of interleukin-6 (IL-6), interleukin-10 (IL-10), tumor necrosis factor-α (TNF-α) by neutrophils; both toxins did not promote secretion of TNF-α by endothelial cells, however they enhanced the secretion of IL-6 and IL-10. Concentrations of nitric oxide (NO), quantified by Griess reaction, were enhanced in the supernatant of neutrophils or endothelial cells incubated with LOPAP or P4. LOPAP or P4 treatments did not alter the viability of neutrophils or endothelial cells, but prevented the apoptosis of both type cell caused by fetal bovine serum deprivation. Simultaneous incubation with L-NAME (1 mM) and LOPAP or P4 reduced the protection on apoptosis exerted by the toxins. The action of toxins on formation of microcirculatory network was investigated in Male Swiss mice. Topical application of LOPAP or P4 (30µg/mL, 300µg/mL; 10µL; 3 times each 96 hours) in the microvascular network significantly reduced the number of vessels in basal conditions. Additionally, treatment with P4 inhibited the new vessel formation provoked by topical application of vascular growth factor supplement. Immortalized endothelial cells of mice (tEnd) incubated with toxins presented lower migration than cells incubated with saline. Together, data herein obtained showed that LOPAP and P4 did not evoke in vivo leukocyte-endothelial interactions and secretions of chemical mediators by neutrophils and endothelial cells, as NO, seem to be related to anti-apoptotic activities. Additionally LOPAP or P4 inhibit the microcirculatory network formation, by interfering, at least in part, by altering the migration of endothelial cells.

Resultados preliminares do nosso grupo de pesquisa demonstraram que a inibição da síntese de NO por período de tempo prolongado reduz o recrutamento de leucócitos para focos inflamatórios, dependente, pelo menos em parte, da inibição da interação leucócito-endotélio e da expressão de L-selectina. 0 presente trabalho visou complementar os estudos sobre os mecanismos envolvidos nesta ação antiinflamatória. Para tanto, ratos Wistar machos (180 a 220g) receberam L-NAME (20mg/Kg; v.o.; 14 dias) ou água pela mesma via e período de tempo. Foi avaliada a atividade das enzimas óxido nítrico sintases (NOS) no tecido cerebral por radioimunoensaio; o recrutamento leucocitário para cavidade peritoneal induzido pelo LPS (5mg/kg, 4 horas); as expressões de moléculas de adesão em leucócitos do sangue circulante, no músculo cremaster e nos sinusóides hepáticos por ensaios de citometria de fluxo ou imunohistoquímica; as expressões gênicas de moleculas de adesão, quantificadas por PCR e a secreção/produção de mediadores inflamatórios em leucócitos por ensaios imunoenzimáticos, reacao de Griess ou quimiluminescência. Os resultados obtidos mostraram que: 1) o tratamento com L-NAME reduziu em torno de 90% a atividade das NOS dependentes de Ca+2 em condições basais ou após estimulação in vivo com LPS; 2) as concentrações de NO no plasma e no peritônio inflamado estavam reduzidos em animais tratados com L-NAME (30% vs. controles); 3) a migração de leucócitos polimorfonucleares (PMN) para o peritônio inflamado estava reduzida em animais tratados com L-NAME (40% vs. controles); 4) as expressões de L-selectina e PECAM-1 em leucócitos circulantes; de PECAM-1 no endotélio do músculo cremaster e de VAP-1 no endotélio dos sinusóides hepáticos e músculo cremaster de animais tratados com L-NAME estavam reduzidas; 5) a redução na expressão de L-selectina foi dependente de inibição de sua síntese; 6) a concentração de IL-10 estava major no soro de animais tratados com L-NAME em relação aos controles; 7) a maior concentração de IL-10 circulante pode refletir a produção desta citocina por leucócitos na circulação, uma vez que a concentração de IL-10 também estava maior no sobrenadante de leucócitos circulantes de animais tratados com L-NAME; 8) concentrações reduzidas de IL-1β e LTB4 foram detectadas nos sobrenadantes de neutrófilos obtidos de animais tratados com L-NAME; 9) macrófagos obtidos de animais tratados com L-NAME produziram maiores concentrações de IL-1β, TNF-α e IL-6, e menores concentrações de IL-10 na ausência de estimulação; na vigência estimulação in vitro com LPS os macrófagos de animais tratados com L-NAME produziram menores concentrações de NO. Em conjunto, os resultados obtidos neste trabalho mostram que o tratamento com L-NAME por período prolongado de tempo inibe a atividade das NOS dependentes de Ca+2 e nesta condição reduz as concentrações de NO circulante e no foco da inflamação, além de inibir a migração de leucócitos para o foco inflamatório, confirmando propriedades pro-inflamatórias do NO. Os mecanismos envolvidos na inibição da migração celular parecem compreender a modulação da expressão e/ou síntese das moléculas de adesão constitutivas expressas em leucócitos e no endotélio, além da modulação da secreção de mediadores pró ou antiinflamatórios em leucócitos circulantes e neutrófilos. Por outro lado, os efeitos do tratamento com L-NAME sobre a secreção de mediadores químicos por macrófagos induzem a secreção destes e corroboram a dualidade dos efeitos do NO no processo de recrutamento celular. / Our previous results have demonstrated that in vivo chronic inhibition of nitric oxide synthesis reduces leukocyte recruitment into inflammatory focus, dependent, at least in part, on impaired leukocyte-endothelial interactions and expression of L-selectin. This study aimed to clarify the mechanisms involved in the reduced leukocyte migration observed in L-NAME-treated rats. For this purpose, male Wistar rats (180-220g) were treated with L-NAME (20 mg/kg, oral route, 14 days, dissolved in drinking water); controls animals received water by the same route and period of time. The effectiveness of L-NAME treatment was investigated by examining the activity of nitric oxide synthases (NOS) in the brain tissue using radioimmunoassay. In addition, effects of L-NAME treatment were evaluated in LPS-induced leukocyte recruitment into peritoneal cavity (5mg/kg, 4 hours); expression of adhesion molecules was determined in circulating leukocytes, cremaster muscle and liver sinusoids by flow cytometry and immunohistochemistry assay; gene expressions of adhesion molecules were quantified by PCR and leukocyte secretion of inflammatory mediators was measured by immunoenzimatics assays, Griess reaction or chemiluminescence. Our results show that: 1) L-NAME treatment reduced, around 90%, Ca+2 - dependent NOS activity in the presence or not of in vivo inflammation; 2) concentrations of NO in the plasma and into inflamed peritoneum were reduced in L-NAME-treated animals (30% vs. control animals); 3) migration of PMN leukocytes into inflammed peritoneum was impaired in L-NAME-treated rats (40% vs. control animals); 4) expressions of L-selectin and PECAM-1 in circulating leukocytes, PECAM-1 in endothelium from cremaster muscle and VAP-1 in endothelium from liver sinusoids and cremaster muscle were reduced in L-NAME-treated rats; 5) decrease in L-selectin expression was dependent on inhibition of its synthesis; 6) concentrations of IL-10 was higher in serum from L-NAME-treated rats in comparison to control rats; 7) these higher concentrations of circulating IL-10 can reflect the production of this cytokine by leukocytes from circulation, as IL-10 levels was greater in the supernatant of circulating leukocytes obtained from L-NAME-treated animals; 8) L-NAME treatment disturbed neutrophils ability to secrete IL-1β e LTB4, since these concentrations were lower in the supernatants of neutrophils from L-NAME-treated animals; 9) in absence of stimulation, macrophages obtained from L-NAME-treated rats produced higher concentrations of IL-1β, TNF-α e IL-6, and lower concentrations of IL-10, whereas in presence of in vitro LPS these cells produced lower concentrations of NO. Taken together, our results show that L-NAME treatment administrated for a prolonged period of time inhibits Ca+2 -dependent NOS activity, and in this condition, reduces concentrations of NO in plasma and into inflammatory focus and decreases leukocyte migration to the inflammatory focus thus confirming pro-inflammatory properties of NO. The mechanisms involved in impaired cellular migration seem to involve the modulation of expression and/or synthesis of constitutive adhesion molecules in leukocytes and endothelium, and to interfere in the secretion of pro or anti inflammatory mediators. On the other hand, actions of NO in secreation of chemical mediators by macrophages induces the production of inflammatory mediators and support the duality of NO in the cellular recruitment process.

Resultados preliminares do nosso grupo de pesquisa demonstraram que a inibição da síntese de NO por período de tempo prolongado reduz o recrutamento de leucócitos para focos inflamatórios, dependente, pelo menos em parte, da inibição da interação leucócito-endotélio e da expressão de L-selectina. 0 presente trabalho visou complementar os estudos sobre os mecanismos envolvidos nesta ação antiinflamatória. Para tanto, ratos Wistar machos (180 a 220g) receberam L-NAME (20mg/Kg; v.o.; 14 dias) ou água pela mesma via e período de tempo. Foi avaliada a atividade das enzimas óxido nítrico sintases (NOS) no tecido cerebral por radioimunoensaio; o recrutamento leucocitário para cavidade peritoneal induzido pelo LPS (5mg/kg, 4 horas); as expressões de moléculas de adesão em leucócitos do sangue circulante, no músculo cremaster e nos sinusóides hepáticos por ensaios de citometria de fluxo ou imunohistoquímica; as expressões gênicas de moleculas de adesão, quantificadas por PCR e a secreção/produção de mediadores inflamatórios em leucócitos por ensaios imunoenzimáticos, reacao de Griess ou quimiluminescência. Os resultados obtidos mostraram que: 1) o tratamento com L-NAME reduziu em torno de 90% a atividade das NOS dependentes de Ca+2 em condições basais ou após estimulação in vivo com LPS; 2) as concentrações de NO no plasma e no peritônio inflamado estavam reduzidos em animais tratados com L-NAME (30% vs. controles); 3) a migração de leucócitos polimorfonucleares (PMN) para o peritônio inflamado estava reduzida em animais tratados com L-NAME (40% vs. controles); 4) as expressões de L-selectina e PECAM-1 em leucócitos circulantes; de PECAM-1 no endotélio do músculo cremaster e de VAP-1 no endotélio dos sinusóides hepáticos e músculo cremaster de animais tratados com L-NAME estavam reduzidas; 5) a redução na expressão de L-selectina foi dependente de inibição de sua síntese; 6) a concentração de IL-10 estava major no soro de animais tratados com L-NAME em relação aos controles; 7) a maior concentração de IL-10 circulante pode refletir a produção desta citocina por leucócitos na circulação, uma vez que a concentração de IL-10 também estava maior no sobrenadante de leucócitos circulantes de animais tratados com L-NAME; 8) concentrações reduzidas de IL-1β e LTB4 foram detectadas nos sobrenadantes de neutrófilos obtidos de animais tratados com L-NAME; 9) macrófagos obtidos de animais tratados com L-NAME produziram maiores concentrações de IL-1β, TNF-α e IL-6, e menores concentrações de IL-10 na ausência de estimulação; na vigência estimulação in vitro com LPS os macrófagos de animais tratados com L-NAME produziram menores concentrações de NO. Em conjunto, os resultados obtidos neste trabalho mostram que o tratamento com L-NAME por período prolongado de tempo inibe a atividade das NOS dependentes de Ca+2 e nesta condição reduz as concentrações de NO circulante e no foco da inflamação, além de inibir a migração de leucócitos para o foco inflamatório, confirmando propriedades pro-inflamatórias do NO. Os mecanismos envolvidos na inibição da migração celular parecem compreender a modulação da expressão e/ou síntese das moléculas de adesão constitutivas expressas em leucócitos e no endotélio, além da modulação da secreção de mediadores pró ou antiinflamatórios em leucócitos circulantes e neutrófilos. Por outro lado, os efeitos do tratamento com L-NAME sobre a secreção de mediadores químicos por macrófagos induzem a secreção destes e corroboram a dualidade dos efeitos do NO no processo de recrutamento celular. / Our previous results have demonstrated that in vivo chronic inhibition of nitric oxide synthesis reduces leukocyte recruitment into inflammatory focus, dependent, at least in part, on impaired leukocyte-endothelial interactions and expression of L-selectin. This study aimed to clarify the mechanisms involved in the reduced leukocyte migration observed in L-NAME-treated rats. For this purpose, male Wistar rats (180-220g) were treated with L-NAME (20 mg/kg, oral route, 14 days, dissolved in drinking water); controls animals received water by the same route and period of time. The effectiveness of L-NAME treatment was investigated by examining the activity of nitric oxide synthases (NOS) in the brain tissue using radioimmunoassay. In addition, effects of L-NAME treatment were evaluated in LPS-induced leukocyte recruitment into peritoneal cavity (5mg/kg, 4 hours); expression of adhesion molecules was determined in circulating leukocytes, cremaster muscle and liver sinusoids by flow cytometry and immunohistochemistry assay; gene expressions of adhesion molecules were quantified by PCR and leukocyte secretion of inflammatory mediators was measured by immunoenzimatics assays, Griess reaction or chemiluminescence. Our results show that: 1) L-NAME treatment reduced, around 90%, Ca+2 - dependent NOS activity in the presence or not of in vivo inflammation; 2) concentrations of NO in the plasma and into inflamed peritoneum were reduced in L-NAME-treated animals (30% vs. control animals); 3) migration of PMN leukocytes into inflammed peritoneum was impaired in L-NAME-treated rats (40% vs. control animals); 4) expressions of L-selectin and PECAM-1 in circulating leukocytes, PECAM-1 in endothelium from cremaster muscle and VAP-1 in endothelium from liver sinusoids and cremaster muscle were reduced in L-NAME-treated rats; 5) decrease in L-selectin expression was dependent on inhibition of its synthesis; 6) concentrations of IL-10 was higher in serum from L-NAME-treated rats in comparison to control rats; 7) these higher concentrations of circulating IL-10 can reflect the production of this cytokine by leukocytes from circulation, as IL-10 levels was greater in the supernatant of circulating leukocytes obtained from L-NAME-treated animals; 8) L-NAME treatment disturbed neutrophils ability to secrete IL-1β e LTB4, since these concentrations were lower in the supernatants of neutrophils from L-NAME-treated animals; 9) in absence of stimulation, macrophages obtained from L-NAME-treated rats produced higher concentrations of IL-1β, TNF-α e IL-6, and lower concentrations of IL-10, whereas in presence of in vitro LPS these cells produced lower concentrations of NO. Taken together, our results show that L-NAME treatment administrated for a prolonged period of time inhibits Ca+2 -dependent NOS activity, and in this condition, reduces concentrations of NO in plasma and into inflammatory focus and decreases leukocyte migration to the inflammatory focus thus confirming pro-inflammatory properties of NO. The mechanisms involved in impaired cellular migration seem to involve the modulation of expression and/or synthesis of constitutive adhesion molecules in leukocytes and endothelium, and to interfere in the secretion of pro or anti inflammatory mediators. On the other hand, actions of NO in secreation of chemical mediators by macrophages induces the production of inflammatory mediators and support the duality of NO in the cellular recruitment process.