Submitted by Angelo Silva (asilva@icict.fiocruz.br) on 2016-07-13T18:26:36Z No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 71822.pdf: 1728254 bytes, checksum: d921c02c1f05a7463f391f259e73255d (MD5) / Approved for entry into archive by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2016-08-09T17:36:54Z (GMT) No. of bitstreams: 2 71822.pdf: 1728254 bytes, checksum: d921c02c1f05a7463f391f259e73255d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-09T17:36:54Z (GMT). No. of bitstreams: 2 71822.pdf: 1728254 bytes, checksum: d921c02c1f05a7463f391f259e73255d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os medicamentos utilizados no controle da infecção causada por espécies de Leishmania estão associados a alta toxicidade, dificuldade de administração, altos custos e crescente resistência. A procura por novas alternativas de tratamento é, portanto, uma prioridade. Na busca de outros fármacos que possam ser efetivos e menos tóxicos destacam-se os inibidores de protease. As proteases de Leishmania estão envolvidas nos mais diversos mecanismos, tais como virulência e patogênese. Dentro deste contexto, trabalhos mostram a atividade de inibidores de aspártico protease do HIV (IPs-HIV) em patógenos oportunistas, dentre eles Leishmania spp. No presente estudo trabalhamos com moléculas precursoras de síntese dos IPs-HIV, as hidroxietilaminas (HEAs). O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade leishmanicida de HEAs e suas implicações na biologia de Leishmania spp. De 23 móleculas submetidas à triagem inicial em promastigotas, 15 prosseguiram nos testes e confirmaram sua atividade sobre amastigotas intracelulares de L. amazonensis, todas com IC50 < 5,0 \F06DM. A avaliação da toxidez in vitro sobre macrófagos peritoneais murinos e células MRC5 demonstrou que as substâncias-teste PMTB1, PMTB4, PMTB11, PLIP2, PLIP19 possuem índice de seletividade superior a 20. As substâncias mais ativas sobre amastigotas foram selecionadas para testes onde diferentes variáveis foram usadas, como: espécies do parasito, razão de infecção, tempo e metodologia de contagem. Os resultados destacaram os compostos PMTB1, PMTB8, PMTB10, PLIP1, PLIP27 e PLIP33, que foram mais ativos para L. amazonensis e L. major considerando as diversas variáveis Além disso, ficou evidente que existe uma diferença significativa no resultado de IC50/IC90 de acordo com a metodologia de contagem. Os testes de inibição da atividade proteolítica de aspártico protease mostraram que as HEAs tem perfis diferentes de inibição, e as com maior capacidade inibitória foram PLIP19, PLIP27, PMTB3, PMTB4, PMTB5, PMTB7, PMTB9 e PMTB10, não guardando correlação direta com a atividade leishmanicida. Ao analisarmos a relação estrutura/atividade das moléculas, percebemos que o grupamento NH2 mantém a atividade leishmanicida. A análise do perfil dos lipídeos neutros mostrou que não houve acúmulo de esteróis metilados na posição 14, que são caracteristíscos da inibição farmacológica da CYP51. No entanto, houve uma alteração na composição dos esteróis, principalmente pela PLIP27, cujo mecanismo necessita ser explorado. A análise in silico demostrou a aderência das moléculas à regra dos cinco (Ro5) de Lipinski, sugerindo que de acordo com parâmetros físico-químicos, elas são boas canditadas à administração oral. Juntos, estes resultados sugerem que as HEAs, principalmente PLIP27 e PMTB10, são moléculas promissoras com amplo espectro de atividade e podem auxiliar no estudo e desenvolvimento de protótipos semelhantes aos IPs-HIV para o tratamento das leishmanioses / Drugs used to control infection caused by Leishmania species are associated with poor therapeutic responses, adverse effects, high toxicity, high costs and resistance. The search for new treatment approaches is a priority. Seeking other effective and less toxic drugs there are the protease inhibitors. Leishmania proteases are involved in many mechanisms, such as virulence and pathogenesis. In this context, studies show the activity of HIV aspartic protease inhibitors (HIV-PIs) in opportunistic pathogens, including Leishmania spp. In this study we worked with hydroxyethylamines (HEAs) used as precursor molecules in the synthesis of HIV-PIs. The objective of the study was to evaluate the leishmanicidal activity of HEAs and their implications in Leishmania biology. From 23 molecules in the initial screening with promastigotes, 15 continued in the tests and confirmed their activity on intracellular amastigotes of L. amazonensis, all of them with IC50 < 5,0 \F06DM. The toxicity assay on murine peritoneal macrophages and MRC5 cells showed that the molecules PMTB1, PMTB4, PMTB11, PLIP2, PLIP19 have selectivity index greater than 20. The most active substances on amastigotes were selected for testing in different methodologies, ranging parasitic species, infection rate, time and counting procedure. The results highlighted PMTB1, PMTB8, PMTB10, PLIP1, PLIP27 and PLIP33 as the most active compounds for L. amazonensis and L. major, considering several variables Furthermore, it was evident that there are significant differences in results of IC50/IC90 according to the counting methodology. Inhibition tests of the proteolytic activity of aspartic protease showed that HEAs have different profiles of inhibition. PLIP19, PLIP27, PMTB03, PMTB04, PMTB05, PMTB07, PMTB09 e PMTB10 were the most potent inhibiting the protease activity, without having a direct correlation with the leishmanicidal activity. Analyzing the relationship structure / activity of molecules, we realize that the group NH2 is important for leishmanicidal activity. Analysis of neutral lipids from promastigotes of L. amazonensis treated with PLIP27 and PMTB10 showed that there was no accumulation of C14-methylated sterols, which are typical of pharmacological inhibition of CYP51. However, other changes in sterol composition induced mainly by PLIP27 were noted, but the mechanism remains to be explored. The in silico analysis demonstrated the adherence of molecules to the rule of five (Ro5) of Lipinski, suggesting that according to physicochemical parameters they are good candidates of oral treatment. Altogether, these results suggest that HEAs, mainly PLIP27 and PMTB10, are promising molecules with broad-spectrum activity, and can be useful in the study and development of prototypes similar to HIV-PI for the treatment of leishmaniasis

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-20T16:00:52Z No. of bitstreams: 1 Mariela Ferreira de Vasconcelos.pdf: 1477755 bytes, checksum: ff699f8bebce035f77777ac4343e2091 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-20T16:00:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mariela Ferreira de Vasconcelos.pdf: 1477755 bytes, checksum: ff699f8bebce035f77777ac4343e2091 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / As leishmanioses constituem um conjunto de doenças negligenciadas que afetam cerca de 12 milhões de indivíduos em 98 países. Os medicamentos utilizados no controle da infecção estão associados à baixa eficácia, alta toxicidade, dificuldade de administração, altos custos e crescente resistência. A procura por novas alternativas de tratamento é, portanto, uma prioridade. Este trabalho tem como objetivo avaliar a atividade leishmanicida de novas hidroxietilpiperazinas sintéticas e de Momordica charantia (Cucurbitaceae). Uma série de oito hidroxietilpiperazinas foi sintetizada e testada, a que demonstrou ser mais ativa e com menor citotoxidade, PMIC4, foi selecionada. Promastigotas de Leishmania amazonensis foram cultivadas em diferentes concentrações da PMIC4, que inibiu acentuadamente a multiplicação do parasito, com IC50 de 11,6 μM. Em amastigotas, os resultados mostraram que macrófagos tratados com 20 μM de PMIC4 apresentaram uma redução de 82% nos níveis de infecção, com IC50 de 1,8 μM. Uma vez que hidroxietilpiperazinas são utilizadas como precursores na síntese dos inibidores de protease do HIV, foram realizados ensaios para detectar se a PMIC4 seria capaz de inibir a atividade de aspártico proteases em promastigotas de L. amazonensis. Concentrações de até 200 μM de PMIC4 não foram capazes de inibir esta atividade enzimática. Para avaliar se houve diferença na composição dos esteróis de membrana entre L. amazonensis tratadas com a PMIC4 e não tratadas, os lipídeos neutros foram analisados por cromatografia de camada fina. Foi possível notar uma diferença significativa entre os grupos tratados e o grupo controle. Para avaliar o efeito desta hidroxietilpiperazina no controle da infecção por L. amazonensis em camundongos BALB/c, os animais foram tratados com a PMIC4, que mostrou possuir atividade leishmanicida in vivo por via oral. Paralelamente, também foi demonstrada a atividade leishmanicida de frações de Momordica charantia em promastigotas e amastigotas intracelulares de L. amazonensis. Ao longo do trabalho, foi realizado o fracionamento do extrato bruto das partes aéreas da planta, guiado pela atividade leishmanicida, até a obtenção de três frações semi-purificadas ativas. Em amastigotas intracelulares, as frações ativas MSØAc e F7 apresentaram IC50 de 1,69 μg/mL e 1,08 μg/mL, respectivamente. Este é o primeiro relato tanto da atividade de uma hidroxietilpiperazina quanto de Momordica charantia contra Leishmania amazonensis. Os extratos, frações e substâncias aqui apresentados podem ser considerados candidatos potenciais para o desenvolvimento de novos fitoterápicos e/ou quimioterápicos contra a leishmaniose cutânea. / Leishmaniasis is a group of neglected diseases that affect approximately 12 million people in 98 countries. The drugs used to control the disease are associated with low efficacy, high toxicity, difficulties of administration, high costs and increasing resistance. The search for new alternatives of treatment is a priority. This study aims to evaluate the leishmanicidal activity of new synthetic hidroxyethylpiperazines and of Momordica charantia (Cucurbitaceae). A series of eight hidroxyethylpiperazines was synthesized and the PMIC4 showed to be more active and less cytotoxic. Leishmania amazonensis promastigotes were cultivated in different concentrations of PMIC4, which strongly inhibited the multiplication of the parasite, with IC50 of 11.6 μM. In amastigotes, the results demonstrated that macrophages treated with 20 μM of PMIC4 presented 82% reduction in infection levels, with IC50 of 1.8 μM. Once hidroxyethylpiperazines are used as precursors in the synthesis of protease inhibitors of HIV, we tested whether the PMIC4 could inhibit the activity of aspartic proteases in promastigotes of L. amazonensis. Concentrations up to 200 μM of PMIC4 were not able to inhibit this enzyme activity. To determine differences in the composition of membrane sterols between L. amazonensis treated with PMIC4 and untreated, the neutral lipids were analyzed by thin layer chromatography. It was possible to observe a significant difference between treated and control groups. To evaluate the effect of this hidroxyethylpiperazine in controlling infection by L. amazonensis in BALB/c mice, animals were treated with PMIC4, which showed in vivo leishmanicidal activity orally. Moreover, we also demonstrated the leishmanicidal activity of fractions of Momordica charantia in promastigotes and intracellular amastigotes of L. amazonensis. Throughout the work, we performed the fractionation of crude extract of aerial parts of the plant, guided by the leishmanicidal activity until we get three very active fractions. In intracellular amastigotes, the active fractions MSØAc and F7 showed IC50 of 1,69 μg/mL and 1,08 μg/mL, respectively. This is the first report of the activity of hidroxyethylpiperazines and Momordica charantia against Leishmania amazonensis. The extracts, fractions and substances presented here can be considered potential candidates for the development of new phytotherapy and/or chemotherapy against cutaneous leishmaniasis.