Orientador: Jaime Aparecido Cury / Dissertação (mestrado)- Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piraciaba / Made available in DSpace on 2018-07-22T15:07:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Peres_PauloEdelvarCorrea_M.pdf: 4032215 bytes, checksum: 9466284a4ef67d323b96cd6ed39c70d8 (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: Fenilmetilsulfonilflúor (PMSF) é um inibidor de proteases amplamente utilizado em pesquisas. Entretanto, durante sua ação, ele libera íon flúor o qual pode ter efeitos indiretos em enzimas, na formação de película e no esmalte dental. Quarenta e nove blocos (4x4mm) polidos de esmalte bovino foram utilizados. Inicialmente, dureza superficial do esmalte (DSE) foi determinada, após o que os blocos foram submetidos a uma solução desmineralizante (ácido láctico 0,05 M, pH 5,0 , 50 % saturado em relação à hidroxiapatita e contendo carbopol 907 a 0,2 %) para provocar uma lesão superficial de cárie. A DSE foi novamente determinada e os blocos foram divididos casualmente em 5 grupos para serem submetidos aos seguintes tratamentos: I = Saliva humana estimulada (SHE) ; II = SHE contendo PMSF a 10,0 'mu'M ; III = SHE contendo PMSF a 50,0 'mu'M ; IV = SHE contendo PMSF a 100,0 'mu'M e V = SHE contendo 1,0 ppm F. Durante 12 dias estes blocos permaneceram, diariamente, 22h nas salivas de acordo com os tratamentos, e por 2h na solução desmineralizante (ciclagens de pH). As salivas foram trocadas 2x/dia e a solução desmineralizante após o 6° dia. A DSE (Knoop) foi novamente medida, sendo feitas sempre 05 indentações a cada 100 'mu'M de distância, com uma carga de 50 g por 5 seg, utilizando-se um microdurômetro Shimadzu HMV 2000. Flúor incorporado no esmalte (FIE) foi também determinado, removendo-se 05 camadas de esmalte com HCL 0,5 M e as análises de íon flúor foram realizadas com eletrodo específico Orion 96-09 e analisador de íons EA 940. Determinou-se também, a liberação de íon flúor do PMSF (100 'mu'M) pela ação da saliva. Os resultados mostraram que o PMSF liberou íon flúor e em 10 min/37°C a concentração na saliva aumentou de 0,078 para 1,732 ppm F. Calculou-se a % de recuperação da DSE (remineralização sendo os resultados (média + erro padrão) para os grupos de I a V, respectivamente de : 10,7 + 1,97 A; 30,8 + 2,90 B; 43,5 + 5,07 B,C ; 54,5 + 6,59 C; e 43,2 + 5,82 B,C. Os resultados de FIE na 1a camada foram: 2544,8 + 203,7 A; 6281,0 + 429,9 B; 13732,7 + 1372,8 C ; 13719,0 + 1552,1 Ce 11650,3 + 1394,2 C, sendo que médias seguidas de letras distintas difereJp estatisticamente (p <0,05). Concluiu-se que o PMSF libera íon flúor quando em contato com a saliva, o qual não só remineraliza e incorpora flúor no esmalte como poderá ter efeitos indiretos em outras pesquisas nas quais ele é utilizado com a finalidade de inibir enzimas proteolíticas / Abstract: Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) is a widely used protease inhibitor that by releasing fluoride may have indirect effect on enzymes, pellicle formation and dental enamel. The objective of this research was to study the effect of PMSF on enamel remineralization through saliva action. Forty nine flat bovine enamel blocks (4x4mm) were used. Surface microhardness (SMH) was initially determined in the sound enamel. These enamel blocks were partially demineralized in 0.05 M lactic acid, 50% saturated hydroxiapatite sol. at pH 5.0 containing Carbopol 0.2%, during 16h at 37°C. SMH was determined again; the enamel blocks were randomly allocated in 5 groups and submitted to the following treatments: 1= Human Stimulated Saliva (HSS); II= HSS containing 10.0 'mu'M PMSF; III= HSS containing 50.0 'mu'M PMSF; IV= HSS containing 100.0 'mu'M PMSF and V= HSS containing 1.0 ppm F. The enamel blocks were submitted to a pH-cycling model for 12 days, kept 2h in demineralizing solution and 22h in HSS. The saliva was changed twice/day and the demineralizing sol. after the 6th day. The Knoop SMH was again determined. Enamel fluoride uptake was determined by removing 5 layers of enamel With 0.5 M HCL. Fluoride released from PMSF (100.0 'mu'M) through saliva action was determined. For the Knoop SMH analysis a microhardness tester SHIMADZU HMV -2000 was utilized and for the fluoride analysing, specific electrode ORlON 96-09 was utilized. The results showed that PMSF, releases fluoride and after 10 minutes at 37°C, the fluoride concentration in saliva increased significantly from 0.078 to 1.732 ppm F. The % of Knoop SMH recovery (mean + SE) was calculated; the results for the groups I to V were respectively: 10.7 '+ or -'1.97A; 30.8 '+ or -'2.90B; 43.5 '+ or -' 5.07B,C; 54.5 '+ or -' 6.59C; and 43.2 '+ or -' 5.82B,C. The results (mean '+ or -' SE) of enamel fluoride uptake (ppm) at the 1st layer were: 2544.8 '+ or -' 203.7A; 6281.0 '+ or -' 429.9B; 13732.7 '+ or -' 1372.8C; 13719.0 '+ or -' 1552.1C; and 11650.3 '+ or -' 1394.2C. Means followed by different letters are statistically significant (p<0.05). In conclusion, PMSF releases fluaride when in contact with saliva, which not only enhances remineralization and enamel fluoride uptake but may also have indirect effects on other researches where PMSF is used as protease inhibitor / Mestrado / Biologia e Patologia Buco-Dental / Mestre em Odontologia

Orientador: Luiz Carlos Dias / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-31T17:14:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_Edilson_M.pdf: 5284953 bytes, checksum: e6bdcb2cea65bbd2f84a01043bf54da0 (MD5) Previous issue date: 2001 / Mestrado

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-15Bitstream added on 2014-06-13T19:28:48Z : No. of bitstreams: 1 zeminian_lb_me_botfm.pdf: 506409 bytes, checksum: 08bea6131bbfbe54e0327803c5f6bb14 (MD5) / Ministério da Saúde / O vírus da Hepatite C (VHC) é um importante patógeno associado com doença hepática crônica sendo que alguns infectados podem desenvolver cirrose e carcinoma hepatocelular. O tratamento da hepatite C crônica visa a resposta virológica sustentada (RVS), definida como níveis de RNA viral indetectáveis no soro por seis meses depois do término do tratamento. Atualmente, a terapia padrão ouro é a combinação de interferon α peguilado e ribavirina, porém esse esquema terapêutico vem se mostrando eficaz em, apenas, 50% dos pacientes infectados com o genótipo 1, o mais prevalente no Brasil. Portanto, novas drogas mais eficazes e menos tóxicas estão sendo desenvolvidas para melhorar a assistência aos pacientes infectados pelo VHC, entre as quais merecem destaque os inibidores da serina protease NS3, a qual é uma enzima essencial para a replicação do VHC e assim um potencial alvo para novas terapias antivirais. Entretanto, a emergência de variantes resistentes é o maior obstáculo para o sucesso da terapêutica. Variantes resistentes já foram isoladas em pacientes tratados com os inibidores de protease e, estão associadas com a falência terapêutica. Porém o impacto dessas variantes resistentes em pacientes virgens de tratamento ainda não foi esclarecido e, esse tipo de informação pode avaliar o impacto dos inibidores de protease na terapia antiviral. O objetivo deste estudo foi avaliar a presença de mutações de resistência e polimorfismos genéticos na região genômica NS3 do VHC em 37 pacientes virgens de tratamento com inibidores de protease infectados com genótipo 1. RNA viral sérico foi utilizado como fonte para amplificação e seqüenciamento da região NS3 do VHC e, avaliar a presença de mutações de... / The Hepatitis C Virus (HCV) is an important pathogen associated with chronic hepatic disease and some infected patients can develop cirrhosis and hepatocellular carcinoma. The treatment of chronic hepatitis C aimed the sustained virological response (SVR), defined as having undetectable serum HCV RNA at the end of therapy for at least 6 months. Currently, the gold standard therapy is a combination of pegylated interferon-α and the ribavirin, however this treatment present efficacy in only 50% of patients infected with genotypes 1, the most prevalent in Brazil. Then, new drugs more effective and less toxic have been developed to improve the attendance of the HCV infected patients as the serine protease NS3 inhibitors, which is an enzyme essential to HCV replication and main target of new antiviral therapies. However, the emergence of drug resistant variants has been the major obstacle to therapeutic successful. Resistant variants have already been isolated in patients treated with protease inhibitors and, these resistant variants are associated with non response to treatment. But the impact of the resistant variants in naïve protease inhibitors patients is unclear yet and, this information can evaluate the impact of protease inhibitors in antiviral therapeutic. The goal of this study was evaluate the presence of resistance mutations and genetic polymorphisms in the NS3 genomic region of HCV in 37 protease inhibitors-naive genotype 1 HCV infected patients. Serum viral RNA was used as source to amplification and sequencing of NS3 region of HCV and, evaluates the presence of resistance mutations and polymorphisms in this region. The results showed that only 07 (18.9%) samples presented resistant variants, the mutations... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Sergio Marangoni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-21T14:55:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pando_LuziaAparecida_M.pdf: 3471105 bytes, checksum: aa20d26751e5da61ad13b4f683a3fafe (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: A presença de inibidores de serinoproteinases foi investigada em sementes das plantas Croetalaria paulina, Croetalaria juncea resistente à murcha bacteriana e Croetalaria juncea Papilionoideae) . não resistente à murcha bacteriana. (Leguminosae) A purificação do inibidor de Croetalaria paulina por cromatografia de troca iônica e subsequente cromatografia em fase reversa, evidenciaram nessa espécie, uma proteína com cadeia polipeptídica única. A massa molecular ao redor de 20 kDa é similar aos da família de inibidores vegetais do tipo Kunitz A coloração para inibidor de tripsina após focalização isoelétrica demonstrou a presença de inibidor com ponto isoelétrico ao redor de 4,5, e a análise de aminoácidos revelou a presença de 176 resíduos. Os inibidores de Croetalaria atuam seletivamente sobre serinoproteinases. Extratos de sementes de Croetalaria paulina, Croetalaria juncea resistente e Croetalaria juncea não resistente à murcha bacteriana foram testados para atividade de inibição contra tripsina e quimotripsina bovina, porcina e humana. Entre estas amostras, Croetalaria paulina exibiu a mais alta inibição, com tripsina humana sendo melhor inibida do que tripsina bovina e porcina. A variedade resistente de Croetalaria juncea inibiu melhor tripsina bovina do que a variedade não resistente. As três quimotripsinas não foram inibidas por estas amostras, com exceção da quimotripsina bovina que foi fracamente inibida pelo extrato de Croetalaria paulina / Abstract: The presence of serine proteinase inhibitors was investigated in the seeds of Croetalaria paulina, Croetalaria juncea resistant and non resistant to bacterial infection This plants belongs to Leguminosae (Papilionoideae) family. The purification of inhibitor from Croetalaria paulina by ion-exchange chromatography and subsequent reverse phase chromatography using a C18 column showed the presence of a single polypeptide chain. The purifited serine proteinase inhibitor (CpTI), has a molecular mass of 20 kDa in SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE 10-20%) suggesting that this protein belongs to the Kunitz-type plant inhibitors family. Staining for inhibitors trypsin afier isoeletric focusing showed the presence of inhibitors with isoeletric point about 4,5 and amino acid analysis revealed the presence of 176 amino acids residues. Crotalaria inhibitors act selectively on serine proteinases. Extracts from seeds of Croetalaria paulina, Croetalaria juncea resistant and non-resistant were tested for inhibitory activity against trypsin and chymotrypsin, from cattle, pig and humans. Within these samples, Croetalaria paulina exhibited the highest activity, inhibiting human trypsin better than bovine and porcine. The resistant Croetalaria juncea variety inhibited bovine trypsin better than the non-resistant one. The three kinds of chymotrypsin were not inhibited by these samples excepted bovine chymotripsin, that was weakly inhibited by the Croetalaria paulina extract / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas

Orientadores: Sergio Maramgani, Claudio Augusto Machado Sampaio / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-21T19:45:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Leme_LucianaDiCieroToledo_D.pdf: 9158581 bytes, checksum: d80e70dba366d1980e84dad1b3b10893 (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: A presença de inibidores de serinoproteinases foi investigada em sementes de duas variedades de Bauhinia variegata (Legumonosae, Caesalpinoideae). A purificação dos inibidores de Bauhínia variegata variedade cândida e variedade lilás por cromatografia de troca iônica, cromatografias de exclusão molecular e subsequente cromatografia de fase reversa, evidenciaram nestas espécies 3 isoformas (BvcTI-1, 2 e 3; e BvITI-1, 2 e 3) de inibidores de proteinase com cadeia polipeptídica única. A análise global de aminoácidos resultou em 167 e 180 resíduos de aminoácidos para BvcTI-3 e BvITI-3, respectivamente, e em massa molecular calculada de 18529 para BvcTI-3 e de 20018 para BvITI-3, e 4 resíduos de cisteína para BvcTI-3 e 2 resíduos de cisteína para BvITI-3. Estes resultados incluem estes inibidores na Família' de inibidores tipo Kunitz. A coloração para inibidores de tripsina após focalização isoelétrica demonstrou a presença de inibidores com pontos isoelétricos aparentes de 4,85, 5,00 e 5,15. A determinação da estrutura primária completa de BvcTI-3 e da estrutura primária do N-terminal das isoformas de BvcTI e BvITI, confiram alta homologia com inibidores tipo Kunitz. Os inibidores BvcTI e BvlTI atuam seletivamente sobre serinoproteinases. Extratos de sementes e inibidores purificados de Bauhínia variegata var. cândida e varo. lilás foram testados para atividade de inibição contra tripsina e quimotripsina bovina, porcina e humana, sendo que estas enzimas foram fortemente inibidas pelos inibidores em estudo. O teste de edema através do extravasamento de plasma em pele de coelhos, mostrou que BvcTI potenciou a calicreína de pâncreas de porco / Abstract: The presence of serine proteinase inhibitors was investigated in the seeds of Bauhinia variety cândida and Bauhinia variegata variety lilás (Leguminosae, Caesalpinoideae ). The purification of inhibitors from the Bauhinias by ion-exchange chromatography, molecular exclusion chromatography and subsequent reverse phase chromatography, showed the presence of three isoforms (BvcTI-1, 2 and 3 ; BvITI-1, 2 and 3) in the two species studied with single polypeptide chain. The aminoacid analisis of the forms BvcTI-3 and BvITI-3 resulted in 167 and 180 aminoacids residues, respectively, and the calculated molecular masses were 18529 to BvcTI-3 and 20018 to BvITI-3. It showed 4 cysteine residues to BvcTI-3 and 2 cysteine residues to BvITI-3, and no free thiol groups. This results suggest that these proteins belongs to the Kunitz-type plant inhibitors family. Staining for trypsin inhibitors after isoelectric focusing showed the presence of inhibitors with isoeletric point about 4.85, 5.00 and 5.15. The primary structure sequence of BvcTI-3 was determined, confirming the inhibitor as Kunitz type. The inhibitors BvcTI and BvlTI act selectively on serine proteinases. Extracts from seeds and purifieds inhibitors of both Bauhinia variegata variety candida and Bauhinia variegata variety lilas were tested for inhibitory activity against trypsin and chymotrypsin, from cattle, pig and humans. This three enzymes were strongly inhibited by both inhibitors. The oedema test in rabits showed the BvcTI made the kallikrein of porcine pancreas more potent to plasma. extravasation / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Ciências Biológicas

Orientador: Everson Alves Miranda / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-26T18:53:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Genaro_AnaCarolinaBarrosde_M.pdf: 2652839 bytes, checksum: dc293fdb9bd0dc2dcb6bd2e06ab96441 (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: A aprotinina é um inibidor de serino-proteases presente em órgãos bovinos, utilizado como composto farmacêutico em operações cirúrgicas e em cultura de células. Atualmente a aprotinina não é comercialmente produzida no Brasil. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um processo de recuperação de aprotinina a partir de efluente industrial da produção de insulina bovina (SPI), centrado em cromatografia por quimotripsina imobilizada. Foram estudadas três estratégias: a) cromatografia em quimotripsina imobilizada; b) cromatografia em hidroxiapatita seguida de cromatografia em quimotripsina imobilizada e c) cromatografia em quimotripsina imobilizada seguida de cromatografia de afinidade por íon metálico imobilizado (IMAC) utilizando cobre como ligante. A eficiência do processo foi analisada através ensaios de inibição de tripsina e quimotripsina, "dot blot" e eletroforese das frações cromatográficas. A primeira estratégia resultou na recuperação e purificação de aprotinina, da coluna em quimotripsina imobilizada, principalmente nos valores de pH 4,0 e 3,0, quando realizada dessorção em degrau de pH. Na segunda estratégia inicialmente estudou-se o efeito da influência do pH e concentração de NaCI na adsorção de aprotinina de alta pureza na hidroxiapatita. Um planejamento estatístico experimental indicou como condição de alta eficiência tampão fosfato 1 mM, pH 6,5 e 18 mM de NaCI. Dentre 11 soluções estudadas, cloreto de cálcio 3 mM foi a que apresentou melhores índices de dessorção. Entretanto esta segunda estratégia não foi eficiente quando o SPI foi aplicado ao processamento, provavelmente devido a baixa especificidade da hidroxiapatita frente a aprotinina no meio. A terceira estratégia foi a melhor opção estudada para a recuperação e purificação da aprotinina. IMAC foi eficiente como etapa final da purificação depois da recuperação em quimotripsina imobilizada: fatores de purificação global foram tão altos quanto 952 / Abstract: Aprotinin is a pharmaceutical compound used in surgeries and tissue cultures, currently not commercially produced in Brazil. It is a serine-protease inhibitor present in bovine organs. The objective of this work was to develop a process for the recovery of aprotinin from industrial effluent of bovine insulin production (SPI), based on affinity chromatography onto immobilized chymotrypsin. Three approaches were used: a) chromatography onto immobilized chymotrypsin; b) chromatography onto hydroxyapatite followed by chromatography onto immobilized chymotrypsin; and c) chromatography on immobilized chymotrypsin followed by immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) with cupper as the ligant. Efficiency was analysed based on trypsin and chymotrypsin inhibitions, dot blotting, and electrophoresis assays of the chromatographic fractions. The first approach resulted in aprotinin recovery and purification from the chymotrypsin column with pH step elution gradient, mainly at pH 4.0 and 3.0. The second approach was initiated by studying the effects of phosphate buffer solution pH and NaCI concentration on high purity aprotinin adsorption from buffer solutions onto hydroxyapatite. This study was carried out according to a factorial experimental design and indicated 18 mM NaCI and a pH of 6.5 as a high efficiency adsorption condition. Among 11 solutions tested, 3 mM calcium chloride was selected as the best eluent. However, this second approach was not efficient when applied to the processing of SPI probably due to the low specificity of hydroxyapatite towards aprotinin in this medium. The third approach was the best option studied for aprotinin recovery and purification. IMAC was efficient in further purifying aprotinin after its recovery and purification with the chymotrypsin chromatography: overall purification factors were as high as 952 / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química