La protéine MC1 est une petite protéine structurale très abondante chez Methanosarcina thermophila (archaeabactérie). Nous avons utilisé la méthode SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) pour rechercher ses séquences préférentielles de fixation. Après 10 cycles de sélection, une séquence consensus avec une affinité 50 fois plus forte que celle pour une séquence aléatoire a été déterminée. Cette séquence a été étudiée par simulation de dynamique moléculaire. Le mode de fixation de MC1 sur l?ADN a ensuite été déterminé par des empreintes moléculaires (DMS, OH·). Les résultats montrent une fixation par une face et dans le petit sillon de l?ADN. Une reconnaissance par lecture indirecte des séquences est probable. L?oxydation de certains acides aminés (Trp, Met) par les rayons gamma entraîne une modification des propriétés de la protéine : perte de la reconnaissance de structures et séquences particulières et diminution de sa capacité à courber l?ADN.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La protéine MC1 est une petite protéine structurale très abondante chez Methanosarcina thermophila (archaeabactérie). Nous avons utilisé la méthode SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) pour rechercher ses séquences préférentielles de fixation. Après 10 cycles de sélection, une séquence consensus avec une affinité 50 fois plus forte que celle pour une séquence aléatoire a été déterminée. Cette séquence a été étudiée par simulation de dynamique moléculaire. Le mode de fixation de MC1 sur l'ADN a ensuite été déterminé par des empreintes moléculaires (DMS, OH·). Les résultats montrent une fixation par une face et dans le petit sillon de l'ADN. Une reconnaissance par lecture indirecte des séquences est probable. L'oxydation de certains acides aminés (Trp, Met) par les rayons gamma entraîne une modification des propriétés de la protéine : perte de la reconnaissance de structures et séquences particulières et diminution de sa capacité à courber l'ADN.

Helicobacter pylori est une bactérie à Gram-négatif qui colonise la muqueuse de l’estomac humain. Elle se distingue des autres bactéries par un nombre de gènes très limité et de nombreuses particularités physiologiques et biochimiques. Elle provoque des infections associées à différentes maladies gastro-duodénales (ulcères et cancers). Depuis quelques années, une recrudescence de multi-résistances aux antibiotiques est observée. La transformation naturelle est l’un des processus clés qui les propage. Il s’agit d’un mécanisme de transfert horizontal de gènes qui permet aux bactéries de s’adapter à leur environnement, en internalisant des fragments d’ADN exogène à travers leur membrane, puis en les intégrant dans le chromosome par recombinaison homologue. Mes travaux ont visé à étudier de façon structurale et fonctionnelle trois protéines d’H. pylori décrites comme étant essentielles dans le processus de transformation naturelle: NucT, DprA et ComFc. La première partie de ce travail s’est concentrée sur la nucléase périplasmique NucT, supposée être impliquée dans la transformation chez H. pylori. Cependant, la délétion de son gène a permis de démontrer qu’elle ne joue en fait qu’un rôle mineur dans ce processus. La résolution de sa structure 3D a permis de mieux comprendre sa spécificité pour les acides nucléiques simple brin. Dans la seconde partie, la protéine DprA, responsable du chargement de la recombinase RecA sur l’ADN internalisé, a été étudiée. DprA d’H. pylori n’est composée que de 2 des 3 domaines qui constituent habituellement DprA, et fixe aussi bien l’ADN double brin que l’ADN simple brin mais uniquement via son domaine RF. Malgré son homologie structurale avec le domaine WH de liaison à l’ADN, le domaine C-terminal de HpDprA n’a pas d’affinité pour l’ADN. Nous avons mis en évidence des acides aminés conservés dans ce domaine dont l’étude pourrait permettre de comprendre son rôle. Enfin, une étude structurale de la protéine ComFc dont la délétion du gène entraîne la disparition totale de la capacité de transformation d’H. pylori a été réalisée. L’obtention de sa structure 3D a permis de mettre en évidence la présence d’un domaine catalytique phosphoribosyl-transférase ainsi que d’un domaine en doigt en zinc. Ce dernier pourrait être responsable de la capacité de ComFc à fixer l’ADN. Le substrat naturel de cette enzyme reste à découvrir.L’ensemble de ce travail a permis de contribuer à une meilleure compréhension à l’échelle moléculaire du mécanisme de transformation génétique naturelle d’H. pylori. L’avancement sur ces connaissances pourrait à long terme aider à réduire la propagation des multi-résistances par l’élaboration de nouvelles thérapies.Mots-clés : H. pylori, transformation naturelle, NucT, DprA, ComFc, interaction protéine-ADN / Helicobacter pylori is a Gram-negative bacterium that colonizes the mucus of the human stomach. It is distinguished from other bacteria by a limited number of genes and many physiological and biochemical characteristics. It causes infections associated with various gastro-duodenal diseases (ulcers and gastric cancers). In recent years, an increase in multi-resistance to antibiotics has been observed. Natural transformation is one of the key processes that spreads these multi-resistances. It is a horizontal gene transfer mechanism that allows bacteria to adapt to their environment by internalizing exogenous DNA fragments through their membrane and then integrating them into the chromosome by homologous recombination. My work aimed to study in a structural and functional approach three proteins of H. pylori described as essential in the natural transformation process: NucT, DprA and ComFc. The first part of this work focused on periplasmic nuclease, NucT, which is supposed to be involved in transformation in H. pylori. However, the deletion of its gene has shown that it actually plays only a minor role in this process. The resolution of its 3D structure has led to a better understanding of its specificity for single-stranded nucleic acids. In the second part, the protein DprA, responsible for loading RecA recombinase onto internalized DNA, was studied. HpDprA is composed of only 2 of the 3 domains that usually constitute DprA, and binds both double-stranded and single-stranded DNA but only via its RF domain. Despite its structural homology with the WH DNA binding domain, the C-terminal domain of HpDprA has no affinity for DNA. We have identified conserved amino acids in this domain that could be studied to understand its role. Finally, a structural study of ComFc, whose deletion of the gene leads to the total disruption of the transformation capacity of H. pylori, has been carried out. The acquisition of its 3D structure has highlighted the presence of a phosphoribosyl transferase catalytic domain as well as a zinc finger domain. The latter could be responsible for capacity of ComFc to bind DNA. The natural substrate of this enzyme remains to be discovered.All this work has contributed to a better knowledge at the molecular level of the natural genetic transformation mechanism of H. pylori. Advancing this knowledge could in the long term help to reduce the spread of multiresistance through the development of new therapies.Keywords: Helicobacter pylori, natural transformation, NucT, DprA, ComFc, protein-DNA interaction

La famille des protéines THAP est caractérisée par la présence d'un motif protéique, le domaine THAP, conservé au cours de l'évolution et retrouvé dans une centaine de protéines chez l'homme et les organismes animaux modèles. La protéine THAP1 humaine est impliquée dans la régulation du cycle cellulaire dans la voie pRb/E2F et dans la prolifération cellulaire. Le domaine THAP de THAP1 est un motif de liaison à l'ADN de type C-X2-4-C-X35-50-C-X2-H, séquence-spécifique et dépendant du zinc. Nous avons déterminé la structure tridimensionnelle du domaine THAP de THAP1 par Résonance Magnétique Nucléaire en solution. Ce doigt de zinc atypique de ~ 80 résidus se distingue par la présence d'un long motif ΒΑΒ entre les deux paires de ligands de coordination au zinc C2CH. Nous avons étudié la liaison du domaine THAP de THAP1 à sa séquence ADN spécifiquement reconnue en déterminant une constante de dissociation spécifique par Résonance Plasmonique de Surface et en réalisant des expériences d'empreinte RMN de façon à identifier les résidus impliqués dans la liaison à l'ADN. La combinaison des données de variation de déplacement chimique avec des données de mutagénèse dirigée nous a permis de localiser l'interface de liaison à l'ADN du domaine, correspondant à une zone chargée positivement, et de construire un modèle d'interaction protéine-ADN rendant compte d'une reconnaissance originale.

L'intégration de l'ADN viral dans le génome des cellules hôtes est une étape obligatoire du cycle de réplication des rétrovirus. L'intégrase (IN) catalyse le processus global d'intégration en deux étapes distinctes et consécutives. La première des deux réactions, le 3'-processing, consiste en une coupure spécifique d'un dinucléotide au niveau des deux extrémités 3'-OH de l'ADN viral. L'IN transfère ensuite de manière concertée ces deux extrémités au sein de l'ADN cible. Nous avons, par des techniques basées sur l'anisotropie de fluorescence, caractérisé les paramètres structuraux et cinétiques du 3'-processing catalysé par l'IN du VIH-1. Nous avons montré d'une part que cette activité dépend de la taille des complexes IN / ADN. Nous avons trouvé que le dimère d'IN est la forme multimérique la plus active tandis que les complexes de haut poids moléculaire sont relativement peu efficaces. D'autre part, la structuration du domaine N-ter joue un rôle clé dans l'assemblage coopératif de ce dimère en présence de Mg2+ comme cofacteur cationique. Ce rôle n'est pas essentiel en présence de Mn2+. L'étude de l'IN de PFV-1, un spumavirus, plus soluble, nous a permis de mettre en évidence une reconnaissance préférentielle de l'extrémité processée de l'ADN viral par cette IN, cette propriété n'avait jamais été observée pour l'IN du VIH-1 car elle était masquée par sa propension à l'agrégation. Nous avons également montré que ces deux IN rétrovirales réalisent le 3'-processing suivant un mécanisme catalytique lent de type « single turn-over ».

Les protéines intrinsèquement désordonnées (IDP), dépourvues d’une structure rigide et stable, constituent une classe de protéines diverses et fonctionnellement importantes. La résonance magnétique nucléaire (RMN) est une technique spectroscopique bien établie pour caractériser les propriétés conformationnelles et dynamiques des IDP avec une résolution atomique. L’espace conformationnel, en général large et varié, des IPD en fait une cible difficile pour la biologie structurale dont le but est de déterminer avec précision et exactitude les propriétés structurales, dynamique et physico-chimiques qui sous-tendent la fonction des macromolécules biologiques. Ce manuscrit présente une étude biophysique détaillée de la région intrinsèquement désordonnée (IDR) du facteur de transcription Engrailed-2, avant tout par RMN. Après une présentation de cette homéoprotéine, nous décrivons les protocoles d’expression et de purification de cette protéine isotopiquement marquée. Nous introduisons ensuite une nouvelle approche pour la caractérisation des mouvements pico- et nanoseconde des protéines intrinsèquement désordonnées à partir de données de relaxation des spins nucléaires enregistrées à plusieurs champs magnétiques. Les effets de relaxation paramagnétique (PRE) ont été utilisés pour identifier des interactions transitoires entre la région désordonnée et l’homéodomaine d’Engrailed-2. L’interaction d’Engrailed-2 avec l’ADN a été étudiée en détail en utilisant l’anisotropie de fluorescence sur une série de constructions de la protéine, afin de mettre en lumière le rôle de la partie désordonnée dans l’interaction avec l’ADN. Nous avons également employé la résonance paramagnétique électronique pour tenter de détecter une interaction potentielle entre le noyau hydrophobe de l’hexapeptide dans la région désordonnée et l’homéodomaine. Les couplages dipolaires résiduels (RDC) dans les paires 1H-15N, Cα-Hα et Cα-C′ ont également été mesurés sur des échantillons d’Engrailed en milieu anisotrope. Ces données seront essentielles pour reconstituer l’espace conformationnel d’Engrailed 2. L’ensemble des approches présentées a permis de constituer un socle solide de connaissances qui permettent de mieux comprendre les propriétés conformationnelles, dynamiques et fonctionnelles de l’IDR d’Engrailed-2. / Intrinsically Disordered Proteins (IDPs), which lack a stable rigid structure constitute a large and functionally important class of proteins. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) is a well-established technique to characterize the structural and dynamical features of IDPs at atomic resolution. The broad conformational space of IDPs makes them challenging targets for structural biology to define their precise structural features and motions, the physical and chemical properties that underlie their biological functions. The present thesis establishes biophysical investigation of the disordered region of the transcription factor Engrailed-2 (13.5 kDa) primarily by NMR. After describing the protocol of expression and purification of the isotopically labeled protein, we present a novel approach to characterize the pico – nano second motions in IDPs using nuclear spin relaxation data at multiple fields. Paramagnetic Relaxation Enhancements (PREs) are used to identify transient long-range interactions between the disordered region and the folded homeodomain of Engrailed-2. Binding to DNA was studied by fluorescence anisotropy and highlights the role of the disordered region in the DNA binding. We used Electron Paramagnetic Resonance (EPR) to probe the potential interaction between the hydrophobic cluster (hexapeptide) in the disordered region and the homeodomain. The one-bond 1H-15N, Cα-Hα and Cα-C′ residual dipolar couplings (RDCs) measured for Engrailed-2 provide important constraints for the refinement of the conformational space of Engrailed_2. All these approaches provide valuable insights in understanding the structural, dynamical and functional properties of this IDP.

L’élucidation des interactions non-covalentes des complexes biologiques revêt d’une importance majeure dans la compréhension du fonctionnement cellulaire. L’objectif de ce travail de thèse est d’approfondir les développements de la spectrométrie de masse (MS) pour l’étude de ces complexes, que ce soit par MALDI-MS (la désorption-ionisation laser assistée par matrice) ou par ESI-MS (l’ionisation électrospray). Ce travail s’est articulé autour de trois axes : i) étude de la stœchiométrie et de la topologie du complexe SAGA HAT (Spt-Ada-Gcn5 Acétyltransferase, module Histone Acétyl Transferase) par pontage chimique couplé à la MS ; ii) suivi de la dimérisation des complexes formés par RAR-RXR (récepteur de l’acide rétinoïque - récepteur X des rétinoïdes) avec différents ADNs ; iii) mesure de la constante de dissociation des complexes RXR-ligand. Les méthodologies développées ont permis de repousser le potentiel de la MS et d’obtenir des informations structurales des complexes biologiques. / Elucidation of non-covalent interactions of biological complexes takes on great importance for the understanding of cellular function. The purpose of this thesis is a further development of mass spectrometry (MS) for the study of these complexes, either by MALDI-MS (matrix-assisted laser desorption-ionization) or by ESI-MS (electrospray ionization). This work was focused on three main lines: i) study of the stoichiometry and the topology of SAGA HAT (Spt-Ada-Gcn5 Acetyltransferase, Histone Acetyl Transferase module) complex by chemical cross-linking coupled to MS; ii) monitoring the dimerization of the complexes formed by RAR-RXR (retinoic acid receptor - retinoid X receptor) with different DNAs; iii) measuring the dissociation constant of RXR-ligand complexes. The developed methodologies made it possible to expand the potential of MS and get insight into structure of biological complexes.