Inledning Alltsedan psykiatrins avinstitutionalisering tog fart under 1980- och 1990-talen har en utveckling av samhällsbaserade psykosociala insatser förespråkats för att erbjuda vård och stöd till personer med psykisk funktionsnedsättning. Insatserna förväntas bidra till att brukarna får tillgång till effektiv vård och stöd, samtidigt som de inkluderas i samhället. Vidare förutsätts insatserna baseras på kunskap och evidens, samt bygga på brukarens delaktighet och stödja dennes återhämtning. En annan målsättning är att vissa insatser ges i form av integrerade modeller, så att personer ur målgruppen får tillgång till sammanhållet stöd från inblandade myndigheter. Även om Sverige räknas som ett resursstarkt land som har kommit långt på området, så förekommer kritik mot utvecklingen. Kritiken har berört både planering och styrning på politisk nivå, men även utförandet av de insatser som erbjuds till brukarna. Kritiken har bland annat handlat om bristande samverkan mellan landsting och kommuner, och om stora lokala variationer i den erbjudna servicens kvalitet. I den här avhandlingen studeras dels utformningen av policy på området, dels implementering av specifika insatser. Syftet med avhandlingen är att undersöka hur svenska policymakare på nationell nivå har hanterat utvecklingen av psykosociala insatser för personer med psykisk funktionsnedsättning, samt att analysera möjligheter och svårigheter för organisationer och personal när det gäller att implementera de insatser som förespråkas av beslutsfattare. De frågeställningar som avhandlingen söker besvara är följande: Hur formuleras policy som syftar till att införa samhällsbaserade psykosociala insatser, och vad kan policyns egenskaper innebära för genomförandet av den? Vilka styrstrategier uttrycks i statliga policydokument? Vad hämmar respektive underlättar implementeringen av föreslagna integrerade psykosociala insatser? Hur kan vi förstå vad som påverkar möjligheten att erbjuda integrerade psykosociala insatser, i termer av lokala förutsättningar och strategier för implementering? Metod Policy på området studerades genom en studie av tre av de övergripande dokument som beslutats på regeringsnivå de senaste 20 åren. Riktade kvalitativa innehållsanalyser baserade på relevant litteratur genomfördes. Implementering av insatser studerades genom att 15 program följdes under 3 års tid. 14 av dessa arbetade med att implementera arbetsrehabiliteringsprogram utifrån modellen Individual Placement and Support (IPS). Under samma tidsperiod följdes ett team som implementerade den intensiva samordnings-, vård- och stödmodellen Assertive Community Treatment (ACT). För att bedöma verksamheternas följsamhet till modellerna genomfördes programtrohetsskattningar av samtliga program. Data avseende programmens målgrupp samlades också in. Tre IPS-program deltog i en fördjupningsstudie där kvalitativa intervjuer genomfördes med ledare, personal och samverkanspartners. Implementeringen av dessa program analyserades utifrån implementeringsramverket the Consolidated Framework for Implementation Research. Implementeringen av samtliga 14 IPS-program studerades med hjälp av skattningsskalan the Sustainable Implementation Scale (SIS). När det gäller ACT-teamet genomfördes dels kvalitativa innehållsanalyser av djupintervjuer, och dels skattningar av implementeringskomponenter med hjälp av SIS. Resultat Policy på området har innehållit stora mått av otydlighet och konflikt, både gällande de mål och medel som har formulerats. Regeringen har främst förespråkat så kallade mjuka styrstrategier, vanligen i form av statliga stimulansbidrag. Vissa förtydliganden och konkretioner har skett under tid, vilka ibland går i linje med de internationella rörelserna New Public Management och evidensbaserad praktik. Exempel på försök att strama upp styrningen är målformuleringar som förespråkar riktade och prestationsbaserade stimulansbidrag, samt nationella riktlinjer för att styra utvecklingen mot utvalda specificerade insatser. Trots detta är det fortfarande de berörda myndigheterna som är ansvariga för att välja ut, utforma och implementera psykosociala insatser. På verksamhetsnivå leder detta till att många otydligheter består, vilka ibland är relaterade till svårigheter att avgränsa ansvarsområden och att förändra hindrande regelverk och traditioner. Dessutom förekommer konflikter, exempelvis i form av konkurrerande målsättningar och ojämn resurstilldelning. Studierna av de integrerade modellerna IPS och ACT visar att implementering av dessa är möjlig, även i en sektoriserad välfärdskontext som den svenska. Det finns dock en rad faktorer på såväl organisationsnivå som teamnivå, som försvårar implementeringen. Exempel på dessa är de involverade organisationernas varierande målsättningar och traditioner, regelverkens utformning, samt svårigheter att erhålla långsiktig finansiering. I en del fall beskrivs de arbetssätt som modellerna förespråkar som försvårande, då de upplevs som annorlunda och utmanande för existerande rutiner och uppfattningar om stöd till målgruppen. Ett stort hinder för effektiv implementering är svårigheter att samverka, främst mellan, men även inom inblandade organisationer. De flesta program som lyckades genomföra en hållbar implementering hade personal som var duktiga på att navigera förbi de hinder som orsakades av ogynnsamma regler, och de lyckades även hitta vägar för att etablera samverkan, både horisontellt (med samarbetspartners på samma hierarkiska nivå) och vertikalt (mellan ledning och personal). En verksamhetsledare som har möjlighet att påverka samverkansrelationer i både horisontell och vertikal riktning är gynnande för implementeringen. Andra betydelsefulla komponenter som underlättar implementering är en noggrann planering innan ett program startas, medveten rekrytering av personal, formering av ändamålsenliga styrgrupper, samt att tidigt i processen arbeta strategiskt för att lösa finansieringsfrågan. Även programtrohetsskattningar var betydelsefulla, då de både fungerade som instrument för att identifiera förbättringsområden för programmen, men också hade en legitimerande funktion vid återkoppling till ledningen. Slutsatser Det råder en samstämmighet i övergripande målsättningar som syftar till att utveckla området integrerade psykosociala insatser. På en mer konkret nivå är läget betydligt oklarare, både gällande målsättningar i policy och av vem och hur insatserna ska implementeras. Även om vissa förändringar skett, står regeringen fortsatt för en mjuk styrning vilken lämnar ett stort ansvar till de myndigheter som ska implementera valda insatser. Detta innebär en rad svårigheter för frontlinjepersonalen, vilket leder till att de ofta behöver lägga mycket tid och energi på att hitta vägar för att överkomma dessa svårigheter. I många fall har ledare och personal goda möjligheter att uppnå en hög programtrohet på teamnivå, men för en hållbar implementering krävs det att ett program är väl förankrat både vertikalt och horisontellt. Därför finns ett behov av att forskare och beslutsfattare tar ett tydligare helhetsgrepp, både på området policy och implementering av specifika insatser. Skattningar av programtrohet och implementering kan vara ett stöd i att identifiera vad som fungerar samt vad som behöver förändras i och mellan organisationer. Men för att programmen ska lyckas med en effektiv implementering på organisationsnivå behöver deras legitimitet stärkas vertikalt, och planering för långsiktig lokal finansiering behöver göras i ett tidigt skede. / Introduction Since the deinstitutionalization of psychiatry started in the 1980’s, the field of psychiatry has moved in the direction of community-based psychosocial interventions for people with mental illnesses. The interventions selected should be based on knowledge and evidence, and support the users’ empowerment and recovery. In addition, some of the services should be provided in forms of integrated models, meaning that all agencies involved should provide cohesive care and support. Two examples of such interventions are the occupational rehabilitation program Individual Placement and Support (IPS) and the intensive case management model Assertive Community Treatment (ACT). Although Sweden is considered a high-resource country, the availability of psychosocial services has been criticized. This criticism has been related to policymaking as well as the quality of the services provided. Examples of areas considered problematic include collaboration deficiencies among disparate human service organizations and substantial local variations in available types of services. This thesis aims to examine how national-level policymakers in Sweden have handled the development of psychosocial support and to analyze facilitators and barriers experienced by these organizations in their implementation of community-based and integrated models. The research questions are as follows: -       How have policies concerning community-based psychosocial interventions been formulated and how do the characteristics of these policies affect the implementation of its goals? -       How do different types of steering strategies influence national-level policy implementation proposals? -       Which facilitators and barriers to effective implementation of proposed integrated interventions can be identified? -       How can the ability to provide integrated psychosocial interventions be explained in terms of local conditions and strategies used for implementation? Methods A study of community mental health policy covering three of the major documents published at the national level from the last 20 years was performed. Directed content analysis based on literature relevant for the research area was used. In order to study the implementation of the selected interventions, 15 programs were followed for a three-year period. 14 of these programs were implementing IPS and the other one implemented ACT. In order to monitor the programs’ adherence to the selected models, program fidelity assessments were performed. Data on the programs’ target groups were collected. Three of the IPS-programs participated in an in-depth study where qualitative interviews with leaders, staff, and collaboration partners were performed. The implementation of the three programs were analyzed utilizing the Consolidated Framework for Implementation Research. All of the 14 IPS programs were included in an implementation study where the Sustainable Implementation Scale (SIS) was used to identify facilitators and barriers to implementation. In the study of the ACT team, qualitative directed content analysis of in-depth interviews and SIS-assessments were performed. After three years, the sustainability of all programs was assessed. Results Mental health policies have involved high levels of ambiguity and conflict in relation to both the goals and the means. The government has prioritized soft steering strategies, usually in the form of financial stimulus grants. Over time, these policies have (at least to some degree) been clearer when psychosocial interventions are being described. In addition, the development of policy has led to harder steering strategies, illustrated by targeted and performance-based grants and the advocacy of national guidelines to steer agencies towards preferred interventions. Despite these changes, independent agencies are still responsible for selection, framing, and implementation of the interventions. Implementation of the integrated models IPS and ACT is possible, even in the context of a sectored welfare system such as Sweden.  However, there are a number of implementation barriers at the organizational and team levels. Obstructive factions include involved agencies disparate traditions and regulations, as well as the programs’ difficulties in securing long-term funding. Some of the staff interviewed considered the characteristics of the interventions as problematic since they challenged existing routines and views about support of the target group. Another critical component was the ability to establish collaboration, both horizontally (with partners at the same hierarchical level), and vertically (between management and staff). A team leader with the mandate to influence interactions horizontally and vertically is therefore a facilitating factor. In most of the programs that managed to perform a sustainable implementation of the models, a critical success factor was found to be staffs’ ability to navigate around a variety of barriers. Additional facilitators to successful implementation was careful planning before the start-up of a program, effective staff recruitment, the formation of a dedicated steering group, and a plan for local funding early in the implementation process. Regularly-performed program fidelity assessments were also noted as an important means to identify improvement opportunities for the programs. Collectively, these components served as tools to increase the programs’ legitimacy since the team leaders used them to provide feedback to the local decision makers. Conclusions At an abstract level, there is general agreement of the overarching needs in the area of integrated psychosocial interventions, but there are discrepancies when it comes to how to best convert this shared definition of need into concrete psychosocial interventions. The majority of steering strategies used are still considered ‘soft’, which leaves much of the responsibility to the implementing agencies.  At a grass-root level this leads to several difficulties, including unclear responsibility definitions and collaboration challenges between agencies. Instead of prioritizing the work with their clients, the staff are forced to put a lot of time and energy into solving these problems. In most cases, team leaders and staff are able to reach high program fidelity at a team level. However, a sustainable implementation demands that a program has been anchored both vertically and horizontally. There is a need for a holistic approach by researchers and decision makers, both in the area of policymaking and implementation of selected psychosocial interventions. Assessments of program fidelity and implementation have the potential to help agencies identify strengths and opportunities for growth both within each entity and between involved organizations. In order to implement the selected models successfully at an organizational level, the programs´ vertical legitimacy has to increase, and plans for long-term local funding strategies have to be initiated early in the implementation process.

This thesis deals with the design of LED matrix array contains 150 LEDs. In the first part, the thesis identifies source of light like OLED and LED and provide an overview of their lifetime, reliability and basic principle of design systems with LEDs. The thesis then describe design of LED matrix array, deals with power supply of this LED array and with cooling of LED. Finally the thesis describes a software for contol of LED matrix array.

V dnešnom svete zrýchľujúcej sa sieťovej prevádzky je potrebné držať krok v jej monitorovaní . Dostatočný prehľad o dianí v sieti dokáže zabrániť rozličným útokom na ciele nachádzajúce sa v nej . S tým nám pomáhajú systémy IDS, ktoré upozorňujú na udalosti nájdené v analyzovanej prevádzke . Pre túto prácu bol vybraný systém Suricata . Cieľom práce je vyladiť nastavenia systému Suricata s rozhraním AF_PACKET pre optimálnu výkonnosť a následne navrhnúť a implementovať optimalizáciu Suricaty . Výsledky z meraní AF_PACKET majú slúžiť ako základ pre porovnanie s navrhnutým vylepšením . Navrhovaná optimalizácia implementuje nové rozhranie založené na projekte Data Plane Development Kit ( DPDK ). DPDK je schopné akcelerovať príjem paketov a preto sa predpokladá , že zvýši výkon Suricaty . Zhodnotenie výsledkov a porovnanie rozhraní AF_PACKET a DPDK je možné nájsť na konci diplomovej práce .

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Background: Elucidating the lithium disilicate system like the popular IPS e.max® CAD (LS2), made specifically for Computer-Aided Design and Computer-Aided Manufacturing (CAD-CAM), as a function of temperature unravels new ways to enhance material properties and performance. Objective: To study the effect of various thermal processing on the crystallization kinetics, crystallite microstructure, and strength of LS2. Methods: The control group of the LS2 samples was heated using the standard manufacturer heating-schedule. Two experimental groups were tested: (1) an extended temperature range (750-840 °C vs. 820-840 °C) at the segment of 30 °C/min heating rate, and (2) a protracted holding time (14 min vs. 7 min) at the isothermal temperature of 840 °C. Five other groups of different heating schedules with lower-targeted temperatures were evaluated to investigate the microstructural changes. For each group, the crystalline phases and morphologies were measured by X-ray diffraction (XRD) and scanning electron microscope (SEM) respectively. Differential scanning calorimeter (DSC) was used to determine the activation energy of LS2 under non-isothermal conditions. A MTS universal testing machine was used to measure 3-point flexural strength and fracture toughness, and elastic modulus and hardness were measured by the MTS Nanoindenter® XP. A one-way ANOVA/Tukey was performed per property (alpha = 0.05). Results: DSC, XRD, and SEM revealed three distinct microstructures during LS2 crystallization. Significant differences were found between the control group, the two aforementioned experimental groups, and the five lower-targeted-temperature groups per property (p<0.05). The activation energy for lithium disilicate growth was 667.45 (± 28.97) KJ/mole. Conclusions: Groups with the extended temperature range (750-840 °C) and protracted holding time (820-840 °C H14) produced significantly higher elastic-modulus and hardness properties than the control group but showed similar significant flexural-strength and fracture-toughness properties with the control group. In general, explosive growth of lithium disilicates occurred only when maximum formation of lithium metasilicates had ended.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(人間・環境学) / 甲第19804号 / 人博第775号 / 新制||人||187(附属図書館) / 27||人博||775(吉田南総合図書館) / 32840 / 京都大学大学院人間・環境学研究科共生人間学専攻 / (主査)教授 ﾍﾞｯｶｰ,ｶｰﾙ, 教授 新宮 一成, 准教授 永田 素彦, 准教授 児玉 聡 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Human and Environmental Studies / Kyoto University / DGAM

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第20079号 / 医博第4172号 / 新制||医||1018(附属図書館) / 33195 / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 井上 治久, 教授 宮本 享, 教授 林 康紀 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Hintergrund: Das Baraitser-Winter-Zerebro-Fronto-Faziale-Syndrom (BWCFF-S) gehört mit einer Prävalenz von 1:1.000.000 zu den sehr seltenen genetischen Krankheiten und wird durch Missense-Mutationen in den Genen ACTB und ACTG1, die die zytoplasmatischen Aktin-Isoformen βCYA und γCYA kodieren, verursacht. Neben multiplen fazialen Dysmorphien und Skelettfehlbildungen weisen bis zu 70 % der Patient*innen kortikale Malformationen wie Mikrozephalie und Lissenzephalie auf, deren ursächlichen Pathomechanismen bisher noch nicht erforscht wurden. Ebenso wenig ist über das Expressionsmuster von βCYA und γCYA im humanen Gehirn während der embryonalen Entwicklung bekannt. Die Generierung von zerebralen Organoiden durch Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen (induced pluripotent stem cells, iPS-Zellen), die aus primären Zellen von Patient*innen reprogrammiert werden können, eröffnet neue Möglichkeiten, die Neurogenese und Kortikogenese zu studieren sowie zelluläre Krankheitsmodelle zu entwickeln. Material und Methoden: Das Expressionsmuster von βCYA und γCYA wurde mittels Immunfluoreszenz in humanem fetalem Gehirngewebe sowie zerebralen Organoiden charakterisiert. Aus den iPS-Zelllinien der BWCFF-S-Patientinnen mit Mutationen in jeweils einem Aktin-Gen (ACTB p.Thr120Ile und ACTG1 p.Thr203Met) sowie gesunden Kontrollen wurden unter der Verwendung von zwei Protokollen nach gerichteter und ungerichteter Differenzierung zerebrale Organoide generiert und diese charakterisiert. Mithilfe des CRISPR/Cas9-Systems wurden die gleichen Mutationen in ACTB und ACTG1 in iPS-Zellen der Kontroll-Zelllinien CRTDi011-A und SC102A-1 editiert. Zerebrale Organoide, die nach dem ungerichteten Protokoll differenziert wurden, wurden durch Immunfluoreszenz- und TEM-Analysen hinsichtlich ihrer Zytoarchitektur, Zelltypen und Aktin-Verteilung untersucht. Außerdem wurden Apoptose, Proliferation und Ausrichtung der Zellteilungsebenen der apikalen Progenitorzellen analysiert. Unter Verwendung der RNA-Einzelzell-Sequenzierung wurden die Zellpopulationen von zerebralen BWCFF-S- und Kontroll-Organoiden an zwei unterschiedlichen Kultivierungs-Zeitpunkten analysiert. Zudem wurden Kontroll-iPS-Zellen in neurale Progenitorzellen (neural progenitor cells, NPCs) differenziert, um die intrazelluläre Lokalisierung der Aktin-Isoformen mit Immunfluoreszenz-Analysen zu bestimmen. Unter Durchführung von Migrationsassays mit Neurospäroiden und zerebralen Organoiden wurden die Migrationseigenschaften der neuralen BWCFF-S-Zellen untersucht. Ergebnisse: In dieser Arbeit wurde das Expressionsmuster der Aktin-Isoformen βCYA und γCYA im humanen fetalen Gewebe, in zerebralen Organoiden sowie in NPCs und Neuronen analysiert. Im humanen fetalen Gewebe und in den zerebralen Organoiden zeigte sich ein überlappendes Expressionsmuster von beiden Isoformen in allen Schichten des Neokortex. Im Gegensatz dazu wiesen Immunfluoreszenz-Färbungen in kultivierten NPCs und Neuronen eine Isoform-spezifische Lokalisierung von βCYA und γCYA auf, mit einer Anreicherung von βCYA im Zellkortex und in den Zellfortsätzen der NPCs, wohingegen γCYA im Zytosol angereichert war. In Neuronen wurde eine stärkere Lokalisierung von βCYA im Wachstumskegel und von γCYA in den Neuriten festgestellt. Zudem wurde die Kultur zerebraler Organoide für die Modellierung des BWCFF-S erfolgreich etabliert. BWCFF-S-Organoide waren im Vergleich zur Kontrolle in ihrer Gesamtgröße signifikant reduziert und zeigten auch kleinere ventrikulären Zonen (VZs) in den Ventrikel-ähnlichen Strukturen. Als Ursache für diese Größenunterschiede konnte die veränderte Ausrichtung der Teilungsebene der apikalen Progenitorzellen (APs) in der Anaphase von vertikal zu horizontal und damit der Wechsel von symmetrischer zu asymmetrischer Teilung festgestellt werden, im Zusammenspiel mit einer abnormalen Anreicherung von Mikrotubuli an der ventrikulären Oberfläche in den Ventrikel-ähnlichen Strukturen. Die RNA-Einzelzell-Sequenzierung der zerebralen Kontroll- und BWCFF-S-Organoide zeigte eine Veränderung der Zellpopulation mit einer reduzierten Anzahl von radialen Gliazellen (RGs) und Neuronen in den BWCFF-S-Organoiden. Die BWCFF-S-ähnlichen Organoide mit der Mutation ACTB p.Thr120Ile, die durch Gen-Editierung der Kontroll-Zelllinie CRTDi011-A generiert wurden, zeigten nahezu in allen Analysen vergleichbare Ergebnisse wie die Patientinnen-eigenen BWCFF-S-Organoide mit derselben Mutation und belegten somit, dass sich durch Verwendung des CRISPR/Cas9-Systems isogene Kontrollen herstellen lassen. Durch Migrationsassays mit Neurosphäroiden und Organoiden konnte eine gravierend veränderte Migration der neuralen BWCFF-S-Zellen mit der Mutation ACTB p.Thr120Ile festgestellt werden. Schlussfolgerung: Die Modellierung des BWCFF-S in den zerebralen Organoiden entschlüsselte den zellulären Pathomechanismus der mikrozephalen kortikalen Malformation. Die Veränderung der Ausrichtung der mitotischen Spindel in den APs und dem dadurch entstehenden Wechsel von symmetrischer zu asymmetrischer Teilung führt zu einer Reduktion des Progenitorzellpools und einer verfrühten Neurogenese. Die verringerte Anzahl der Progenitorzellen in der VZ der zerebralen Organoide spiegelt sich in der verminderten Größe der VZs wider. Beide BWCFF-S-assoziierten Mutationen in den Genen ACTB und ACTG1 führten zu einer veränderten Ausrichtung der Teilungsebene in den APs. Die deutliche Einschränkung der neuralen Migration wurde jedoch nur bei Zellen mit der Mutation ACTB p.Thr120Ile festgestellt, was einen ersten Hinweis auf die Isoform-spezifische Funktion der beiden Aktinproteine liefert.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis V Abbildungsverzeichnis X Tabellenverzeichnis XIII 1. Einleitung 1 1.1. Baraitser-Winter-Zerebro-Fronto-Faziales-Syndrom 1 1.1.1. Das klinische Bild und genetische Ursachen 1 1.1.2. Neurologische Symptome und kortikale Malformationen beim BWCFF-S 3 1.2. Aktin 5 1.2.1. Die sechs Aktin-Isoformen 5 1.2.2. Das Aktin-Zytoskelett 5 1.2.3. Die Funktionen des Aktin-Zytoskeletts 8 1.2.4. Das Aktin-Zytoskelett im zentralen Nervensystem (ZNS) 10 1.3. Neuro- und Kortikogenese des humanen Gehirns 12 1.4. Zerebrale Organoide als Modellsysteme für neurologische Entwicklungsstörungen 15 1.5. Ziele dieser Arbeit 20 2. Material 21 2.1. Geräte und Verbrauchsmaterialien 21 2.2. Chemikalien und Kits 23 2.3. Lösungen für die Molekularbiologie 25 2.4. Medien für die Zellkultur 25 2.5. Puffer und Lösungen für Immunfluoreszenz-Analysen 27 2.6. Primer 28 2.7. Guide RNAs (gRNAs), Templates und Cas9 28 2.8. Primäre Antikörper 29 2.9. Sekundäre Antikörper und DNA-Fluoreszenzfarbstoff 30 2.10. Zelllinien 30 2.11. Humanes fetales Gehirngewebe 32 2.12. Software 33 3. Methoden 34 3.1. Molekularbiologische Methoden 34 3.1.1. DNA-Isolierung 34 3.1.2. Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) 34 3.1.3. Gelelektrophorese 35 3.1.4. Aufreinigung der PCR-Produkte 35 3.1.5. Sanger-Sequenzierung 36 3.2. Induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) 36 3.2.1. Reprogrammierung von dermalen Fibroblasten in iPS-Zellen 36 3.2.2. Kultivierung der iPS-Zellen 37 3.2.3. Gen-Editierung der iPS-Zellen mit CRISPR/Cas9 37 3.3. Differenzierung von iPS-Zellen in neurale Progenitorzellen (neural progenitor cells, NPCs) und Neurone 39 3.3.1. Kultivierung von Neuronen im XonaChip® 39 3.4. Differenzierung von iPS-Zellen in Vorderhirn-Organoide (forebrain organoids) 40 3.5. Differenzierung von iPS-Zellen in zerebrale Organoide (whole brain organoids) 42 3.6. Migrationsassay mit Neurosphäroiden 43 3.7. Migrationsassay mit zerebralen Organoiden (radiale Migration) 44 3.8. Immunfluoreszenz-Analysen 44 3.8.1. Färbeprotokoll für βCYA und γCYA in Einzelzellen, Organoiden und humanem fetalem Gewebe 45 3.8.2. Protokoll für Immunfluoreszenz-Färbungen mit Antigen-Demaskierung durch Sieden 45 3.9. Mikroskopie 46 3.10. Bildanalyse und Datenerhebung 46 3.10.1. Bildbearbeitung der Immunfluoreszenz-Aufnahmen für die Analyse der Verteilung von βCYA und γCYA in Einzelzellen, zerebralen Organoiden und humanem fetalen Gehirngewebe 46 3.10.2. Bildbearbeitung der Immunfluoreszenz-Aufnahmen von Einzelzellen und zerebralen Organoide 47 3.10.3. Quantifizierungen verschiedener Größen der zerebralen Organoide 47 3.10.4. Bildbearbeitung der Aufnahmen der zerebralen Organoide nach dem Migrationsassay 49 3.11. Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) 49 3.12. RNA-Einzelzell-Sequenzierung von zerebralen Organoiden 50 3.13. Analyse der RNA-Einzelzell-Sequenzierdaten der zerebralen Organoide 50 3.14. Statistik 51 4. Ergebnisse 53 4.1. Bestätigung der pathogenen Aktin-Varianten in den Patientinnen-spezifischen iPS- und editierten iPS-Zelllinien 53 4.2. Die beiden Aktin-Isoformen βCYA und γCYA zeigen ein überlappendes Expressionsmuster im humanen fetalen Gewebe des Neokortex 55 4.3. Isoform-spezifische intrazelluläre Anreicherung von βCYA und γCYA in neuralen Progenitorzellen (neural progenitor cells, NPCs) und Neuronen 58 4.4. Gehirn-Organoide als Krankheitsmodell für die BWCFF-S-assoziierten kortikalen Malformationen 62 4.4.1. Das Vorderhirn-Protokoll konnte nicht reproduziert werden 62 4.4.2. Differenzierung von Kontroll- und BWCFF-S-iPS-Zelllinien in zerebrale Organoide nach dem Lancaster-Protokoll und erfolgreiche Etablierung des Organoidmodells für Analysen des zellulären Pathomechanismus des BWCFF-S 63 4.5. Zerebrale BWCFF-S-Organoide rekapitulieren die mit dem BWCFF-S-assoziierte Mikrozephalie 64 4.5.1. Die Analyse der Lokalisierung von βCYA und γCYA zeigt keine Unterschiede zwischen zerebralen Kontroll- und BWCFF-S-Organoiden und ist ähnlich der Verteilung im humanen fetalen Neokortex 67 4.5.2. Zerebrale BWCFF-S-Organoide sind signifikant kleiner im Vergleich zu Kontroll-Organoiden 70 4.5.3. BWCFF-S-Organoide zeigen eine signifikant verminderte Größe der Ventrikel-ähnlichen Strukturen mit reduzierter Anzahl der Progenitorzellen 75 4.5.4. BWCFF-S-Organoide zeigen keine Unterschiede in Proliferation und Apoptose im Vergleich zu Kontroll-Organoiden 78 4.5.5. Apikale Progenitorzellen (APs) von BWCFF-S-Organoiden teilen sich vermehrt horizontal statt vertikal 81 4.5.6. Geneditierte BWCFF-S-ähnliche Organoide zeigen ebenfalls eine Veränderung in der Ausrichtung der Zellteilungsebene im Vergleich zur Kontrolle 82 4.5.7. BWCFF-S-Organoide zeigen eine veränderte Morphologie des Adhäsions-Verbindungsgürtels mit apikaler Anreicherung von Mikrotubuli in Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM)- und Immunfluoreszenz-Analysen 85 4.5.8. Geneditierte BWCFF-S-ähnliche Organoide zeigen ebenfalls eine abnormale Morphologie des Adhäsions-Verbindungsgürtels mit einer Anreicherung von Mikrotubuli an der apikalen Oberfläche der VZ 89 4.6. BWCFF-S-NPCs zeigen ein abnormales Migrationsver-halten im Neurosphäroid-Migrationsassay 91 4.7. Zerebrale BWCFF-S-Organoide mit ACTB p.Thr120Ile zeigen kaum Migration von neuralen Zellen 93 4.8. Die RNA-Einzelzell-Sequenzierung zeigt Veränderungen in den Zellpopulationen von BWCFF-S-Organoiden und eine reduzierte Anzahl der RGs und Neurone 96 5. Diskussion 106 5.1. βCYA und γCYA zeigen in Gewebeschnitten des humanen fetalen Neokortex sowie zerebralen Organoiden ein überlappendes Expressionsprofil, weisen aber intrazellulär eine Isoform-spezifische Anreicherung auf 107 5.2. Zerebrale Organoide eignen sich für die Modellierung der mit dem BWCFF-S-assoziierten kortikalen Malformationen 108 5.3. Die asymmetrische, horizontale Zellteilung von APs in BWCFF-S-Organoiden führt zu einer vorzeitigen Neurogenese und erklärt die mit dem BWCFF-S-assoziierte Mikrozephalie 110 5.4. Die Änderung der Orientierung der mitotischen Spindel in den apikalen Progenitorzellen weist auf eine gestörte Interaktion zwischen Mikrotubuli und dem Aktin-Zytoskelett hin 113 5.5. Die BWCFF-S-Organoide zeigen keine grundlegenden strukturellen Veränderungen der AJ 114 5.6. Editierte BWCFF-S-ähnliche Organoide mit cr. ACTB p.Thr120Ile zeigen eine ähnliche Pathologie wie BWCFF-S-Organoide mit ACTB p.Thr120Ile 115 5.7. Limitationen des zerebralen Organoidmodells müssen bei der Krankheitsmodellierung berücksichtig werden 117 5.8. Die BWCFF-S-Mutation ACTB p.Thr120Ile führt zu Migrationsstörungen von neuralen Zellen 119 5.9. BWCFF-S-Organoide haben eine reduzierte Anzahl von RGs und Neuronen 120 6. Ausblick 123 7. Zusammenfassung 125 8. Summary 128 9. Literaturverzeichnis 130 10. Anhang 142 10.1. Charakterisierung der reprogrammierten und editierten iPS-Zellklone 142 10.2. Auswertungsstrategie für die intrazelluläre Verteilung von βCYA und γCYA in NPCs und Neuronen 146 10.3. Werte der Winkel der Zellteilungsebenen der APs in der Anaphase 146 10.4. Immunfluoreszenz-Analysen des Adhäsions-Verbindungs-gürtels 148 10.5. Zusätzliche Daten der RNA-Einzelzell-Sequenzierung 149 11. Danksagung i 12. Veröffentlichungen iv 13. Erklärung zum Antrag auf Eröffnung des Promotionsverfahrens vi 14. Eidesstattliche Versicherung vii

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / In order to develop effective cures for diseases and decipher disease pathology, the need exists to cultivate a better understanding of human development. Existing studies employ the use of animal models to study and model human development and disease phenotypes but the evolutionary differences between humans and other species slightly limit the applicability of such animal models to effectively recapitulate human development. With the development of human pluripotent stem cells (hPSCs), including Human induced Pluripotent stem cells (hiPSCs) and Human Embryonic Stem cells (hESCs), human development can now be mirrored and recapitulated in vitro. These stem cells are pluripotent, that is, they possess the potential to generate any cell type of the body including muscle cells, nerve cells or blood cells. One of the major focuses of this study is to use hiPSCs to better understand and model human retinogenesis. The retina develops within the first three months of human development, hence rendering it inaccessible to investigation via traditional methods. However, with the advent of hiPSCs, retinal cells can be generated in a culture dish and the mechanisms underlying the specification of a retinal fate can be determined. Additionally, in order to use hiPSCs for successful cell replacement therapy, non-xenogeneic conditions need to be employed to allow for fruitful transplantation tests. Hence, another emphasis of this study has been to direct hiPSCs to generate retinal cells under non-xenogeneic conditions to facilitate their use for future translation purposes.

Text in Afrikaans / In hierdie verhandeling onderneem die navorser 'n teoretiese en filosofiese studie, binne 'n penologiese perspektief, ten einde 'n ondersoek na korrektiewe toesig as 'n alternatiewe strafvorm te bepaa] • Kennis en insig wat sodoende ingesame] is, kan aangewend word om die stelsel in Suid-Afrika te hevorder. Hierdie verhandeling word verdeel in 'n inleiding oor die metodologie en akademjese verantwoording van die studiegebied van penologie, die rasionaal v1r die soeke na alternatiewe vir korttermyngevangenisstraf; die historiese aanloop vir die vestiging van korrektiewe toesig in Suid-Afrika, die funksionering van die korrektiewe toesigstelsel van Suid-Af rika, die funksionering van beide die basiese en intensiewe toesigstelsel (IPS) van die Staat. Georgia <VSA). Die verhandeling word afgesluit met 'n aantal aanbevelings ten opsigte van die toepassing van korrektiewe toesig. / In this dis se rL:i ti on the rPsea t·che r n nde rt.a kes a t heo ret ica l and philosophical study within a penological perspective in order to investigate correctional supPrvision as an alternative form of punishment. Knowledge and insight obtained in this way can be applied to promote this system in Sout_h Africa. The thesis is divided into an introduction relating to the methodology and the academic responsibility of the study area of penology, the rasionale for an alternative form of short term imprisonment, the historical backgro11n<l to the establishment of correctional supervision in South Africa, the functioning of correctional supervision in South Africa, the functioning of both the basic probation system and the intensive probation system in Georgia (USA). This thesis is concluded with a number of recommendations with regard to the implementation of correctional supervision. / Sociology / M.A. (Penology)

自Nelson和Plosser (1982)後，研究經濟資料是否具有單位根現象，已成為近二十年來熱門且重要的課題。因 為資料性質的不同(恆定或非恆定)，對實證計量模型的設定、統計推論以及原理論的發展有深遠的影響。與傳 統探討單一時間數列之單位根的論文不同的是，本篇論文將橫斷面的資料擴大，探討混合型資料的單位根現象 ( Panel Unit Root )。就此課題，文獻上已有兩個不同的檢定方法: Levin、Lin和Chu (1997)的LLC檢定法以及Im、 Pesaran和Shin (1995)的IPS檢定法。 我們的研究，有別於以上兩者，是從「概似比」的角度(likelihood ratio) 和應用檢定共積關係的Johansen (1988)「Trace檢定」，建構新的單位根檢定統計量。首先於文中推導出，「Trace檢定」可用於檢測單一時間數 列的單位根現象。進而，再將橫斷面資料擴大，採用mean group方法，加總平均每個橫斷面時間數列的「Trace 檢定」統計量，形成混合型資料之單位根檢定統計量 。根據中央極限定理，標準化後的 檢定統計量，極限上 收斂至標準常態分配。此外，我們也推導得出 檢定統計量與傳統ADF、LLC以及IPS檢定統計量極限上的關係。 最後，我們以「蒙地卡羅」模擬方法，分析小樣本下「型一誤差」與「檢定力」的表現。發現新的混合型資 料之單位根檢定統計量表現優良，近似於標準常態分配。故在做混合型資料的單位根分析時，採用 檢定統計 量，可得到較精確的推論。