Jaburetox é um peptídeo recombinante (~11 kDa) derivado de uma das isoformas de ureases da planta Canavalia ensiformis, popularmente conhecida como feijão-de-porco. O peptídeo induz efeitos variados em diferentes ordens de insetos, incluindo interferência na contração muscular em baratas da espécie Nauphoeta cinerea, ativação do sistema imunitário do vetor da doença de Chagas, Rhodnius prolixus e também, modula a atividade da enzima UDP-N-acetilglicosamina pirofosforilase (UAP) e da óxido nítrico sintase (NOS) no sistema nervoso central de R. prolixus e Triatoma infestans. Além disso, quando injetado, o Jaburetox é letal para ninfas de R. prolixus e insetos adultos de T. infestans. No presente trabalho foi avaliado o efeito inseticida do Jaburetox em baratas adultas da espécie N. cinerea, assim como, exploramos os efeitos induzidos pelo peptídeo no sistema nervoso central, focando na atividade enzimática das enzimas UAP, NOS, fosfatases ácidas (ACP) e acetilcolinesterase (AChE). Os ensaios enzimáticos foram realizados após tratamentos in vivo e in vitro com o Jaburetox, utilizando homogenatos de sistema nervoso central. Técnicas espectrofotométricas foram utilizadas para mensurar a atividade enzimática e a expressão proteica foi avaliada através de Western blot. Para o ensaio inseticida, Jaburetox foi administrado via oral e via injeção no inseto, utilizando uma dose de 50 μg de Jaburetox por g de inseto, ou o mesmo volume de tampão como controle. Em N. cinerea, ambos os tratamentos, in vivo e in vitro, inibiram parcialmente a atividade da NOS, sem modificar os níveis proteicos da mesma. Nenhuma alteração foi observada nos níveis da ACP após tratamentos com Jaburetox. A enzima UAP apresentou diminuição da atividade após 18 h de tratamento in vivo com o Jaburetox. Além disso, em todos os tratamentos in vivo com o peptídeo foi observado um aumento da atividade da AChE, sugerindo um possível mecanismo de resposta aos inseticidas. Contudo, mesmo após injeção e ingestão de Jaburetox as baratas adultas não tiveram taxas de mortalidade significativas, indicando resistência ao efeito inseticida do peptídeo. Em suma nossos resultados sugerem que o Jaburetox afeta as vias nitrinérgica, assim com a atividade da UAP e da AChE na barata. O fato do peptídeo afetar diferentemente as atividades enzimáticas dos R. prolixus e da N. cinerea podem explicar o porquê as baratas não são susceptíveis ao Jaburetox. / Jaburetox is a recombinant peptide (~11 kDa) derived from one of the Canavalia ensiformis (Jack bean) urease isoforms. The peptide induces several effects on insects of different orders, including the interference on muscle twitch tension in the cockroach Nauphoeta cinerea, the activation of the immune system in the Chagas’ disease vector Rhodnius prolixus, and the modulation of the enzyme activities of the UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase (UAP) and nitric oxide synthase (NOS) in the central nervous system of R. prolixus and the related triatomine Triatoma infestans. Moreover, when injected, the peptide is lethal for R. prolixus nymphs and T. infestans adults. Here, we evaluated the insecticidal effect of Jaburetox on N. cinerea adult cockroaches and explored the effects induced by Jaburetox on the central nervous system, focusing on the enzymatic activities of UAP, NOS, acid phosphatases (ACP), and acetylcholinesterase (AChE). The enzymatic experiments were performed after in vitro and in vivo treatments with Jaburetox using central nervous system homogenates from adult cockroaches. Spectrophotometric assays were employed to measure the enzyme activities and the protein expression of UAP and NOS was evaluated by Western blot. The insecticidal assay was conducted by injection and ingestion of 50 μg of Jaburetox per g of insect or the same volume of buffer for the controls. In N. cinerea, both in vivo and in vitro treatments with the peptide partially inhibited the activity of NOS, without modifying the protein levels. No alterations on ACP activity were observed upon Jaburetox treatment. In addition, the enzyme activity of UAP only had its activity affected at 18 h after injection. The peptide increased the AChE activity, suggesting a possible mechanism involved in overcoming the toxic effects of the insecticide. Moreover, the cockroaches did not die after Jaburetox injection and ingestion, indicating resistance to the toxic action of the peptide. Taken together, our findings indicate that Jaburetox alters the nitrinergic signaling as well as the AChE and UAP activities. The fact that Jaburetox affects differently the enzyme activities in R. prolixus and N. cinerea may explain why the cockroach is not susceptible to the lethal effect of the peptide.

A Canavalia ensiformis é uma leguminosa altamente resistente ao ataque de insetos, e contribuindo para essa resistência, a planta possui isoformas de urease, que são proteínas que apresentam atividade entomotóxica. Essa toxicidade é dependente de uma ativação proteolítica da molécula por enzimas digestivas do inseto, do tipo catepsinas, e subseqüente liberação de peptídeos internos, os quais possuem a ação inseticida. A partir dessa informação foi construído um peptídeo recombinante com base na seqüência da urease, chamado Jaburetox-2Ec, o qual é tóxico para insetos resistentes e suscetíveis a urease intacta. O hemíptero Oncopeltus fasciatus é um dos nossos modelos de estudo. O objetivo deste trabalho foi identificar as principais peptidases digestivas de ninfas de O. fasciatus, auxiliando na elucidação do mecanismo de ação inseticida dessas toxinas, além de estudar os efeitos da urease intacta e do peptídeo derivado sobre órgãos isolados. Quando alimentadas com diferentes concentrações da urease majoritária de C. ensiformis (JBU), ninfas de O. fasciatus apresentam uma taxa de mortalidade superior a 80% após duas semanas, assim como quando injetadas com Jaburetox-2Ec apresentam uma taxa de mortalidade de 100% após 48 horas. Ninfas de quarto instar foram dissecadas para retirada dos intestinos e obtenção de um extrato protéico bruto, o qual foi utilizado para a realização dos ensaios enzimáticos. O extrato bruto foi capaz de hidrolisar in vitro a JBU e liberar peptídeos com massa semelhante a peptídeos entomotóxicos já conhecidos, reconhecíveis pelo anticorpo anti-Jaburetox-2Ec. A atividade proteolítica majoritária sobre substratos protéicos, em pH 4.0, foi bloqueada por inibidores específicos de aspártico e cisteíno peptidases, não sendo afetada EDTA, inibidor de metalopeptidases. Ao utilizar-se um substrato específico para cisteíno peptidases, o pico majoritário observado foi em pH 5.0, sendo a atividade completamente inibida por E-64 (inibidor de cisteíno peptidases) em todos os valores de pH testados. Ao utilizarse um substrato desenhado para aspártico peptidases, a atividade majoritária foi novamente em pH 5.0, sendo parcialmente inibida por Pepstatina A (inibidor de aspártico peptidases) é parcial em todos os valores de pH testados. Substratos sintéticos correspondentes às regiões N e C-terminal que flanqueiam o peptídeo inseticida na molécula de urease também foram testados. O primeiro não foi hidrolisado pelo extrato bruto, enquanto que o segundo apresentou um pico de atividade majoritário em pH 4.0-5.0, com inibição total por E-64. O extrato bruto foi submetido a um processo de purificação de duas etapas, uma troca iônica e uma cromatografia de gel filtração. A purificação foi monitorada utilizando-se um substrato específico para cisteíno peptidases, e a fração da gel filtração com maior atividade apresentou massa molecular de 22 kDa. A fração ativa foi submetida a um gel de poliacrilamida, a banda foi excisada e digerida com tripsina, e os peptídeos resultantes foram então analisados por espectrometria de massas. Uma catepsina L foi identificada, com massa molecular semelhante ao previsto pela gel filtração. Os resultados sugerem que a susceptibilidade de ninfas de O. fasciatus a JBU é, como em outros modelos de insetos, relacionada à proteólise limitada da proteína ingerida e posterior liberação de peptídeos inseticidas por enzimas do tipo catepsinas. Diferentes tipos de catepsinas podem estar liberando os peptídeos inseticidas a partir da urease, sendo que um cisteíno peptidase, tipo Catepsina L, pode ter um papel importante na ativação da proteína em O. fasciatus. Adicionalmente fizemos localização in situ de Jaburetox-2Ec após injeção na hemolinfa e observamos imunoreatividade no sistema nervoso central de ninfas de O. fasciatus, indicando que o peptídeo pode estar agindo neste local. Além dos efeitos tóxicos causados pelos peptídeos derivados da urease, já foram relatados em outros modelos, efeitos causados pela molécula intacta. Testamos, então, o efeito da JBU sobre contrações de intestinos ex vivo de O. fasciatus. Observamos que a urease tem a capacidade de inibir, em algumas concentrações, o efeito excitatório da serotonina sobre as contrações musculares, atividade que não é compartilhada com Jaburetox- 2Ec. Concluímos com os dados gerados nesse estudo, e em estudos prévios, que a toxicidade das ureases não só é devida à ativação proteolítica e liberação de peptídeos, mas também à proteína intacta, que parece estar causando distúrbios em processos de sinalização celular. / Jackbean (Canavalia ensiformis) is a legume highly resistant to insects. Contributing to this resistance, the plant contains urease isoforms that are entomotoxic upon the release of internal peptides by insect’s digestive cathepsin-like enzymes. A recombinant peptide, called Jaburetox-2Ec, was built based on urease’s sequence and this peptide is poisonous to all insects tested. The hemipteran bug Oncopeltus fasciatus is one of our models of study. In this work we aimed to identify the main digestive peptidases of O. fasciatus, helping to elucidate the insecticidal mechanism of action of these toxins, and to test the effects of urease and derived peptides upon isolated organs. When fed with different Jackbean major urease (JBU) concentrations, O. fasciatus nymphs showed a mortality rate higher than 80% after two weeks. When injected with Jaburetox-2Ec the mortality rate was 100% after 48 hours. Homogenates of midguts dissected from fourth instars were used to perform proteolytic activity assays. The homogenates hydrolyzed JBU in vitro, yielding a fragment similar in size to known entomotoxic peptides. The major proteolytic activity at pH 4.0 upon protein substrates was blocked by specific aspartic and cysteine peptidases inhibitors, but was not affected by a metalopeptidase inhibitor (EDTA). The optimal activity upon a fluorogenic substrate specific for cysteine peptidases was at pH 5.0, being completely inhibited by E-64 at all pH values tested. The optimal activity upon a fluorogenic substrate designed for aspartic peptidases was again at pH 5.0, being partially blocked by Pepstatin A in the pH range 2 to 10. Fluorogenic substrates corresponding to the Nand C-terminal regions flanking the entomotoxic peptide within urease sequence were also tested. While the N-terminal peptide was not hydrolyzed by the midguts homogenate, the C-terminal peptide was cleaved maximally at pH 4.0-5.0, with complete inhibition by E-64. The midguts homogenate was submitted to ion exchange chromatography followed by gel filtration yielding a 22 kDa protein peak. After SDSPAGE this band was excised from the gel, digested with trypsin and the peptides were analyzed by mass spectrometry. A Cathepsin L was identified. The results suggest that susceptibility of O. fasciatus nymphs to JBU is, like in other insect models, due to limited proteolysis of ingested protein and subsequent release of entomotoxic peptides by Cathepsin-like digestive enzymes. Moreover, we performed in situ localization of Jaburetox-2Ec after injection in the hemolymph, and we observed immunoreactive processes in O. fasciatus nymphs’ central nervous system, indicating that the peptide could be acting there. Besides the poisonous effects caused by urease derived peptides, effects caused by the intact molecule were already described. Hence we tested urease’s effect upon O. fasciatus isolated midguts contractions. We observed that urease is capable of inhibiting, at some concentrations, serotonin excitatory effect on muscular contractions, activity that was not shared with Jaburetox-2Ec. We concluded from the data of this study and previous studies, that urease’s toxicity is not only due to proteolytic activation and release of toxic peptides, but also to the intact molecule, which seems to be causing disturbances in cell signalling.

A Canavalia ensiformis é uma leguminosa altamente resistente ao ataque de insetos, e contribuindo para essa resistência, a planta possui isoformas de urease, que são proteínas que apresentam atividade entomotóxica. Essa toxicidade é dependente de uma ativação proteolítica da molécula por enzimas digestivas do inseto, do tipo catepsinas, e subseqüente liberação de peptídeos internos, os quais possuem a ação inseticida. A partir dessa informação foi construído um peptídeo recombinante com base na seqüência da urease, chamado Jaburetox-2Ec, o qual é tóxico para insetos resistentes e suscetíveis a urease intacta. O hemíptero Oncopeltus fasciatus é um dos nossos modelos de estudo. O objetivo deste trabalho foi identificar as principais peptidases digestivas de ninfas de O. fasciatus, auxiliando na elucidação do mecanismo de ação inseticida dessas toxinas, além de estudar os efeitos da urease intacta e do peptídeo derivado sobre órgãos isolados. Quando alimentadas com diferentes concentrações da urease majoritária de C. ensiformis (JBU), ninfas de O. fasciatus apresentam uma taxa de mortalidade superior a 80% após duas semanas, assim como quando injetadas com Jaburetox-2Ec apresentam uma taxa de mortalidade de 100% após 48 horas. Ninfas de quarto instar foram dissecadas para retirada dos intestinos e obtenção de um extrato protéico bruto, o qual foi utilizado para a realização dos ensaios enzimáticos. O extrato bruto foi capaz de hidrolisar in vitro a JBU e liberar peptídeos com massa semelhante a peptídeos entomotóxicos já conhecidos, reconhecíveis pelo anticorpo anti-Jaburetox-2Ec. A atividade proteolítica majoritária sobre substratos protéicos, em pH 4.0, foi bloqueada por inibidores específicos de aspártico e cisteíno peptidases, não sendo afetada EDTA, inibidor de metalopeptidases. Ao utilizar-se um substrato específico para cisteíno peptidases, o pico majoritário observado foi em pH 5.0, sendo a atividade completamente inibida por E-64 (inibidor de cisteíno peptidases) em todos os valores de pH testados. Ao utilizarse um substrato desenhado para aspártico peptidases, a atividade majoritária foi novamente em pH 5.0, sendo parcialmente inibida por Pepstatina A (inibidor de aspártico peptidases) é parcial em todos os valores de pH testados. Substratos sintéticos correspondentes às regiões N e C-terminal que flanqueiam o peptídeo inseticida na molécula de urease também foram testados. O primeiro não foi hidrolisado pelo extrato bruto, enquanto que o segundo apresentou um pico de atividade majoritário em pH 4.0-5.0, com inibição total por E-64. O extrato bruto foi submetido a um processo de purificação de duas etapas, uma troca iônica e uma cromatografia de gel filtração. A purificação foi monitorada utilizando-se um substrato específico para cisteíno peptidases, e a fração da gel filtração com maior atividade apresentou massa molecular de 22 kDa. A fração ativa foi submetida a um gel de poliacrilamida, a banda foi excisada e digerida com tripsina, e os peptídeos resultantes foram então analisados por espectrometria de massas. Uma catepsina L foi identificada, com massa molecular semelhante ao previsto pela gel filtração. Os resultados sugerem que a susceptibilidade de ninfas de O. fasciatus a JBU é, como em outros modelos de insetos, relacionada à proteólise limitada da proteína ingerida e posterior liberação de peptídeos inseticidas por enzimas do tipo catepsinas. Diferentes tipos de catepsinas podem estar liberando os peptídeos inseticidas a partir da urease, sendo que um cisteíno peptidase, tipo Catepsina L, pode ter um papel importante na ativação da proteína em O. fasciatus. Adicionalmente fizemos localização in situ de Jaburetox-2Ec após injeção na hemolinfa e observamos imunoreatividade no sistema nervoso central de ninfas de O. fasciatus, indicando que o peptídeo pode estar agindo neste local. Além dos efeitos tóxicos causados pelos peptídeos derivados da urease, já foram relatados em outros modelos, efeitos causados pela molécula intacta. Testamos, então, o efeito da JBU sobre contrações de intestinos ex vivo de O. fasciatus. Observamos que a urease tem a capacidade de inibir, em algumas concentrações, o efeito excitatório da serotonina sobre as contrações musculares, atividade que não é compartilhada com Jaburetox- 2Ec. Concluímos com os dados gerados nesse estudo, e em estudos prévios, que a toxicidade das ureases não só é devida à ativação proteolítica e liberação de peptídeos, mas também à proteína intacta, que parece estar causando distúrbios em processos de sinalização celular. / Jackbean (Canavalia ensiformis) is a legume highly resistant to insects. Contributing to this resistance, the plant contains urease isoforms that are entomotoxic upon the release of internal peptides by insect’s digestive cathepsin-like enzymes. A recombinant peptide, called Jaburetox-2Ec, was built based on urease’s sequence and this peptide is poisonous to all insects tested. The hemipteran bug Oncopeltus fasciatus is one of our models of study. In this work we aimed to identify the main digestive peptidases of O. fasciatus, helping to elucidate the insecticidal mechanism of action of these toxins, and to test the effects of urease and derived peptides upon isolated organs. When fed with different Jackbean major urease (JBU) concentrations, O. fasciatus nymphs showed a mortality rate higher than 80% after two weeks. When injected with Jaburetox-2Ec the mortality rate was 100% after 48 hours. Homogenates of midguts dissected from fourth instars were used to perform proteolytic activity assays. The homogenates hydrolyzed JBU in vitro, yielding a fragment similar in size to known entomotoxic peptides. The major proteolytic activity at pH 4.0 upon protein substrates was blocked by specific aspartic and cysteine peptidases inhibitors, but was not affected by a metalopeptidase inhibitor (EDTA). The optimal activity upon a fluorogenic substrate specific for cysteine peptidases was at pH 5.0, being completely inhibited by E-64 at all pH values tested. The optimal activity upon a fluorogenic substrate designed for aspartic peptidases was again at pH 5.0, being partially blocked by Pepstatin A in the pH range 2 to 10. Fluorogenic substrates corresponding to the Nand C-terminal regions flanking the entomotoxic peptide within urease sequence were also tested. While the N-terminal peptide was not hydrolyzed by the midguts homogenate, the C-terminal peptide was cleaved maximally at pH 4.0-5.0, with complete inhibition by E-64. The midguts homogenate was submitted to ion exchange chromatography followed by gel filtration yielding a 22 kDa protein peak. After SDSPAGE this band was excised from the gel, digested with trypsin and the peptides were analyzed by mass spectrometry. A Cathepsin L was identified. The results suggest that susceptibility of O. fasciatus nymphs to JBU is, like in other insect models, due to limited proteolysis of ingested protein and subsequent release of entomotoxic peptides by Cathepsin-like digestive enzymes. Moreover, we performed in situ localization of Jaburetox-2Ec after injection in the hemolymph, and we observed immunoreactive processes in O. fasciatus nymphs’ central nervous system, indicating that the peptide could be acting there. Besides the poisonous effects caused by urease derived peptides, effects caused by the intact molecule were already described. Hence we tested urease’s effect upon O. fasciatus isolated midguts contractions. We observed that urease is capable of inhibiting, at some concentrations, serotonin excitatory effect on muscular contractions, activity that was not shared with Jaburetox-2Ec. We concluded from the data of this study and previous studies, that urease’s toxicity is not only due to proteolytic activation and release of toxic peptides, but also to the intact molecule, which seems to be causing disturbances in cell signalling.

A Canavalia ensiformis é uma leguminosa altamente resistente ao ataque de insetos, e contribuindo para essa resistência, a planta possui isoformas de urease, que são proteínas que apresentam atividade entomotóxica. Essa toxicidade é dependente de uma ativação proteolítica da molécula por enzimas digestivas do inseto, do tipo catepsinas, e subseqüente liberação de peptídeos internos, os quais possuem a ação inseticida. A partir dessa informação foi construído um peptídeo recombinante com base na seqüência da urease, chamado Jaburetox-2Ec, o qual é tóxico para insetos resistentes e suscetíveis a urease intacta. O hemíptero Oncopeltus fasciatus é um dos nossos modelos de estudo. O objetivo deste trabalho foi identificar as principais peptidases digestivas de ninfas de O. fasciatus, auxiliando na elucidação do mecanismo de ação inseticida dessas toxinas, além de estudar os efeitos da urease intacta e do peptídeo derivado sobre órgãos isolados. Quando alimentadas com diferentes concentrações da urease majoritária de C. ensiformis (JBU), ninfas de O. fasciatus apresentam uma taxa de mortalidade superior a 80% após duas semanas, assim como quando injetadas com Jaburetox-2Ec apresentam uma taxa de mortalidade de 100% após 48 horas. Ninfas de quarto instar foram dissecadas para retirada dos intestinos e obtenção de um extrato protéico bruto, o qual foi utilizado para a realização dos ensaios enzimáticos. O extrato bruto foi capaz de hidrolisar in vitro a JBU e liberar peptídeos com massa semelhante a peptídeos entomotóxicos já conhecidos, reconhecíveis pelo anticorpo anti-Jaburetox-2Ec. A atividade proteolítica majoritária sobre substratos protéicos, em pH 4.0, foi bloqueada por inibidores específicos de aspártico e cisteíno peptidases, não sendo afetada EDTA, inibidor de metalopeptidases. Ao utilizar-se um substrato específico para cisteíno peptidases, o pico majoritário observado foi em pH 5.0, sendo a atividade completamente inibida por E-64 (inibidor de cisteíno peptidases) em todos os valores de pH testados. Ao utilizarse um substrato desenhado para aspártico peptidases, a atividade majoritária foi novamente em pH 5.0, sendo parcialmente inibida por Pepstatina A (inibidor de aspártico peptidases) é parcial em todos os valores de pH testados. Substratos sintéticos correspondentes às regiões N e C-terminal que flanqueiam o peptídeo inseticida na molécula de urease também foram testados. O primeiro não foi hidrolisado pelo extrato bruto, enquanto que o segundo apresentou um pico de atividade majoritário em pH 4.0-5.0, com inibição total por E-64. O extrato bruto foi submetido a um processo de purificação de duas etapas, uma troca iônica e uma cromatografia de gel filtração. A purificação foi monitorada utilizando-se um substrato específico para cisteíno peptidases, e a fração da gel filtração com maior atividade apresentou massa molecular de 22 kDa. A fração ativa foi submetida a um gel de poliacrilamida, a banda foi excisada e digerida com tripsina, e os peptídeos resultantes foram então analisados por espectrometria de massas. Uma catepsina L foi identificada, com massa molecular semelhante ao previsto pela gel filtração. Os resultados sugerem que a susceptibilidade de ninfas de O. fasciatus a JBU é, como em outros modelos de insetos, relacionada à proteólise limitada da proteína ingerida e posterior liberação de peptídeos inseticidas por enzimas do tipo catepsinas. Diferentes tipos de catepsinas podem estar liberando os peptídeos inseticidas a partir da urease, sendo que um cisteíno peptidase, tipo Catepsina L, pode ter um papel importante na ativação da proteína em O. fasciatus. Adicionalmente fizemos localização in situ de Jaburetox-2Ec após injeção na hemolinfa e observamos imunoreatividade no sistema nervoso central de ninfas de O. fasciatus, indicando que o peptídeo pode estar agindo neste local. Além dos efeitos tóxicos causados pelos peptídeos derivados da urease, já foram relatados em outros modelos, efeitos causados pela molécula intacta. Testamos, então, o efeito da JBU sobre contrações de intestinos ex vivo de O. fasciatus. Observamos que a urease tem a capacidade de inibir, em algumas concentrações, o efeito excitatório da serotonina sobre as contrações musculares, atividade que não é compartilhada com Jaburetox- 2Ec. Concluímos com os dados gerados nesse estudo, e em estudos prévios, que a toxicidade das ureases não só é devida à ativação proteolítica e liberação de peptídeos, mas também à proteína intacta, que parece estar causando distúrbios em processos de sinalização celular. / Jackbean (Canavalia ensiformis) is a legume highly resistant to insects. Contributing to this resistance, the plant contains urease isoforms that are entomotoxic upon the release of internal peptides by insect’s digestive cathepsin-like enzymes. A recombinant peptide, called Jaburetox-2Ec, was built based on urease’s sequence and this peptide is poisonous to all insects tested. The hemipteran bug Oncopeltus fasciatus is one of our models of study. In this work we aimed to identify the main digestive peptidases of O. fasciatus, helping to elucidate the insecticidal mechanism of action of these toxins, and to test the effects of urease and derived peptides upon isolated organs. When fed with different Jackbean major urease (JBU) concentrations, O. fasciatus nymphs showed a mortality rate higher than 80% after two weeks. When injected with Jaburetox-2Ec the mortality rate was 100% after 48 hours. Homogenates of midguts dissected from fourth instars were used to perform proteolytic activity assays. The homogenates hydrolyzed JBU in vitro, yielding a fragment similar in size to known entomotoxic peptides. The major proteolytic activity at pH 4.0 upon protein substrates was blocked by specific aspartic and cysteine peptidases inhibitors, but was not affected by a metalopeptidase inhibitor (EDTA). The optimal activity upon a fluorogenic substrate specific for cysteine peptidases was at pH 5.0, being completely inhibited by E-64 at all pH values tested. The optimal activity upon a fluorogenic substrate designed for aspartic peptidases was again at pH 5.0, being partially blocked by Pepstatin A in the pH range 2 to 10. Fluorogenic substrates corresponding to the Nand C-terminal regions flanking the entomotoxic peptide within urease sequence were also tested. While the N-terminal peptide was not hydrolyzed by the midguts homogenate, the C-terminal peptide was cleaved maximally at pH 4.0-5.0, with complete inhibition by E-64. The midguts homogenate was submitted to ion exchange chromatography followed by gel filtration yielding a 22 kDa protein peak. After SDSPAGE this band was excised from the gel, digested with trypsin and the peptides were analyzed by mass spectrometry. A Cathepsin L was identified. The results suggest that susceptibility of O. fasciatus nymphs to JBU is, like in other insect models, due to limited proteolysis of ingested protein and subsequent release of entomotoxic peptides by Cathepsin-like digestive enzymes. Moreover, we performed in situ localization of Jaburetox-2Ec after injection in the hemolymph, and we observed immunoreactive processes in O. fasciatus nymphs’ central nervous system, indicating that the peptide could be acting there. Besides the poisonous effects caused by urease derived peptides, effects caused by the intact molecule were already described. Hence we tested urease’s effect upon O. fasciatus isolated midguts contractions. We observed that urease is capable of inhibiting, at some concentrations, serotonin excitatory effect on muscular contractions, activity that was not shared with Jaburetox-2Ec. We concluded from the data of this study and previous studies, that urease’s toxicity is not only due to proteolytic activation and release of toxic peptides, but also to the intact molecule, which seems to be causing disturbances in cell signalling.

Jaburetox (Jbtx) é um peptídeo de 10 kDa derivado de uma das isoformas de urease de Canavalia ensiformis. Em um estudo anterior realizado com o triatomíneo vetor da doença de Chagas Triatoma infestans, esse peptídeo foi encontrado interagindo com a proteína UDP-N-acetilglicosamina pirofosforilase (UAP), alterando também sua atividade enzimática no sistema nervoso central, in vivo e in vitro. A UAP já foi encontrada em eucariotos, bactérias e vírus, estando relacionada com as rotas de produção de quitina, N-glicosilação e síntese de glicoinositolfosfolipídeos. Assim, o presente trabalho tem três objetivos: i) investigar o efeito de Jbtx sobre a atividade enzimática e a expressão gênica da UAP do inseto modelo Rhodnius prolixus, ii) clonar e expressar a UAP e iii) estudar a UAP filogeneticamente. Para a primeira parte, foram avaliados, no triatomíneo R. prolixus, a atividade enzimática da UAP e o perfil de expressão dessa enzima e da quitina sintase em insetos controles e alimentados com Jbtx. Para a segunda, o cDNA da enzima de R. prolixus foi clonado em vetor pET-15b e expressado em Escherichia coli Rosetta 2. A purificação da enzima recombinante foi feita por cromatografia de afinidade a níquel. Para a terceira parte, foram buscadas sequências de aminoácidos homólogas às da UAP de R. prolixus no servidor pHmmer e foi construída uma árvore filogenética com o método de Máxima Verossimilhança. Os resultados obtidos indicam que o Jbtx aumenta a atividade enzimática da UAP em glândulas salivares, corpo gorduroso e epiderme, enquanto diminui a expressão da UAP em intestino médio anterior, túbulos de Malpighi, glândulas salivares, corpo gorduroso, epiderme e sistema nervoso central, assim como a expressão da quitina sintase nos mesmos órgãos e no intestino médio posterior. Foi obtida uma UAP recombinante de 56 kDa, compatível com peso molecular previsto in silico. A árvore filogenética construída contém 40 sequências, sendo 38 de insetos e 2 sequências de grupo externo. A árvore segue o padrão de evolução dos insetos e foi identificado um novo organismo com potenciais dois genes codificantes de UAP. Esse trabalho apresenta a primeira evidência de que Jbtx altera a expressão gênica em R. prolixus. O resultado obtido pela análise filogenética indica que a UAP é uma enzima ancestral à diversificação em Insecta. / Jaburetox (Jbtx) is a 10 kDa peptide derived from a urease isoform of Canavalia ensiformis. In a previous work with the triatomine vector of Chagas’ disease Triatoma infestans, this peptide was found interacting with the protein UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase (UAP), also increasing the UAP enzymatic activity in the central nervous system in vivo and in vitro. UAP has been described in eukaryotes, bacteria and virus, and is involved in chitin production, N-linked glycosylation and glyco inositol phospholipids synthesis pathway. Thus, the present work has three main aims: i) to understand the effect of Jbtx on this enzyme on the model insect Rhodnius prolixus, ii) to clone and express UAP and iii) to study UAP from a phylogenetic point of view. Firstly, UAP enzymatic activity and its expression profile, as well as the chitin synthase expression, were analysed in the triatomine R. prolixus in saline- or Jbtx-fed insects. Secondly, the cDNA from R. prolixus’ UAP was cloned into the pET-15b vector and expressed in Escherichia coli Rosetta 2. The recombinant enzyme was purified through a nickel affinity chromatography. Thirdly, homolog sequences to R. prolixus’ UAP were searched in pHmmer database and a phylogenetic tree was built using the Maximmum Likelihood method. The results obtained indicate that Jbtx increases UAP enzymatic activity in salivary glands, fat body and epidermis, while decreasing UAP’s expression in the anterior and posterior midgut, Malpighian tubules, salivary glands, fat body, epidermis and central nervous system, as well as the chitin synthase expression in the same organs and the posterior midgut. A 56 kDa recombinant UAP was obtained, in agreement with the in silico estimated size. The phylogenetic tree built has 40 sequences, from which 38 are from insects and 2 are from mammals (external group). The tree follows the insect evolution patterns and a new organism containing two potential UAP coding genes was identified. This work presents the first evidence that Jbtx is able to interfere in the gene expression in R. prolixus. The results obtained through phylogenetic analysis shows that UAP is an enzyme ancestral to the diversification in Insecta.

Jaburetox (Jbtx) é um peptídeo de 10 kDa derivado de uma das isoformas de urease de Canavalia ensiformis. Em um estudo anterior realizado com o triatomíneo vetor da doença de Chagas Triatoma infestans, esse peptídeo foi encontrado interagindo com a proteína UDP-N-acetilglicosamina pirofosforilase (UAP), alterando também sua atividade enzimática no sistema nervoso central, in vivo e in vitro. A UAP já foi encontrada em eucariotos, bactérias e vírus, estando relacionada com as rotas de produção de quitina, N-glicosilação e síntese de glicoinositolfosfolipídeos. Assim, o presente trabalho tem três objetivos: i) investigar o efeito de Jbtx sobre a atividade enzimática e a expressão gênica da UAP do inseto modelo Rhodnius prolixus, ii) clonar e expressar a UAP e iii) estudar a UAP filogeneticamente. Para a primeira parte, foram avaliados, no triatomíneo R. prolixus, a atividade enzimática da UAP e o perfil de expressão dessa enzima e da quitina sintase em insetos controles e alimentados com Jbtx. Para a segunda, o cDNA da enzima de R. prolixus foi clonado em vetor pET-15b e expressado em Escherichia coli Rosetta 2. A purificação da enzima recombinante foi feita por cromatografia de afinidade a níquel. Para a terceira parte, foram buscadas sequências de aminoácidos homólogas às da UAP de R. prolixus no servidor pHmmer e foi construída uma árvore filogenética com o método de Máxima Verossimilhança. Os resultados obtidos indicam que o Jbtx aumenta a atividade enzimática da UAP em glândulas salivares, corpo gorduroso e epiderme, enquanto diminui a expressão da UAP em intestino médio anterior, túbulos de Malpighi, glândulas salivares, corpo gorduroso, epiderme e sistema nervoso central, assim como a expressão da quitina sintase nos mesmos órgãos e no intestino médio posterior. Foi obtida uma UAP recombinante de 56 kDa, compatível com peso molecular previsto in silico. A árvore filogenética construída contém 40 sequências, sendo 38 de insetos e 2 sequências de grupo externo. A árvore segue o padrão de evolução dos insetos e foi identificado um novo organismo com potenciais dois genes codificantes de UAP. Esse trabalho apresenta a primeira evidência de que Jbtx altera a expressão gênica em R. prolixus. O resultado obtido pela análise filogenética indica que a UAP é uma enzima ancestral à diversificação em Insecta. / Jaburetox (Jbtx) is a 10 kDa peptide derived from a urease isoform of Canavalia ensiformis. In a previous work with the triatomine vector of Chagas’ disease Triatoma infestans, this peptide was found interacting with the protein UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase (UAP), also increasing the UAP enzymatic activity in the central nervous system in vivo and in vitro. UAP has been described in eukaryotes, bacteria and virus, and is involved in chitin production, N-linked glycosylation and glyco inositol phospholipids synthesis pathway. Thus, the present work has three main aims: i) to understand the effect of Jbtx on this enzyme on the model insect Rhodnius prolixus, ii) to clone and express UAP and iii) to study UAP from a phylogenetic point of view. Firstly, UAP enzymatic activity and its expression profile, as well as the chitin synthase expression, were analysed in the triatomine R. prolixus in saline- or Jbtx-fed insects. Secondly, the cDNA from R. prolixus’ UAP was cloned into the pET-15b vector and expressed in Escherichia coli Rosetta 2. The recombinant enzyme was purified through a nickel affinity chromatography. Thirdly, homolog sequences to R. prolixus’ UAP were searched in pHmmer database and a phylogenetic tree was built using the Maximmum Likelihood method. The results obtained indicate that Jbtx increases UAP enzymatic activity in salivary glands, fat body and epidermis, while decreasing UAP’s expression in the anterior and posterior midgut, Malpighian tubules, salivary glands, fat body, epidermis and central nervous system, as well as the chitin synthase expression in the same organs and the posterior midgut. A 56 kDa recombinant UAP was obtained, in agreement with the in silico estimated size. The phylogenetic tree built has 40 sequences, from which 38 are from insects and 2 are from mammals (external group). The tree follows the insect evolution patterns and a new organism containing two potential UAP coding genes was identified. This work presents the first evidence that Jbtx is able to interfere in the gene expression in R. prolixus. The results obtained through phylogenetic analysis shows that UAP is an enzyme ancestral to the diversification in Insecta.

Jaburetox (Jbtx) é um peptídeo de 10 kDa derivado de uma das isoformas de urease de Canavalia ensiformis. Em um estudo anterior realizado com o triatomíneo vetor da doença de Chagas Triatoma infestans, esse peptídeo foi encontrado interagindo com a proteína UDP-N-acetilglicosamina pirofosforilase (UAP), alterando também sua atividade enzimática no sistema nervoso central, in vivo e in vitro. A UAP já foi encontrada em eucariotos, bactérias e vírus, estando relacionada com as rotas de produção de quitina, N-glicosilação e síntese de glicoinositolfosfolipídeos. Assim, o presente trabalho tem três objetivos: i) investigar o efeito de Jbtx sobre a atividade enzimática e a expressão gênica da UAP do inseto modelo Rhodnius prolixus, ii) clonar e expressar a UAP e iii) estudar a UAP filogeneticamente. Para a primeira parte, foram avaliados, no triatomíneo R. prolixus, a atividade enzimática da UAP e o perfil de expressão dessa enzima e da quitina sintase em insetos controles e alimentados com Jbtx. Para a segunda, o cDNA da enzima de R. prolixus foi clonado em vetor pET-15b e expressado em Escherichia coli Rosetta 2. A purificação da enzima recombinante foi feita por cromatografia de afinidade a níquel. Para a terceira parte, foram buscadas sequências de aminoácidos homólogas às da UAP de R. prolixus no servidor pHmmer e foi construída uma árvore filogenética com o método de Máxima Verossimilhança. Os resultados obtidos indicam que o Jbtx aumenta a atividade enzimática da UAP em glândulas salivares, corpo gorduroso e epiderme, enquanto diminui a expressão da UAP em intestino médio anterior, túbulos de Malpighi, glândulas salivares, corpo gorduroso, epiderme e sistema nervoso central, assim como a expressão da quitina sintase nos mesmos órgãos e no intestino médio posterior. Foi obtida uma UAP recombinante de 56 kDa, compatível com peso molecular previsto in silico. A árvore filogenética construída contém 40 sequências, sendo 38 de insetos e 2 sequências de grupo externo. A árvore segue o padrão de evolução dos insetos e foi identificado um novo organismo com potenciais dois genes codificantes de UAP. Esse trabalho apresenta a primeira evidência de que Jbtx altera a expressão gênica em R. prolixus. O resultado obtido pela análise filogenética indica que a UAP é uma enzima ancestral à diversificação em Insecta. / Jaburetox (Jbtx) is a 10 kDa peptide derived from a urease isoform of Canavalia ensiformis. In a previous work with the triatomine vector of Chagas’ disease Triatoma infestans, this peptide was found interacting with the protein UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase (UAP), also increasing the UAP enzymatic activity in the central nervous system in vivo and in vitro. UAP has been described in eukaryotes, bacteria and virus, and is involved in chitin production, N-linked glycosylation and glyco inositol phospholipids synthesis pathway. Thus, the present work has three main aims: i) to understand the effect of Jbtx on this enzyme on the model insect Rhodnius prolixus, ii) to clone and express UAP and iii) to study UAP from a phylogenetic point of view. Firstly, UAP enzymatic activity and its expression profile, as well as the chitin synthase expression, were analysed in the triatomine R. prolixus in saline- or Jbtx-fed insects. Secondly, the cDNA from R. prolixus’ UAP was cloned into the pET-15b vector and expressed in Escherichia coli Rosetta 2. The recombinant enzyme was purified through a nickel affinity chromatography. Thirdly, homolog sequences to R. prolixus’ UAP were searched in pHmmer database and a phylogenetic tree was built using the Maximmum Likelihood method. The results obtained indicate that Jbtx increases UAP enzymatic activity in salivary glands, fat body and epidermis, while decreasing UAP’s expression in the anterior and posterior midgut, Malpighian tubules, salivary glands, fat body, epidermis and central nervous system, as well as the chitin synthase expression in the same organs and the posterior midgut. A 56 kDa recombinant UAP was obtained, in agreement with the in silico estimated size. The phylogenetic tree built has 40 sequences, from which 38 are from insects and 2 are from mammals (external group). The tree follows the insect evolution patterns and a new organism containing two potential UAP coding genes was identified. This work presents the first evidence that Jbtx is able to interfere in the gene expression in R. prolixus. The results obtained through phylogenetic analysis shows that UAP is an enzyme ancestral to the diversification in Insecta.

No presente trabalho, o peptídeo inseticida recombinante Jaburetox-2Ec, derivado da urease de Canavalia ensiformis (Jack bean) foi estudado, principalmente através de técnicas de espectroscopia de espalhamento de luz e raios-X. Foi analisada a tendência do peptídeo a se agregar em diferentes condições físico-químicas quando em solução aquosa, e a sua interação com membranas de lipossomas miméticos de plaquetas humanas. A partir dos dados de raio hidrodinâmico, raio de giro, e massa molar ponderal média obtidos do peptídeo em solução, foi possível observar uma tendência para maior agregação numa faixa em torno de pH 5,5, bem como ausência de agregação em pH inferior a 4,0 e superior a 7,0. Não se verificou nenhum efeito visível no nível de agregação com a adição de agente redutor ou íons, sendo que a exposição ao oxigênio do ar levou a um aumento da mesma. Os estudos de interação do Jaburetox-2Ec com lipossomas revelaram uma significante mudança estrutural na membrana, que se mostrou mais intensa com uma maior concentração do peptídeo. Foram, através de software, feitos ajustes teóricos das curvas de espalhamento de raios-X à baixos ângulos dos lipossomas, a fim de quantificar as mudanças nos parâmetros físicos das membranas causados pela ação do peptídeo. A formação de poros na membrana pelo peptídeo foi proposta como explicação para os resultados encontrados. / In the present work, the insecticide recombinant peptide Jaburetox-2Ec, derived from Canavalia ensiformis (Jack bean) urease, was studied, primarily by light and X-ray scattering techniques. Its tendency to aggregate in aqueous solution under different physical-chemical conditions, and its interaction with human platelet mimetic liposome membranes were analyzed. From the data relative to hydrodynamic radii, radii of gyration and mean molecular weight obtained from the peptide in aqueous solution, it was possible to observe a tendency for greater aggregation around pH 5.5, as well as an absence of aggregation at values of pH below 4.0 and above 7.0. No visible effect on the level of aggregation was verified with the addition of reducing agent or ions, whereas the exposure to oxygen in the air resulted in an increase in this level. The studies of Jaburetox-2Ec interaction with liposomes revealed a significant structural change in the membrane, which was shown to be more intense in higher peptide concentrations. Software-assisted theoretical fits were made for the experimental small-angle X-ray scattering curves aiming to quantify the changes in the physical parameters of the membranes caused by peptide action. The formation of pores in the membrane was proposed as an explanation to the results found.

No presente trabalho, o peptídeo inseticida recombinante Jaburetox-2Ec, derivado da urease de Canavalia ensiformis (Jack bean) foi estudado, principalmente através de técnicas de espectroscopia de espalhamento de luz e raios-X. Foi analisada a tendência do peptídeo a se agregar em diferentes condições físico-químicas quando em solução aquosa, e a sua interação com membranas de lipossomas miméticos de plaquetas humanas. A partir dos dados de raio hidrodinâmico, raio de giro, e massa molar ponderal média obtidos do peptídeo em solução, foi possível observar uma tendência para maior agregação numa faixa em torno de pH 5,5, bem como ausência de agregação em pH inferior a 4,0 e superior a 7,0. Não se verificou nenhum efeito visível no nível de agregação com a adição de agente redutor ou íons, sendo que a exposição ao oxigênio do ar levou a um aumento da mesma. Os estudos de interação do Jaburetox-2Ec com lipossomas revelaram uma significante mudança estrutural na membrana, que se mostrou mais intensa com uma maior concentração do peptídeo. Foram, através de software, feitos ajustes teóricos das curvas de espalhamento de raios-X à baixos ângulos dos lipossomas, a fim de quantificar as mudanças nos parâmetros físicos das membranas causados pela ação do peptídeo. A formação de poros na membrana pelo peptídeo foi proposta como explicação para os resultados encontrados. / In the present work, the insecticide recombinant peptide Jaburetox-2Ec, derived from Canavalia ensiformis (Jack bean) urease, was studied, primarily by light and X-ray scattering techniques. Its tendency to aggregate in aqueous solution under different physical-chemical conditions, and its interaction with human platelet mimetic liposome membranes were analyzed. From the data relative to hydrodynamic radii, radii of gyration and mean molecular weight obtained from the peptide in aqueous solution, it was possible to observe a tendency for greater aggregation around pH 5.5, as well as an absence of aggregation at values of pH below 4.0 and above 7.0. No visible effect on the level of aggregation was verified with the addition of reducing agent or ions, whereas the exposure to oxygen in the air resulted in an increase in this level. The studies of Jaburetox-2Ec interaction with liposomes revealed a significant structural change in the membrane, which was shown to be more intense in higher peptide concentrations. Software-assisted theoretical fits were made for the experimental small-angle X-ray scattering curves aiming to quantify the changes in the physical parameters of the membranes caused by peptide action. The formation of pores in the membrane was proposed as an explanation to the results found.

No presente trabalho, o peptídeo inseticida recombinante Jaburetox-2Ec, derivado da urease de Canavalia ensiformis (Jack bean) foi estudado, principalmente através de técnicas de espectroscopia de espalhamento de luz e raios-X. Foi analisada a tendência do peptídeo a se agregar em diferentes condições físico-químicas quando em solução aquosa, e a sua interação com membranas de lipossomas miméticos de plaquetas humanas. A partir dos dados de raio hidrodinâmico, raio de giro, e massa molar ponderal média obtidos do peptídeo em solução, foi possível observar uma tendência para maior agregação numa faixa em torno de pH 5,5, bem como ausência de agregação em pH inferior a 4,0 e superior a 7,0. Não se verificou nenhum efeito visível no nível de agregação com a adição de agente redutor ou íons, sendo que a exposição ao oxigênio do ar levou a um aumento da mesma. Os estudos de interação do Jaburetox-2Ec com lipossomas revelaram uma significante mudança estrutural na membrana, que se mostrou mais intensa com uma maior concentração do peptídeo. Foram, através de software, feitos ajustes teóricos das curvas de espalhamento de raios-X à baixos ângulos dos lipossomas, a fim de quantificar as mudanças nos parâmetros físicos das membranas causados pela ação do peptídeo. A formação de poros na membrana pelo peptídeo foi proposta como explicação para os resultados encontrados. / In the present work, the insecticide recombinant peptide Jaburetox-2Ec, derived from Canavalia ensiformis (Jack bean) urease, was studied, primarily by light and X-ray scattering techniques. Its tendency to aggregate in aqueous solution under different physical-chemical conditions, and its interaction with human platelet mimetic liposome membranes were analyzed. From the data relative to hydrodynamic radii, radii of gyration and mean molecular weight obtained from the peptide in aqueous solution, it was possible to observe a tendency for greater aggregation around pH 5.5, as well as an absence of aggregation at values of pH below 4.0 and above 7.0. No visible effect on the level of aggregation was verified with the addition of reducing agent or ions, whereas the exposure to oxygen in the air resulted in an increase in this level. The studies of Jaburetox-2Ec interaction with liposomes revealed a significant structural change in the membrane, which was shown to be more intense in higher peptide concentrations. Software-assisted theoretical fits were made for the experimental small-angle X-ray scattering curves aiming to quantify the changes in the physical parameters of the membranes caused by peptide action. The formation of pores in the membrane was proposed as an explanation to the results found.