A expressão de diversas proteínas do ciclo celular tem sido estudada em vários tipos de lesões malignas. Entre as principais está a p27, que é codificada pelo gene supressor de tumor de mesmo nome, e que já foi encontrada alterada em carcinomas, inclusive os intra-orais. Outra proteína que atua diretamente no controle do ciclo celular é a c-jun, que é codificada por um protooncogene, e através de outras vias de sinalização acaba agindo como um regulador positivo do ciclo. O presente estudo visou comparar as expressões imunoistoquímicas das proteínas p27 e c-jun, através do método da estreptavidina-biotina em 45 casos de displasia epitelial agrupados em diferentes graus (atipia discreta, moderada e intensa), e 20 casos de carcinoma epidermóide intra-oral, na tentativa de elucidar o papel e a relação existente entre estas proteínas. Foi observado uma diminuição dos níveis de p27 e um aumento significativo da c-jun nos casos com graus elevados de displasia epitelial e carcinoma epidermóide. A análise estatística indicou uma correlação inversa estatísticamente significativa entre as expressões de p27 e c-jun. Os resultados sugerem as alterações destas proteínas como um importante evento no processo de carcinogênese intra-oral. / The expression of many cell cycle proteins has been studied in a number of malignant lesions. Among the main ones is the p27, which is encoded by the same name tumor suppressor gene, and it is altered in carcinomas, including oral cancers. Another protein that plays a role in the cell cycle control is the c-jun, which is encoded by a proto-oncogene, and acts as a positive regulator of the cell cycle, through other signaling pathways. The present study aimed to compare the immunohistochemical expression of p27 and c-jun proteins, using the streptavidinbiotin method, in 45 cases of epithelial dysplasia, classified in different degrees (mild, moderate and intense), and 20 cases of oral squamous cells carcinoma, in an attempt to elucidate the role and the relationship between these proteins. It was observed a decrease of p27 levels and a substantial increase of c-jun in cases with the highest degrees of epithelial dysplasia. The statistical analysis showed a significant inverse correlation between p27 and c-jun expressions. These results suggest these proteins alterations as an important event in the carcinogenic process. p27, c-jun, Immunohistochemistry, Squamous cells carcinoma, Epithelial dysplasia

A expressão de diversas proteínas do ciclo celular tem sido estudada em vários tipos de lesões malignas. Entre as principais está a p27, que é codificada pelo gene supressor de tumor de mesmo nome, e que já foi encontrada alterada em carcinomas, inclusive os intra-orais. Outra proteína que atua diretamente no controle do ciclo celular é a c-jun, que é codificada por um protooncogene, e através de outras vias de sinalização acaba agindo como um regulador positivo do ciclo. O presente estudo visou comparar as expressões imunoistoquímicas das proteínas p27 e c-jun, através do método da estreptavidina-biotina em 45 casos de displasia epitelial agrupados em diferentes graus (atipia discreta, moderada e intensa), e 20 casos de carcinoma epidermóide intra-oral, na tentativa de elucidar o papel e a relação existente entre estas proteínas. Foi observado uma diminuição dos níveis de p27 e um aumento significativo da c-jun nos casos com graus elevados de displasia epitelial e carcinoma epidermóide. A análise estatística indicou uma correlação inversa estatísticamente significativa entre as expressões de p27 e c-jun. Os resultados sugerem as alterações destas proteínas como um importante evento no processo de carcinogênese intra-oral. / The expression of many cell cycle proteins has been studied in a number of malignant lesions. Among the main ones is the p27, which is encoded by the same name tumor suppressor gene, and it is altered in carcinomas, including oral cancers. Another protein that plays a role in the cell cycle control is the c-jun, which is encoded by a proto-oncogene, and acts as a positive regulator of the cell cycle, through other signaling pathways. The present study aimed to compare the immunohistochemical expression of p27 and c-jun proteins, using the streptavidinbiotin method, in 45 cases of epithelial dysplasia, classified in different degrees (mild, moderate and intense), and 20 cases of oral squamous cells carcinoma, in an attempt to elucidate the role and the relationship between these proteins. It was observed a decrease of p27 levels and a substantial increase of c-jun in cases with the highest degrees of epithelial dysplasia. The statistical analysis showed a significant inverse correlation between p27 and c-jun expressions. These results suggest these proteins alterations as an important event in the carcinogenic process. p27, c-jun, Immunohistochemistry, Squamous cells carcinoma, Epithelial dysplasia

A proteína jun é um dos principais integrantes do complexo AP-1 e está envolvido nos processos inflamatórios, diferenciação, apoptose e migração celular. Esta proteína pode formar homodímeros e heterodímeros por meio da dimerização que ocorre pelo sítio de sequências de leucinas. Existem evidências de que a proteína jun pode ser inibida pela proteína RPL10 mediante a ligação destas proteínas, no mesmo sítio de sequências de leucinas no núcleo celular, parando a progressão de tumores. O objetivo deste trabalho foi expressar, isolar e caracterizar a região de ligação das sequências de leucinas (região AP-1), para estudos posteriores de ligação com a proteína RPL10. O cDNA para proteína jun foi amplificado por PCR e clonado nos vetores de expressão pET 26b(+), pET 28a-c(+) e p1813 e expressa em E.coli BL21 (DE3). A proteína expressa em vetor pET28_AP1 foi eficientemente purificada pela técnica de cromatografia de afinidade a íons metálicos, por possuir uma sequência (poli)histidina que facilitou a purificação, apresentando um excelente grau de pureza. A identidade da proteína foi confirmada através de análise feita por western blotting e dot blotting e também por analise por espectrometria de massas. / The jun protein is one of the main AP-1 complex members and is involved in the inflammatory process, differentiation, apoptosis and cell migration. The Jun protein may form homodimers and heterodimers by dimerization in the leucines sequences site. There are evidences that jun protein can be inhibited by RPL10 protein through these protein binding in the same leucine sequences site, in the cell nucleus, stopping the tumor progress. The objective of this study was to express, isolate and characterize the binding region of the leucine sequences (AP-1 region) for subsequent binding studies with RPL10 protein. The jun protein cDNA was amplified by PCR and cloned into pET 26b(+), pET 28a-c(+) and p1813 expression vectors, and was expressed in E.coli BL21 (DE3). The protein expressed in pET28_AP1 vector was efficiently purified by the affinity chromatography technique to metal ions because have a (poly)histidine sequence which facilitate the protein purification, showing an excellent high purity. The protein identity was confirmed by western blotting and dot blotting and also by mass spectrometry analysis.

Les macrophages sont des cellules immunitaires innées présentes dans chaque organe. Ils sont des cibles thérapeutiques dans de nombreuses maladies, dont le cancer. En dépit de travaux récents sur l'origine des macrophages, les mécanismes régulant leur différenciation sont mal définis. L'expression de Jun, membre de la famille AP-1, augmente pendant la différenciation des macrophages, mais son rôle dans ce processus n'est pas connu.Au cours de mon doctorat, nous avons caractérisé le rôle de Jun dans le développement et l'homéostasie des macrophages, dans un modèle de souris avec délétion conditionnelle de Jun dans la lignée myéloïde (JunΔCsf1r). Nous montrons que Jun contrôle la différenciation, induite par CSF1, des monocytes en macrophages. In vivo, Jun régule l'accumulation de macrophages dérivés de monocytes dans les poumons et intestins. Les macrophages associés aux tumeurs (TAMs) jouent un rôle crucial dans la progression des cancers. L’absence de Jun freine la croissance d’un mélanome et la différenciation, induite par CSF1, des TAMs dérivés de monocytes qui participent à l’angiogénèse tumorale. Cependant, lors d'une inflammation aiguë, Jun n’affecte pas le recrutement de macrophages inflammatoires.En conclusion, nos résultats identifient Jun comme un régulateur central de la différenciation des macrophages. Dans un modèle de mélanome, les macrophages Jun-dépendants exercent des fonctions pro-tumorales. Le fait que Jun soit un régulateur sélectif du développement des macrophages dépendants de CSF-1 permettra de définir de nouvelles approches ciblant sélectivement la différenciation des macrophages, sans altérer les réponses immunitaires dépendantes des monocytes. / Macrophages are immune cells present in every organ. Given their variety of functions, macrophages are therapeutic targets in many diseases including cancer. Despite the research efforts to characterise their origins, the molecular mechanisms regulating macrophage differentiation are still poorly defined. Expression of the AP-1 factor, Jun, increases during differentiation, but its role in macrophage development is not known.During my PhD, we characterised how Jun affects macrophage development and homeostasis. We developed a conditional mouse model in which Jun is deficient in the myeloid lineage (JunΔCsf1r). We showed that Jun controls CSF1-mediated monocyte to macrophage differentiation, proliferation and survival. In vivo, Jun loss limits macrophage accumulation in lungs and intestine. Tumour-associated macrophages (TAMs) play critical roles in cancer progression. We observed that Jun deficiency dampens melanoma growth and the differentiation of CSF1-dependent monocyte-derived TAMs. We further showed that Jun-dependent TAMs mediate vessel normalisation in melanoma. During inflammation, Jun was dispensable for the recruitment of monocyte-derived inflammatory macrophages.Altogether, our results identify Jun as a master regulator of macrophage differentiation, without altering monocyte effector functions. In a melanoma model, we showed that Jun-dependent TAMs play tumour-promoting roles. Therefore, Jun is a selective regulator of CSF-1-dependent macrophage development, which is redundant during inflammation; this observation should help to define novel approaches to selectively target macrophage differentiation, without altering monocyte-dependent immune responses.

La maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) est une maladie neurologique héréditaire du système nerveux périphérique. A ce jour, près de 80 gènes sont décrits comme étant à l’origine d’une forme de CMT dont tous les modes de transmission sont connus. AR-CMT2A est due à une mutation faux-sens homozygote, c.892C>T, dans l’exon 5 du gène LMNA et conduit à la substitution d’une Arginine par une Cystéine (p.Arg298Cys) au sein d’un motif conservé du domaine central coil des Lamines de type A. L’étude présentée ici fait suite à un certain nombre d’observations ayant démontré la diminution de l’expression du gène dans les cellules de patients, et la perte d’interaction entre les Lamines A/C mutées et le facteur de transcription c-Jun. Or celui-ci participe au complexe régulateur AP-1 pour lequel le promoteur du gène LMNA possède deux éléments de fixation. L’ensemble du travail exposé dans ce manuscrit s’est donc basé sur l’hypothèse selon laquelle les Lamines de type A auraient la capacité de réguler leur propre expression et seraient capables, dans le nerf périphérique, d’établir des interactions avec des partenaires spécifiques du nerf périphérique. / Charcot-Marie-Tooth (CMT) disorders constitute a complex and heterogeneous group of hereditary motor and sensory neuropathies characterized by muscle weakness and wasting, foot and hand deformities and electrophysiological changes. Genetically, CMT is characterized by a great heterogeneity, with all modes of inheritance and more than 50 genes described to date. My PhD work focuses on AR-CMT2A, a rare autosomal recessive axonal form of CMT, due to a unique homozygous missense mutation c.892C>T in LMNA exon 5, which leads to the substitution of an arginine by a cysteine (p.Arg298Cys) within a conserved motif in the central rod domain of A-type Lamins. My work aimed at providing clues toward a better understanding of the physiopathological mechanisms underlying AR-CMT2A and is based on previous results for my research team, showing a decrease in the expression of LMNA in patients’ cells, and a loss of interaction between A-type Lamins and the transcription factor c-Jun in patients’ cells. c-Jun is a member of the AP-1 complex, a well-known dimeric transcription factor, and for which interestingly, the LMNA promoter has two binding sites. All the work outlined in this manuscript is based on the hypothesis that A-type Lamins, have the capacity to regulate their own expression and therefore, are also most probably involved in interactions with partners involved in gene regulation, in particular in the Peripheral Nerve System.

名古屋大学博士学位論文 学位の種類 : 医学博士(論文) 学位授与年月日:平成4年9月22日 大野元嗣氏の博士論文として提出された

Thesis (Ph. D.)--University of Alabama at Birmingham, 2007. / Title from first page of PDF file (viewed Feb. 7, 2008). Includes bibliographical references (p. 50-57).

Made available in DSpace on 2016-04-07T13:20:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 diogo_garcia_ioc_dout_2013.pdf: 2400404 bytes, checksum: 3c6058d8febab6bfb34c0c271a72a2b0 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A Na+, K+ ATPase (NKA) atua na manutenção do potencial de membrana das células e em mecanismos de transdução de sinal. Alterações na atividade da NKA são importantes em muitos processos biológicos e patológicos. A NKA pode ser inibida pelo álcool perílico (POH), um monoterpeno utilizado no tratamento de tumores, incluindo cerebrais. Neste trabalho, determinamos que o POH também atua sobre cascatas de sinalização, moduladas via NKA, que controlam a proliferação e/ou morte celular. Foi avaliado o efeito do POH e do PA seu principal metabólito, sobre a atividade da NKA em duas linhagens de células de glioblastoma (GBM) humano (U87 e U251), células não tumorais de astrócitos de camundongo e da linhagem (VERO). Nossos resultados, baseados na avaliação da atividade da NKA por incorporação do Rb+, o qual mimetiza o K+, mostraram uma sensibilidade à inibição pelo POH semelhante entre os quatro tipos de células (IC50 U87 2 mM; U251 1,8 mM; VERO 2,4 mM e astrócitos de camundongo 1,4 mM), enquanto o PA não apresentou efeito. Sabe-se que nos GBMs existe uma superexpressão da subunidade \03B11 da NKA, situada na estrutura das cavéolas que é provavelmente responsável pelo papel sinalizador atribuído a essa enzima, especialmente em relação aos mecanismos apoptóticos. Comparamos a viabilidade celular, determinando a atividade da enzima lactato desidrogenase presente no sobrenadante das células tratadas por 24 h com POH e PA O PA não alcançou efeito citotóxico igual ou superior a 30% nas células mesmo na concentração elevada de 4 mM. Já o POH reduziu, de maneira dependente da concentração, a viabilidade das células (IC50 U87 1,1 mM; U251 1,4 mM; VERO 0,9 mM e astrócitos de camundongo 1,4 mM). Na análise por western blot, 1,5 mM de POH ativou a proteína c-Jun N-terminal quinase (JNK), nas células U87, U251 e nos astrócitos de camundongo (incubação de 30 min). O uso do inibidor Src quinase (dasatinibe) e a depleção colesterol da membrana celular com metil \03B2-ciclodextrina reduziram a ativação da JNK1/2 induzida pelo POH nas células U87, indicando a possível participação do complexo NKA-Src (presente nas cavéolas), nesta via de sinalização. POH (1,5 mM) aumentou a liberação da interleucina IL-8, detectada por ELISA, no sobrenadante das células U251 (24 h incubação), indicando possível estratégia destas células para evitar o efeito citotóxico do POH. Resultados obtidos com citometria de fluxo mostram que a inibição da JNK1/2 (pelo inibidor JNK V) reduz a apoptose ocasionada pelo POH nas células de GBM, indicando o envolvimento desta proteína na morte celular programada. Os resultados obtidos mostram que o mecanismo de sinalização celular mediado pela NKA pode ter um importante papel no mecanismo de ação antitumoral do POH em células de GBM / The Na + , K + ATPase (NKA) acts in keeping the cell membrane potential and in signal transduction mechanisms . Modifications in the activity of this enzyme are important in physiological and patholog ical processes. The NKA is inhibited by perillyl a lco h ol (POH), a monotherpene used in the treatment of tumors, including brain tumors. In this work , we also show that POH act s in signal ing cascades associated to NKA, controlling cell proliferation and/or cellular death. We evaluated the effect of POH and o f its main metabolite (peri l lic acid - PA) on the NKA a ctivity in cultured glioblastoma cells ( GBM) U87 and U251 and on non - tumor cells (mouse astrocytes and VERO cells) . N AK activity was measured by non - radioactive Rb + incorporation by cells (Rb + is a K + substitute). Our results showed a similar sensitivity for the four cells types tested (IC 50 U87 – 2 mM; U251 - 1,8 mM; VERO - 2,4 mM and mouse astrocy tes - 1,4 mM). Peri l lic acid did no t show any effect i n any cell type. In GBMs , it is known that NKA α 1 subunit is super expressed. Thi s isoform is embedded in caveolar structures and is probably responsible by the signaling properties of this enzyme in apoptosis mechanisms. Cell viability was measured by lactate dehydr o genase in cell supernatants of POH treated cells. The maximum PA cy totoxic effect obtained was 30% even at 4 mm. However, POH reduced dose dependently cell viability , (IC 50 U87 - 1,1 mM; U251 - 1,4 mM ; VERO - 0,9 mM and mouse astrocyte - 1,4 mM). Considering the western blot analysis, 1,5 m M POH activated the c - Jun N - terminal K inase (JNK), on U87, U251 and in mouse astrocy tes after 30min incubation . D a satinib (an inhibitor of Src K inase) and methyl β - ci clodextrin (which promotes cholesterol depletion in cell membrane s ) reduced JNK 1/2 activation induced by POH in U87 cells, indicating the participation of NKA - Src comp lex seen in caveolar structure in this mechan ism. 1,5mM POH a fter 24h incubation incr ease interleuk in IL - 8 in U251 cell supernatant, and this may indicate a possible strategy to avoid the cy totoxic effect of POH. Results obtained by flux cy tometry showed that the inhibition of JNK1/2 (by the inhibitor JNK V) reduced apoptosis consequent to POH administration in GBM cells, indicating the involv e ment of this protein in programmed cellular death. Our results seem to indicate that a signaling mechanism mediate d by NKA may have an important role in ant i - tumor al action of POH in GBM cells. / GARCIA, D. G. Sinalização de morte celular via NA+, K+-ATPase como alvo de drogas anticâncer: estudos com o álcool perílico. 2013. 86f. Tese (Doutorado em Biologia Celular e Molecular) - Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz, Rio de janeiro, RJ, 2013

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:02:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Universidade Federal de Pernambuco / Ganoderma lucidum é um basidiomiceto muito popular na medicina tradicional chinesa, sendo chamado de Lingzhi ou cogumelo da imortalidade . Estudos revelaram diversas propriedades farmacológicas benéficas deste fungo, sugerindo sua utilização como auxiliar em diversos tratamentos contra doenças humanas. Por não ser muito comum na natureza, o cultivo é a melhor maneira de suprir um mercado cada vez mais amplo. Dentre os vários métodos de cultivo existentes para a fungicultura, a técnica Jun-Cao é considerada a mais promissora para a produção de cogumelos em escala que atenda à demanda crescente. Sabendo que a bioquímica de um organismo pode variar entre diferentes linhagens, e entendendo a necessidade de descobrir novas variedades de G. lucidum, para ampliar as opções de cultivo deste fungo, este trabalho buscou comparar linhagens comerciais chinesas com linhagens brasileiras inexploradas de G. lucidum, para avaliar o valor bioquimico destas. Os resultados mostram que o cultivo combinado de madeira com gramínea, na técnica Jun-Cao, foi mais promissor no desenvolvimento das linhagens tanto em redução no tempo de cultivo quanto na qualidade e quantidade dos cogumelos. A linhagem brasileira (CC-144) destacou-se tanto na velocidade de crescimento, quanto na produtividade de basidiomas e na concentração bioquímica de proteínas, carboidratos, β- glucanas e fenóis, superando as chinesas e se mostrando uma opção para a fungicultura. A análise RAPD mostrou distinção genética entre as linhagens, descartando a possibilidade de ocorrência de clones

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