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The present set of studies examines the roles of two ion-motive enzymes, vacuolar-type H+-ATPase (VA) and Na+/K+ ATPase (NKA), in energizing transepithelial ion transport across the larval caecum and midgut epithelia of Drosophila melanogaster and Aedes aegypti. Even though both VA and NKA are expressed in insect epithelia, VA was considered the more important enzyme until the early 2000 because the ion transport was unaffected by the NKA inhibitor ouabain in many insect epithelia, a phenomenon termed the ‘ouabain paradox’. This paradox was resolved by the discovery of an organic anion transporter (OATP) that is colocalized with NKA and prevents the actions of ouabain on NKA. Since the resolution of the ouabain paradox, this is the first set of studies that investigates the role of NKA in energizing ion transport across the caeca and midgut of insects. First, I show that both VA and NKA are expressed in the caecum and the midgut. Moreover, the ATPase enzyme activities of VA and NKA are quantitatively similar within each region of the gut that was studied, suggesting that both ATPases may be important for establishing favourable electrochemical gradients for transport of ions across the gut. I used ATPase inhibitors to demonstrate that cation transport is dependent on the actions of both VA and NKA. Furthermore, this is the first set of studies that provides an insight into the ion transport mechanisms of the gastric caecum, an organ that is understudied in insects. In Aedes aegypti, I show that 5-hydroxytryptamine regulates the VA-rich cells of the gastric caecum, and therefore the rates of ion transport of these cells. Additionally, I also show that rearing salinity conditions for Aedes aegypti larvae alters the expression patterns of VA and NKA in the gastric caecum. In freshwater, increased activity of VA and NKA energizes transport of ions into the lumen of the caecum that likely maintains fluid volumes and ionic composition at levels appropriate for digestion and absorption. Overall, these studies provide novel information for caeca and midgut-specific actions of VA and NKA in insects, and present a number of new avenues for future research. / Thesis / Doctor of Philosophy (PhD) / This thesis focuses on investigating the roles of two enzymes, vacuolar-type H+-ATPase (VA) and Na+/K+ ATPase (NKA), which utilize energy to transport electrically charged atoms (ions) across the cells of the insect gut. Although VA was considered the more important of the two enzymes until the early 2000s, I have demonstrated that NKA also plays a role in maintaining insect gut function in fruit flies and mosquito larvae. Furthermore, the activities of both enzymes are dependent on the salinity of the medium in which mosquito larvae are reared, suggesting that they play a role in maintaining the ionic composition of the gut fluids in freshwater larvae. Additionally, I have also demonstrated that a neurochemical, serotonin, can modulate the activity of gut cells in mosquito larvae. Overall, this thesis provides novel information on the actions of VA and NKA in the insect gut, and presents a number of new avenues for future research.

A (Na+,K+)-ATPase é uma proteína integral da membrana plasmática que está sujeita a uma complexa regulação. Na fauna dos manguezais, dentre os crustáceos se destaca o caranguejo Cardisoma guanhumi (Latreille, 1825), um crustáceo decápode que desempenha um papel significativo na dinâmica deste ecossistema, considerado relevante recurso pesqueiro. Este estudo fornece o efeito das poliaminas, das enzimas do estresse oxidativo, da toxidade do amônio, e também investiga atividade K+-fosfatase e atividade (Na+,K+)-ATPase por estimulação sinérgica de K+/ NH4+ e NH4+/K+ na fração microsomal de brânquias do guaiamum. A atividade K+-fosfatase e a atividade (Na+,K+)-ATPase foram determinadas continuamente, a 25°C, em um espectrofotômetro Shimadzu U1800 equipado com células termostatizadas. Todos os experimentos foram feitos em duplicata utilizando-se pelo menos três preparações diferentes (N 3). A atividade PNFFase insensível à ouabaína representa 40% da atividade PNFFase total, e valor do KI foi de 370,0 18,5mol L-1. A atividade específica máxima estimada foi de 29,30 ± 1,46 nmol Pi min-1 mg-1 e o KM = 2,90 ± 0,14 mmol L-1. Por outro lado, a utilização do substrato fisiológico (ATP) permitiu a determinação de parâmetros cinéticos da atividade (Na+,K+)-ATPase em relação aos moduladores ATP, potássio, sódio, magnésio, amônio e, ouabaína. A atividade ATPase total na fração microsomal do tecido branquial de C. guanhumi recém-capturado (16 S) foi aproximadamente 166 nmol Pi min-1 mg-1 e uma atividade ATPase insensível à ouabaína de 26,55 nmol Pi min-1 mg-1, enquanto que aclimatado a 22 S a atividade ATPase total foi de 303,28 ± 15,16 nmol Pi min-1 mg-1 e a atividade insensível à ouabaína de 68,60 ± 3,43 nmol Pi min-1 mg-1. A (Na+,K+)-ATPase presente nessas duas preparações, não apresentam uma estimulação sinergística por K+ e NH4+. Houve alterações na afinidade da enzima para o ATP nas três diferentes concentrações de NH4Cl (120 mg/L; 240 mg/L; 360 mg/L) em comparação com o controle sem NH4Cl (KM= 0,1 ± 0,005 mmol L-1).Não foram observados efeitos significativos utilizando aminas biogênicas. Nossas análises mostraram também que as enzimas do estresse oxidativo estão atuando nestas diferentes preparações para combater os oxirradicais. Análise por Western blotting com anticorpo monoclonal revelou a presença de uma banda correspondente a subunidade da (Na+,K+)-ATPase com massa molecular 110 kDa. A imunolocalização mostrou que a subunidade da (Na+,K+)-ATPase encontra-se predominantemente distribuída por todo o citoplasma das células pilares branquiais, incluindo a região apical abaixo da cutícula. Identificamos o gene constitutivo da sequência parcial de nucleotídeos do cDNA da proteína ribosomal L10 (PRL10) das brânquias deCardisoma guanhumi. O estudo demonstrou que a (Na+,K+)-ATPase constitui um importante regulador da osmorregulação nesta espécie, contribuindo para um melhor entendimento dos papéis exercidos por essa enzima nos processos de osmorregulação e excreção de amônia nos crustáceos. / The (Na+,K+)-ATPase is an integral plasma membrane protein that is subject to complex regulation. In the mangrove fauna, the crustaceans include Cardisoma guanhumi crab (Latreille, 1825), a decapod crustacean that plays a significant role in the dynamics of this ecosystem, considered a relevant fishing resource. This study provides the effect of polyamines, oxidative stress enzymes, ammonium toxicity, and also investigates K+-phosphatase activity and (Na+,K+)-ATPase activity by synergistic K+/NH4+ and NH4+/ K+ stimulation in the microsomal fraction of guaiamum gills. The K+-phosphatase activity and (Na+,K+)-ATPase activity were determined continuously at 25°C on a Shimadzu U1800 spectrophotometer equipped with thermostated cells. All experiments were done in duplicate using at least three different preparations (N 3). The PNFFase activity insensitive to ouabain represents 40% of the total PNFFase activity, and KI value was 370,0 18,5mol L-1. The maximum specific activity estimated was 29.30 ± 1.46 nmol Pi min-1 mg-1 and KM = 2.90 ± 0.14 mmol L-1. On the other hand, the use of the physiological substrate (ATP) allowed the determination of kinetic parameters of the activity (Na+,K+)-ATPase in relation to the modulators ATP, potassium, sodium, magnesium, ammonium and ouabain.The total ATPase activity in the microsomal fraction of freshly caught C. guanhumi (16 S) gill tissue was approximately 166 nmol Pi min-1 mg-1 and a 26.55 nmol Pi min-1 mg-1 ouabain ATPase activity, while acclimated at 22 S the total ATPase activity was 303.28 ± 15.16 nmol Pi min-1 mg-1 and the ouabain insensitive activity of 68.60 ± 3.43 nmol Pi min-1 mg-1. The (Na+,K+)-ATPase present in these two preparations, do not present a synergistic stimulation by K+ and NH4+. There were changes in the enzyme affinity for ATP at the three different concentrations of NH4Cl (120 mg / L, 240 mg / L, 360 mg / L) compared to the control without NH4Cl (KM = 0.1 ± 0.005 mmol L-1). No significant effects were observed using biogenic amines. No significant effects were observed using biogenic amines. Our analyzes have also shown that oxidative stress enzymes are acting in these different preparations to combat oxirradicals. Analysis by Western blotting with monoclonal antibody revealed the presence of a band corresponding to sub subunit of (Na+,K+)-ATPase with molecular mass 110 kDa. Immunolocalization showed that the (Na+,K+)-ATPase sub subunit is predominantly distributed throughout the cytoplasm of the gill pillars, including the apical region below the cuticle. We identified the constitutive gene of the nucleotide partial sequence of the cDNA of ribosomal protein L10 (PRL10) of the gills of Cardisoma guanhumi. The study demonstrated that (Na+,K+)-ATPase is an important regulator of osmoregulation in this species, contributing to a better understanding of the roles played by this enzyme in the processes of osmoregulation and excretion of ammonia in crustaceans.

Os crustáceos são originariamente marinhos; ao longo da evolução, diversas espécies invadiram ambientes de salinidades menores, chegando à água doce. A capacidade dos crustáceos colonizarem com sucesso o ambiente dulcícola depende do desenvolvimento de mecanismos eficientes de hiperosmorregulação. A osmolalidade e a composição iônica da hemolinfa de um crustáceo, em meios diluídos, refletem o equilíbrio dinâmico entre a perda de íons por difusão e pela urina e sua reabsorção do meio externo, através das brânquias. A (Na,K)-ATPase branquial desempenha um papel chave no processo de captura de Na+ a partir de ambientes diluídos e suas características cinéticas vem sendo investigadas recentemente, embora as enzimas de caranguejos dulcícolas sejam pouco conhecidas. Segundo o modelo atual, a afinidade por Na+ é o parâmetro cinético mais variável entre as enzimas de diferentes espécies, refletindo a salinidade do habitat do animal, de modo que enzimas de espécies bem adaptadas à água doce apresentam afinidades maiores por Na+. Entretanto, vários resultados conflitantes têm sido relatados nos últimos anos. Recentemente, foi proposto que uma V-ATPase também desempenha papel essencial na captação de Na+ através das brânquias dos crustáceos dulcícolas. Esta enzima ainda é praticamente desconhecida: suas características cinéticas não foram estudadas e a relação entre a magnitude da sua atividade e a salinidade do meio externo não está estabelecida. Este projeto teve por objetivo a caracterização das enzimas (Na,K)-ATPase e V-ATPase das brânquias posteriores do caranguejo hololimnético Dilocarcinus pagei, considerado um antigo invasor da água doce. A (Na,K)-ATPase foi caracterizada em animais mantidos em água doce, a fim de comparar suas propriedades cinéticas com aquelas das enzimas de outras espécies de caranguejos, habitantes de meios mais salinos, visando melhorar o entendimento das adaptações bioquímicas associadas à invasão da água doce. A V-ATPase foi caracterizada em animais mantidos em água doce ou expostos por diferentes intervalos de tempo à salinidade de 21‰ ou ainda aclimatados por 10 dias a diferentes salinidades (5-21‰), visando estabelecer uma relação entre a magnitude da atividade e a salinidade do meio, além de investigar os mecanismos de regulação da atividade da enzima. A análise da fração microsomal branquial de D. pagei mantido em água doce em gradiente contínuo de sacarose mostrou dois picos protéicos (25-35% e 35-45% de sacarose), ambos com atividades K+-fosfatase, (Na,K)-ATPase e V-ATPase. Estes resultados indicam a presença de frações de membrana com densidades distintas, apresentando, em ambos os casos, as principais bombas de íons envolvidas na captação de Na+. Estas membranas podem ser originárias de locais distintos do epitélio branquial posterior assimétrico deste caranguejo. A análise por Western blotting revelou duas bandas imunoespecíficas (Mr 116 kDa e 105 kDa) correspondentes à subunidade α da (Na,K)-ATPase, sugerindo a presença de duas isoformas nas brânquias posteriores do animal. A estimulação da atividade K+-fosfatase da (Na,K)-ATPase pelo PNFF envolveu interações sítio-sítio (nH= 1,4), com V= 43,4 ± 2,2 U mg-1 e K0,5= 1,13 ± 0,06 mmol L-1. A estimulação da atividade da enzima por K+ (V= 39,9 ± 1,9 U mg-1 e K0,5= 4,2 ± 0,2 mmol L-1), Mg2+ (V= 45,0 ± 2,2 U mg-1, K0,5= 0,82 ± 0,04 mmol L-1) e NH4+ (V= 31,7 ± 1,6 U mg-1, K0,5= 19,0 ± 0,9 mmol L-1) também ocorreu por meio de interações sítio-sítio. A afinidade aparente da enzima pelo PNFF e Mg2+ foi similar às relatadas para enzimas de outros crustáceos, incluindo caranguejos habitantes de meios mais salinos. Entretanto, a enzima de D. pagei apresentou menor afinidade aparente por íons K+ que as outras espécies já estudadas. A atividade K+-fosfatase da (Na,K)-ATPase branquial de D. pagei mantido em água doce foi estimulada sinergicamente por K+ e NH4+ sugerindo a presença de dois sítios de ligação para estes íons na molécula da enzima. Ouabaína (4 mmol L-1) inibiu a atividade PNFFase total da preparação (≈ 89%), por meio de uma curva monofásica (KI= 225,6, ± 11,3 µ mol L-1), sugerindo que, se presentes na fração microsomal, as duas isoenzimas da (Na,K)-ATPase apresentam sensibilidades próximas para o inibidor. Ortovanadato (1µmol L-1) inibiu 95% da atividade PNFFase total por meio de uma curva bifásica, reforçando a sugestão da presença de duas isoenzimas na preparação. A hidrólise do ATP pela (Na,K)-ATPase branquial de D. pagei mantido em água doce ocorreu em sítios de alta (V= 6,4 ± 0,32 U mg-1 e K0,5 = 0,34 ± 0,02 µmol L-1) e baixa afinidade (V= 127,1 ± 6,2 U mg-1e KM = 84 ± 4,1 µmol L-1). Não foi encontrada uma correlação direta entre a afinidade pelo ATP e o habitat de diferentes espécies de caranguejos. A atividade (Na,K)-ATPase específica de D. pagei mantido em água doce foi cerca de 3 vezes menor que relatada para Potamon edulis, única espécie de caranguejo dulcícola para a qual este parâmetro foi relatado. Atividades específicas muito maiores foram encontradas para caranguejos estuarinos, particularmente quando aclimatados a salinidades baixas. A baixa atividade específica determinada para D. pagei pode ser atribuída ao baixo gradiente osmoiônico que este animal mantém entre a hemolinfa e o meio externo, comparado a outros caranguejos dulcícolas, que o caracteriza como uma espécie particularmente bem adaptada ao ambiente dulcícola. A estimulação da atividade da enzima por íons Na+ (V = 133,8 ± 7,3 U mg-1e K0,5= 4,7 ± 0,3 mmol L-1), Mg2+ (V= 136,5 ± 8,0 U mg-1, K0,5= 0,62 ± 0,04 mmol L-1), K+ (V = 131,7± 7,9 U mg-1 e K0,5= 0,47 ± 0,03 mmol L-1) e NH4+ (V= 125,6 ± 6,3 U mg-1, K0,5= 1,90 ± 0,09 mmol L-1) ocorreu por meio de interações sítio-sítio. A afinidade aparente por Na+ da enzima de D. pagei é baixa, se comparada às relatadas para outros animais dulcícolas, e similar às encontradas para espécies estuarino/marinhas. Em contraste, a afinidade aparente por K+ é 2,5 a 5 vezes maior que as determinadas para espécies habitantes de meios mais salinos e aparentemente está mais relacionada ao habitat do animal que a afinidade por Na+. Esta possibilidade é coerente com o fato da (Na,K)-ATPase branquial dos crustáceos apresentar os sítios de ligação de K+ expostos para a hemolinfa, o que possibilita a modulação da atividade da enzima pela concentração de K+ na hemolinfa. Ao contrário do observado para várias outras espécies de caranguejos, a atividade (Na,K)-ATPase branquial de D. pagei não foi estimulada sinergisticamente por K+ e NH4+. Entretanto, a presença de um dos íons no meio reacional provoca o aumento da afinidade aparente da enzima pelo outro em cerca de 3 vezes. Fisiologicamente, esta característica cinética pode ser importante para garantir o transporte de ambos os íons pela enzima, mesmo em presença de concentrações relativamente elevadas do outro. Ouabaína (3 mmol L-1) inibiu a atividade ATPase total (≈ 78%) por meio de uma curva bifásica (KI= 6,21 ± 0,32 µmol L-1 e 101,2 ± 5,1 µmol L-1), reforçando os resultados anteriores no sentido de demonstrar a existência de duas isoenzimas da (Na,K)-ATPase nas brânquias posteriores de D. pagei. Observou-se também uma inibição bifásica por ortovanadato (10 µmol L-1), que inibiu a atividade ATPase total em 85%. O pH ótimo para a atividade V-ATPase branquial de D. pagei foi de 7,5. A modulação da atividade V-ATPase do animal mantido em água doce por ATP (V= 26,5 ± 1,3 U mg-1; K0,5= 3,9 ± 0,2 mmol L-1) e Mg2+ (V = 27,9 ± 1,4 U mg-1; K0,5 =0,80 ± 0,04 mmol L-1) ocorreu por meio de interações cooperativas. Já a inibição da atividade ATPase insensível ao ortovanadato por bafilomicina A1 ocorreu segundo uma curva monofásica (KI= 55,0 ± 2,8 nmol L-1). Cerca de 44 % da atividade ATPase total foi inibida, correspondendo à V-ATPase. A atividade V-ATPase branquial de D. pagei diminuiu acentuadamente em resposta à exposição à salinidade de 21‰. Após 1h de exposição, a atividade diminuiu cerca de 3 vezes, chegando a 4 vezes após 24h, o que indica a atuação de mecanismos eficientes de regulação a curto prazo. Curiosamente, a atividade V-ATPase foi cerca de 2 vezes maior para um tempo de aclimatação de 120h a 21‰, comparado a 24 h, embora 2 vezes menor que a estimada em água doce. Passadas 240 h, a atividade voltou aos baixos níveis observados entre 1h e 24h, o que indica a ação de mecanismos de regulação a longo prazo. Além da diminuição da atividade específica também foi observado aumento da afinidade da enzima por ATP (12 vezes) e Mg2+ (3 vezes) em resposta à exposição dos animais a 21‰. Similarmente, ocorreu um aumento de até 190 vezes na afinidade da enzima por bafilomicina A1. Propõe-se que, em resposta à alteração de salinidade, ocorrem mudanças conformacionais tanto em V1 (onde se encontram os sítios de ligação de ATP e Mg2+) quanto V0 (onde se localiza o sítio de ligação de bafilomicina), resultando numa maior exposição do sítio para o inibidor e no aumento da afinidade por Mg2+ e ATP. Como os aumentos de afinidade são observados já após 1h de exposição, este mecanismo parece ser independente da expressão protéica e, portanto, não estaria relacionado à expressão de isoformas diferentes de alguma das subunidades da enzima. A diminuição da atividade V-ATPase branquial de D. pagei em resposta à exposição a uma salinidade elevada é compatível com os mecanismos propostos para a atuação desta enzima no processo de captura ativa de Na+ em crustáceos dulcícolas. Após 10 dias de aclimatação ainda se tem atividade V-ATPase detectável nas frações microsomais das brânquias posteriores do animal, possivelmente envolvida nas funções de regulação ácido-base e excreção de amônia. Os resultados obtidos para a aclimatação de D. pagei por um período de 10 dias a salinidades entre 5 e 21‰ mostraram também uma diminuição acentuada da atividade V-ATPase em resposta ao aumento da salinidade. Entretanto, com exceção da salinidade mais baixa (5‰) não se observou aumento da afinidade da enzima por bafilomicina, sugerindo que esta alteração seja limitada a tempos de aclimatação mais curtos. Entretanto, também se verificou um aumento acentuado da afinidade da enzima por ATP e Mg2+. / Crustacean arose in the sea but, during evolution, several species invaded lower salinity biotopes, reaching fresh water. The ability of crustaceans to successfully colonize the freshwater biotope depends on efficient mechanisms of hyperosmoregulation. In dilute media, crustaceans\' hemolymph osmolality and ionic composition reflect a balance between diffusive and urinary ion losses, and active ion capture through the gills. The gill (Na,K)- ATPase plays a pivotal role in Na+ capture from dilute environments and its kinetic characteristics are under investigation in recent years, although freshwater crab enzymes are poorly known. According to the most recent model, the apparent affinity for Na+ is the most variable kinetic parameter among gill enzymes from different species, and reflects the salinity of the species\' habitat. Thus, enzymes from species which are well adapted to freshwater usually present higher affinities for Na+. However, several recent results are incompatible with this model. On the other hand, it has been proposed that a V-ATPase is also involved in Na+ capture through the gills of hololimnetic crustaceans. This enzyme is almost completely unknown: its kinetic characteristics have not been studied yet and the relationship between the magnitude of its activity in the gills and the external medium salinity has not been established. This work aimed to characterize the (Na,K)-ATPase and V-ATPase from the posterior gill from the holimnetic crab Dilocarcinus pagei, considered an old fresh water colonizer. The (Na,K)- ATPase was characterized in animals maintained in fresh water, in order to establish a comparison of its kinetic properties with those of enzymes from other crab species that inhabit more saline media. This comparison may enhance our understanding of the biochemical adaptations associated to fresh water invasion. V-ATPase was characterized in animals kept in fresh water or exposed for varying time intervals to a medium of 21? salinity, or else acclimated for 10 days to media of different salinities (5-21?), aiming to establish a relationship between the enzyme specific activity in the gill tissue and the external salinity, and also investigate the mechanisms involved in enzyme activity regulation. The analysis of D. pagei gill microsomes in a continuous-density sucrose gradient revealed two protein peaks (25-35% and 35-45% sucrose), both showing K+-phosphatase, (Na,K)-ATPase and V-ATPase activities. These results indicate the presence of membrane fractions of distinct densities, both presenting the main ion pumps involved in Na+ capture. These membranes may originate from different places in the asymmetric posterior gill epithelium from this crab. Western compared to those reported for other freshwater animals, but similar to those found for estuarine/marine species. In contrast, the apparent affinity for K+ is 2.5 to 5-fold higher than those estimated for species that inhabit more saline media, and is apparently more related to the animals\' habitat than Na+ affinity. This possibility is consistent with the location of the (Na,K)-ATPase in crabs gill tissue, with K+ binding sites exposed to the hemolymph, allowing the direct modulation of enzyme activity by hemolymph K+ concentration. In contrast to data reported for other crab species, D. pagei gill (Na,K)-ATPase activity was not synergistically stimulated by K+ and NH4 +. However, the presence of one of these ions in the reaction medium results in an increase of about 3-fold in the apparent affinity of the enzyme for the other. This kinetic characteristic may be physiologically relevant to assure the transport of both ions, even in the presence of elevated concentrations of the other. Ouabain (3 mmol L-1) inhibited total ATPase activity (? 78%) through a biphasic curve (KI= 6.21 ± 0.32 mol L-1 and 101.2 ± 5.1 mol L-1) reinforcing previous results suggesting the presence of two isoenzymes in the microsomal preparations. A biphasic inhibition by orthovanadate (10 mol L-1) to about 15% residual activity was also observed. Optimal pH for D. pagei gill V-ATPase activity was 7.5. The modulation of enzyme activity of the animal kept in fresh water by ATP (V= 26.5 ± 1.3 U mg-1; K0.5= 3.9 ± 0.2 mmol L-1) and Mg2+ (V = 27.9 ± 1.4 U mg-1; K0.5 =0.80 ± 0.04 mmol L-1) occurred with positive cooperativity. The inhibition of the orthovanadate insensitive ATPase activity by bafilomycin A1 followed a monophasic curve (KI= 55.0 ± 2.8 nmol L-1). About 44 % of total ATPase activity was inhibited, corresponding to the V-ATPase. Dilocarcinus pagei gill V-ATPase activity substantially decreased in response to animal\'s exposure to 21? salinity. After 1h exposure, the activity diminished about 3-fold, reaching 4- fold after 24h, indicating the action of efficient short-time regulation mechanisms. Interestingly, V-ATPase activity was about 2-fold higher after 120h exposure, compared to 24h, although 2- fold lower compared to that estimated in fresh water. After 240h, the activity returned to the low levels observed for 1 and 24 h, indicating efficient long-term regulation. Besides the decrease in specific activity, it was also observed an increase in enzyme\'s apparent affinity for ATP (12 fold) and Mg2+ (3 fold) in response to animal\'s exposure to 21? salinity. Simultaneously, the enzyme\'s affinity for bafilomycin A1 increased up to 190-fold. We propose that, in response to salinity alteration, conformational changes take place both in V1 (in which the ATP and Mg2+ binding sites are located) and V0 (which contains the bafilomycin A1 bindind site), resulting in higher exposition of the inhibitor binding site and also higher affinity for Mg2+ and ATP. As the affinity increases are observed after just 1h exposure, this regulatory mechanism seems to be independent of protein expression and, thus, should not be related to the expression of distinct isoforms of some enzyme subunit. The lowering of gill V-ATPase activity in D. pagei in response to exposure to an elevated salinity is consistent with the mechanisms proposed for the role of this enzyme in active Na+ capture in hololimnetic crustaceans. After 10 days at 21, the gill microsomal fractions still show a little V-ATPase activity, possibly related to acid-base regulation and ammonia excretion processes. The results obtained for the acclimation of D. pagei for 10 days at salinities in the range 5 to 21? also showed a substantial decrease of V-ATPase activity in response to the increase in medium salinity. However, except for 5?, it was not observed an increase of enzyme\'s affinity for bafilomycin, suggesting that this alteration is limited to shorter periods of exposure. However, a significant increase in the enzyme\'s affinity for ATP and Mg2+ was also observed.