A ouabaína (OUA) promoveu hipertensão arterial (HA) após 5, 10 e 20 semanas de tratamento e modificou a função vascular de artérias mesentéricas de resistência (AMR). O tratamento por 5 semanas com OUA aumentou o óxido nítrico (NO) e a expressão protéica da isoforma neuronal de óxido nítrico (nNOS), ao passo que diminuiu os prostanóides vasoconstritores. Além disso, reduziu a expressão protéica da Cu-Zn superóxido dismutase (SOD) e aumentou a atividade funcional da Na+K+-ATPase. Já o tratamento por 10 semanas com OUA aumentou NO e prostanóides vasodilatadores, enquanto diminuiu a expressão protéica da nNOS e da COX-2. O tratamento por 20 semanas reduziu o NO e a expressão protéica da nNOS. Porém, aumentou o ânion superóxido, o tromboxano A2 e a expressão protéica de ambas: a SOD e a COX-2. Em conclusão, o tratamento com OUA promoveu HA e alterações funcionais em AMR, sendo estas dependentes do tempo analisado, pois no tratamento durante 5 e 10 semanas estas alterações não contribuem para a manutenção da HA, enquanto que o tratamento durante 20 semanas contribui. / Ouabain treatment (OUA) developed hypertension after 5, 10 and 20 weeks and modified the vascular function in mesenteric resistance arteries (MRA). 5-weeks treatment with OUA increased nitric oxide (NO) and neuronal isoform of nitric oxide (nNOS) protein expression. On the other side, this treatment reduced vasoconstrictors prostanoids. Besides decreased Cu-Zn superoxide dismutase (SOD) protein expression and increased functional activity of Na+K+-ATPase. 10-weeks treatment enhance NO and vasodilators prostanoids but reduced both nNOS and COX-2 protein expression. 20-weeks treatment reduced NO and nNOS protein expression. Nevertheless increased anion superoxide, tromboxan A2 and both SOD and COX-2 protein expression. In conclusion, OUA treatment induced HA and functional alterations in MRA that are time-dependents, because in 5 and 10 weeks of treatment these alterations are not likely to maintenance of HA, but the changes observed in the treatment during 20 weeks contributes.

As propriedades bioquímicas da (Na+,K+)-ATPase branquial do siri eurialino Callinectes danae aclimatado à salinidade de 15 o/oo foram estudadas. A análise do gradiente de centrifugação em sacarose revelou a presença de um único pico entre 30-35% de sacarose, com uma boa correlação entre as atividades PNFFase a ATPase totais e (Na+,K+)-ATPase. A atividade residual observada na presença de ouabaína 3 mM sugere a presença de outros sistemas de enzimas atuantes. A eletroforese em condições desnaturantes nos microsomas de brânquias de C. danae em animais recém-coletados em salinidade de 33 o/oo (não aclimatados) e de aclimatados a salinidades de 15 e 33 o/oo por um período de 10 dias mostrou a presença de pequenas diferenças nos padrões eletroforéticos das diferentes amostras. A análise por Western blot mostrou um aumento significativo da proporção relativa da subunidade alfa da (Na+,K+)-ATPase em relação à proteína total na fração microsomal do tecido branquial de animais aclimatados à salinidade de 15 o/oo quando comparados aos animais aclimatados a 33 o/oo. Entretanto, proporções similares de subunidade alfa foram observadas para amostras de animais recém-coletados a salinidade de 33 o/oo e aclimatados a 15 o/oo. A estimulação da atividade (Na+,K+)-ATPase pelo ATP ocorreu através de uma curva de saturação monofásica apresentando interações sítio-sítio (nH=1,2), com V= 298,8 ± 16,7 U/mg, com K0,5 de 174,2 ± 9,8 uM. A estimulação da atividade ATPase da (Na+,K+)-ATPase por íons Mg2+ (V= 299,16 ± 14,06 U/mg; K0,5= 767,31 ± 36,06 uM), íons Na+ (V= 309,0 ± 15,8 U/mg; K0,5= 7,8 ± 0,4 mM), íons K+ (V= 300,6 ± 15,3 U/mg; K0,5= 1,63 ± 0,08 mM) e íons NH4+ (V= 345,1 ± 19,0 U/mg; K0,5= 6,0 ± 0,3 mM) ocorreu através de interações sítio-sítio. A atividade da enzima foi modulada sinergisticamente pelos íons K+ com atividade máxima variando de 300,6 ± 15,3 U/mg para 514,6 ± 26,2 U/mg, na ausência e na presença 50 mM de íons NH4+, respectivamente. Além disso, foi observado um significativo aumento na afinidade aparente da enzima pelo íon K+ da ordem de 10 vezes (diminuiu de 1,6 ± 0,08 mM para 0,157 ± 0,008 mM). Similarmente ao observado para os íons K+, o íon NH4+ estimulou sinergisticamente a atividade da enzima na presença de diferentes concentrações de íons K+. A estimulação da atividade da enzima pelo íon NH4+ também ocorreu através de interações cooperativas entre os sítios. Embora tenha sido observado um aumento da atividade específica da enzima de 345,1 ± 19,0 U/mg para 516,8 ± 27,9 U/mg, não foram observadas variações significativas nos valores de nH e K0,5 com o aumento da concentração de íons K+. A ouabaína inibiu cerca de 90% da atividade ATPase total. A inibição pela ouabaína apresentou valor de KI de 45,09 ± 2,51 uM. O ortovanadato também inibiu atividade (Na+,K+)-ATPase na mesma faixa (90%) através de uma curva de inibição monofásica, com valor de KI da ordem de 1,31 ± 0,06 uM. O emprego de bafilomicina A1, tapsigargina e teofilina, juntamente com a ouabaína, na atividade ATPase total descartam a presença de V-ATPase, Ca2+-ATPase ou fosfatase, respectivamente. Apesar da inibição por oligomicina corresponder a menos de 3,7%, esse valor aparentemente sugere a presença de uma F0F1-ATPase. Além disso, a inibição por ácido etacrínico, em conjunto com os experimentos de estimulação por da atividade ATPase da enzima por íons Na+ sugere fortemente a presença de uma K+-ATPase. A (Na+,K+)-ATPase hidrolisou o substrato PNFF obedecendo à cinética Michaeliana com velocidade de V= 102,9 ± 4,3 U/mg e KM= 1,7 ± 0,1 mM. Já a estimulação da atividade K+-fosfatase da enzima por íons Mg2+ (V= 93,7 ± 2,3 U/mg; K0,5= 1,40 ± 0,03 mM), K+ (V= 94,9 ± 3,5 U/mg; K0,5= 2,9 ± 0,1 mM) e NH4+ (V= 106,2 ± 2,2 U/mg; K0,5= 9,8 ± 0,2 mM) seguiu uma cinética cooperativa, sugerindo a presença de múltiplos sítios de ligação. Entretanto, a atividade K+-fosfatase não foi estimulada sinergísticamente na presença de íons K+ mais NH4+. Os íons sódio (KI= 22,7 ± 1,7 mM) e ortovanadato (KI= 28,1 ± 1,4 nM) inibiram completamente a atividade fosfatase total através de uma única curva de inibição. / The biochemical properties of the (Na+,K+)-ATPase from the gill microsomal tissue of the euryhaline, marine, swimming crab Callinectes danae, acclimated to 15 0/00 salinity, were investigated. Sucrose gradient centrifugation analyses revealed a unique peak, between 30-35% sucrose, coincident with the total PNPPase, ATPase, and (Na+,K+)-ATPase activities. The residual activity observed in the presence of 3 mM ouabain suggests the existence of other enzyme systems. Electrophoresis under denaturing conditions, using material from fresh-caught crabs (33 o/oo salinity, not acclimated), and from crabs acclimated to 15 or 33 o/oo salinity, for 10 days, revealed differences in migration pattern. Western blot analyses showed a significant increase in the amount of (Na+,K+)-ATPase alpha-subunit relative to total protein, for crabs acclimated to 15 o/oo compared to those acclimated to 33 o/oo salinity. However, the proportion of alpha-subunit in samples from fresh-caught crabs acclimated to 33 o/oo and those acclimated to 15 o/oo salinity was similar. (Na+,K+)-ATPase activity was stimulated by ATP and showed a single saturation curve, exhibiting site-site interactions (nH=1.2), with V= 298.8 ± 16.7 U/mg, and K0.5= 174.2 ± 9.8 uM. Stimulation of the ATPase activity by Mg2+ (V= 299.16 ± 14.06 U/mg; K0.5= 767.31 ± 36.06 uM), Na+ (V= 309.0 ± 15.8 U/mg; K0.5= 7.8 ± 0.4 mM), K+ (V= 300.6 ± 15.3 U/mg; K0.5= 1.63 ± 0.08 mM) and NH4+ ions (V= 345.1 ± 19.0 U/mg; K0.5= 6.0 ± 0.3 mM) occurred through site-site interactions. (Na+,K+)-ATPase activity was synergistically modulated by K+ ions, maximum activity varying from 300.6 ± 15.3 U/mg to 514.6 ± 26.2 U/mg, in the absence and presence of 50 mM NH4+ ions, respectively. K+ ions induced a 10-fold increase in enzyme apparent affinity (from 1.6 ± 0.08 mM to 0.157 ± 0.008 mM). As for K+ ions, NH4+ synergistically stimulated enzyme activity in the presence of variable K+ concentrations. The stimulation by NH4+ ions exhibited cooperative, site-site interactions. Although an increase in specific activity from 345.1 ± 19.0 U/mg to 516.8 ± 27.9 U/mg was seen, no significant changes in nH and K0.5 were observed. Ouabain inhibited total ATPase activity by about 90%, showing a KI= 45.09 ± 2.51 uM. Orthovanadate also inhibited the (Na+,K+)-ATPase with a KI of 1.31 ± 0.06 uM. Although the inhibitory effect of oligomycin was minimal (3.7%), this inhibition may suggest F0F1-ATPase activity. The inhibition by ethacrynic acid, in association with Na+ ion stimulation of the ATPase activity, suggests the presence of a K+-ATPase. The (Na+,K+)-ATPase hydrolyzed PNPP (K+-phosphatase activity) obeying Michaelian kinetics, with V= 102.9 ± 4.3 U/mg and KM= 1.7 ± 0.1 mM. The stimulation of K+-phosphatase activity by Mg2+ (V= 93.7 ± 2.3 U/mg; K0.5= 1.4 ± 0.03 mM), K+ (V= 94.9 ± 3.5 U/mg; K0.5= 2.9 ± 0.1 mM), and NH4+ ions (V= 106.2 ± 2.2 U/mg; K0.5= 9.8 ± 0.2 mM) following cooperative kinetics, suggests multiple binding sites. K+-phosphatase activity, however, was not synergistically stimulated by K+ and NH4+. Sodium ions (KI= 22.7 ± 1.7 mM), and orthovanadate (KI= 28.1 ± 1.4 nM) totally inhibited the total phosphatase activity.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Growing evidence has shown that leukotrienes are important contributors in the pathophysiology of several SNC inflammatory diseases where excitotoxicity is involved, including traumatic brain injury, encephalitis, Parkinson's disease, ischemia, epilepsy and neuropathic pain. However little is known about the molecular mechanism by which leukotrienes facilitate excitatory activity in the brain. Thus, in this study we investigated the effect of antagonists for cysteinyl leukotrienes receptors (CysLT) on PTZ-induced seizure in mice. Bay-u9973 (3 and 30 nmol), montelukast (0.03 and 0.3 μmol) and pranlukast (1 and 3 μmol), increased the latency to generalized seizures and decreased the mean amplitude of EEG recordings during seizures. LTD4 (0.2 and 2 pmol) reverted the anticonvulsant effect of montelukast (0.3 μmol). Montelukast (0.03 and 0.3 μmol) prevented PTZ-induced BBB disruption, an effect that was reversed by LTD4 (6 pmol). In addition, doses of LTD4 (0.2 and 2 pmol) which reversed the effect of montelukast in crisis did not alter the protective effect of montelukast on the barrier, dissociating the anticonvulsant of protective effect on BBB. The confocal microscopy analysis revealed that 1. PTZ increased the number of CD45+ and IgG cells in cerebral cortex, indicating BBB leakage with leukocyte infiltration; 2. while LTD4 (6 pmol) potentiated, montelukast decreased the effect of PTZ on leukocyte migration. Considering that increase levels of leukotrienes and decrease in Na+,K+-ATPase are common findings in several excitotoxic conditions, including epileptic seizures, we also investigated the effects of LTD4 on the activity of Na+,K+-ATPase activity in mice hippocampal slices. LTD4 10 and 100 nM decreases Na+,K+-ATPase activity alpha 2, 3 and alpha 1 subunits, respectively, in mice hippocampal slices. The inhibitory effect of LTD4 on Na+,K+-ATPase activity was not observed in hippocampal homogenates, indicating that it requires intact cells. Moreover, we showed that LTD4-induced decrease Na+,K+-ATPase activity was reversed by CysLT1R inverse agonis, montelukast (1 μM). In addition, we also showed that possibly the PKC activation pathway is involved in LTD4-induced decrease of Na+,K+-ATPase activity in mice hippocampal slices, since PKC inhibitor, GF 109203X (0,3 μM), prevent this effect. Finally, but not least important, we have demonstrated that animals injected with LTD4 (2 pmol/3 μL icv), there also occurs a decrease in Na+,K+-ATPase activity, corroborating our in vitro findings and confirming the biological importance of this work. In summary, we showed that CysLT1 receptor activation modulates hippocampal Na+,K+-ATPase activity in mice, suggesting a possible mechanism for the involvement of leukotrienes in several dosorders related with brain inflammation and hyperexcitability. / Evidências crescentes têm mostrado que os leucotrienos são importantes contribuintes na patofisiologia de diversas doenças inflamatórias do sistema nervoso central nas quais a excitotoxicidade esteja envolvida, incluindo trauma crânio-encefálico, encefalite, doença de Parkinson, isquemia, dor neuropática e epilepsia. Entretanto pouco se sabe sobre o mecanismo molecular pelo qual os leucotrienos facilitam a atividade excitatória no encéfalo. Assim, neste trabalho investigamos o efeito de antagonistas para receptores de leucotrienos cisteínicos (CysLT) sobre as convulsões induzidas por PTZ em camundongos. Bay-u9973 (3 and 30 nmol), montelucaste (0.03 and 0.3 μmol) e pranlucaste (1 and 3 μmol), aumentaram a latência para as crises e diminuíram a amplitude média do EEG durante as crises. Montelucaste (0.03 and 0.3 μmol) preveniu a ruptura da BHE induzida pelo PTZ, e o efeito foi revertido pelo LTD4 (6 pmol). Além disso, as doses de LTD4 (0.2 and 2 pmol) que reverteram o efeito do montelucaste nas crises não alteraram o efeito protetor do montelucaste sobre a barreira, dissociando o efeito anticonvulsivante do efeito protetor sobre a BHE. As análises de microscopia confocal revelaram: 1) PTZ aumentou o número de células CD45+ e IgG no córtex, evidenciando a ruptura da BHE; 2) enquanto o LTD4 (6 pmol) potencializou, o montelucaste diminuiu o efeito do PTZ sobre a migração leucocitária. Considerando que níveis aumentados de leucotrienos e diminuição na atividade da Na+,K+-ATPase são achados comuns em diversas condições excitotóxicas, incluindo crises epilépticas, também investigamos o efeito do LTD4 sobre a atividade da Na+,K+- ATPase em fatias de hipocampo de camundongos. LTD4 nas doses de 10 e 100 nM, diminuiu a atividade das subunidades alfa 2/3 e alfa 1, respectivamente. O efeito inibitório do LTD4 na atividade da Na+,K+-ATPase não foi reproduzido quando realizado com homogeneizado de hipocampo, indicando que esse efeito requer a célula intacta. A fim de nos certificarmos de que o LTD4 (10 nM) estava se ligando ao receptor CysLT1, incubamos as fatias com anticorpo anti- CysLT1, e verificamos que, na presença do anticorpo, o LTD4 perde o efeito. Além disso, observamos que a diminuição na atividade da Na+,K+-ATPase induzida pelo LTD4 foi revertida pelo montelucaste (1 μM), agonista inverso dos receptores CysLT1. Neste trabalho mostramos ainda que a ativação da PKC possivelmente esteja envolvida no efeito do LTD4 sobre a atividade da Na+,K+-ATPase em fatias de hipocampo de camundongos, uma vez que o GF 109203X (0,3 μM), inibidor da PKC, preveniu esse efeito. Por fim, mas não menos importante, também demonstramos que em animais injetados i.c.v. com LTD4 (2 pmol/3 μL, i.c.v.), também ocorre uma diminuição na atividade da Na+,K+-ATPase, corroborando com nossos achados in vitro e confirmando a importância biológica deste trabalho. Assim, este trabalho mostrou evidências do envolvimento dos receptores CysLT1 nas crises induzidas por PTZ bem como na permeabilidade da BHE, sendo a modulação da enzima Na+,K+-ATPase um possível mecanismo para a implicação dos leucotrienos em diversas doenças do SNC relacionadas com inflamação e hiperexcitabilidade.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The pathogenesis of Trypanosoma evansi (T. evansi) infection on central and peripheral nervous system (CNS) and immunologic system it is not completely understood. This study was conducted to investigate the effects of infection by T. evansi on the behavioral performance of rats, relating them to neurochemical alterations of the glutamatergic system and activity of important enzymes such as Ca2 + ATPase, Na + / K + ATPase and acetylcholinesterase (AChE) in the brain. Furthermore, we evaluated the activity of AChE in the T. evansi, using a biochemical protocol and discussed some possibilities for the interaction between the presence of this enzyme in the parasite and its possible relation with the host. Also, we investigated the in vivo effect of curcumin as an antitrypanosomal agent to contribute in the search for new therapies. To this end, we conducted a series of studies, as follow that are presented as scientific articles: in the Article I are presented data from rats experimentally infected with T. evansi and in which the activity of AChE in total brain, cerebellum and blood and plasma butyrylcholinesterase activity on days 3 (T3) and 5 (T5) post infection (pi) were evaluated. In the Article II trypanosomes were isolated by Dietil Amino Etil-celulose column to perform enzymatic assays of AChE activity in the parasite. Article III presents the results of daily oral administration of Curcumin (20 or 60 mg / kg) as a preventive treatment (for 30 or 15 days pre-infection) or as curative treatment (for 15 days pi) for T. evansi infection in rats. The animals were evaluated for parasitemia, proinflammatory cytokines (IFN-γ, TNF-α, IL-1, IL-6) and anti-inflammatory (IL-10) in plasma. Also blood AChE activity was studied. In the manuscript I were evaluated behavioral changes (memory and anxiety), glutamate uptake, activity of AChE and ATPases (Ca +2 and Na +, K +) in brain structures of T. evansi infected rats (5 and 30 dpi). Together these studies suggest that rats infected with T. evansi have cognitive impairment, probably caused by changes on energy metabolism (ATPases) and in the cholinergic and glutamatergic systems. That way, alterations observed during behavioral tests probably indicate the progression of clinical disease as a result of neurochemical dysfunction. It was also demonstrated that it is possible to biochemically detect the AChE activity in the T. evansi and this could cause the hydrolysis of acetylcholine in the parasite. It was also demonstrated that pretreatment with curcumin induces immunomodulatory effects, altering inflammatory cytokines and activity of AChE in rats infected with T. evansi. The treatments reduced parasitic load and mortality. Therefore, curcumin should be considered as a feeding supplement in trypanosomiasis endemic areas. / Com este trabalho, buscou-se compreender os mecanismos da patogenia do Trypanosoma evansi no sistema nervoso central (SNC), periférico e imunológico. Para isso, foram avaliados os efeitos da infecção por T. evansi sobre o desempenho comportamental de ratos, relacionando-os com alterações neuroquímicas do sistema glutamatérgico e com as atividades de importantes enzimas cerebrais como a Ca+2ATPase, a Na+/K+ATPase e a acetilcolinesterase (AChE). Avaliou-se também, a atividade da AChE no T. evansi usando um protocolo de bioquímica, buscando discutir algumas possibilidades de interação entre a presença desta enzima no parasita e suas possíveis relações com o hospedeiro. Também, foi investigado o efeito in vivo da curcumina como agente tripanocida, a fim de contribuir na busca de novas terapias. Com estes propósitos, foram realizadas varios estudos, sendo: no artigo I buscou-se avaliar se a infecção pelo protozoário altera o sistema colinérgico. Para isso, foram utilizados ratos experimentalmente infectados com T. evansi e avaliada a atividade da AChE no cérebro total, no cerebelo e no sangue e a atividade da butirilcolinesterase plasmática nos dias 3 e 5 pós infecção (pi); no artigo II tripanossomas foram isolados por coluna de dietilaminoetilcelulose para realizar ensaios enzimáticos da atividade da AChE no parasito; no artigo III doses diárias de Curcumina (20 ou 60 mg / kg) diluída em óleo de milho foram administradas diariamente por via oral (gavagem) como tratamento preventivo (30 ou 15 dias pré-infecção) e como tratamento durante quinze dias pi. Os animais foram avaliados quanto a parasitemia, as citocinas pró-inflamatórias (IFN-γ, TNF-α, IL-1, IL-6) e anti-inflamatória (IL-10) plasmáticas e a atividade sanguínea da AChE; no manuscrito I foram avaliadas as alterações comportamentais (memória e ansiedade), a captação de glutamato, atividade da AChE e das ATPases (Ca +2 e Na +, K +) nas estruturas encefálicas nos dias 5 e 30 de ratos infectados com T. evansi. Com estes estudos, pode-se concluir que ratos infectados com T. evansi apresentam déficit cognitivo, provavelmente causados por alterações nos parâmetros do metabolismo energético (ATPases) e nos sistemas colinérgico e glutamatérgico, sugerindo que as alterações observadas durante testes comportamentais provavelmente indicam uma disfunção neuroquímica. Também foi demonstrado que é possível detectar bioquimicamente a atividade da AChE no T. evansi e esta deve ser responsável pela hidrólise da acetilcolina no parasita. Quando os animais infectados foram tratados com curcumina demonstrou-se que o pré-tratamento com este composto induz efeitos imunomodulatórios, alterando os parâmetros inflamatórios tais como as citocinas e a atividade da AChE sanguínea. Desta forma, sugere-se que a curcumina pode ser utilizada como um suplemento alimentar em áreas endêmicas de tripanossomíase, uma vez que reduziu a carga parasitária e a mortalidade em ratos infectados com T. evansi, contribuindo assim com novas alternativas de tratamento.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Glutaric aciduria type I (GA-I) is an inborn error of metabolism (EIM) characterized biochemically by accumulation of glutaric acid (GA). The clinical manifestations are mainly neurological and develop during childhood. Among these changes, there are the seizures and cognitive deficits, which may be precipitated by infectious processes. Although growing evidence supports that inflammation and oxidative damage are both involved in learning impairment, it is not known whether inflammatory and oxidative stress markers facilitate GA-induced memory impairment. From this, the main objective of this study was to investigate the performance of rat pups chronically injected with GA and lipopolysaccharide (LPS) in spatial memory test on Barnes maze. To evaluate antioxidant defenses, cytokines levels, Na+, K+-ATPase activity, and hippocampal volume. Furthermore, we also evaluated wheter N-acetylcysteine (NAC) could improve these behavioral, biochemical or structural changes induced by GA and LPS administration. For this, the rat pups were injected with GA (5umol g of body weight-1, subcutaneously; twice per day; from 5th to 28th day of life), and were supplemented with NAC (150 mg/kg/day; intragastric gavage; for the same period). In order to mimic a severe infection state, LPS (2 mg/kg; E.coli 055 B5) or vehicle (saline 0.9%) was injected intraperitoneally, once per day, from 25th to 28th day of life.Oxidative stress biomarkers, antioxidant activity and hippocampal volume were assessed. In this study, GA caused spatial learning deficit in the Barnes maze, and that LPS potentiated the memory impairment induced by GA in rat pups. In addition, GA and LPS increased proinflammatory cytokine levels (TNF- and IL-1), and the co-administration of these compounds potentiated the increase of IL-1 levels but not TNF- levels in the hippocampus of this animals. Although GA and LPS administration increased TBARS (thiobarbituric acid-reactive substance) content, reduced antioxidant defenses and inhibited Na+,K+-ATPase activity (total and subunit α1), GA and LPS co-administration did not have additive effect on oxidative stress markers and Na+, K+ pump. The hippocampal volume did not change after GA or LPS administration. N-acetylcysteine protected against impairment of spatial learning and increase of cytokines levels induced by GA and LPS. The NAC also protected against deleterious effects induced by GA and LPS, as characterized by inhibition of Na+,K+-ATPase activity (total and subunit α1)and increase of TBARS content, as well as the reduction of antioxidant defenses(non protein thiols and glutathione content, superoxide dismutase and catalase activities).These results suggest that inflammatory and oxidative markers may underlie at least in part of the neuropathology of GA-I in this model. Pharmacological protection with NAC during encephalopatic crises could be considered as an adjuvant therapy to prevent hippocampal dysfunction and the progression of disease in children with GA-I. / A acidemia glutrárica do tipo I (AG-I) é um erro inato do metabolismo (EIM) caracterizada bioquimicamente pelo pelo acúmulo de ácido glutárico (AG). As manifestações clínicas são predominantemente neurológicas, e desenvolvem-se principalmente na infância. Entre essas alterações, as quais são precipitadas por processos infecciosos, pode-se citar o déficit cognitivo. Embora estudos recentes sugerem que a inflamação e o estresse oxidativo estão envolvidos no déficit cognitivo, não se sabe se os marcadores inflamatórios e oxidativos facilitam o prejuízo de memória após a administração de AG. A partir disso, o objetivo desta dissertação foi investigar o desempenho de ratos jovens injetados cronicamente com AG e lipopolissacarídeo (LPS) no teste de memória espacial no labirinto de Barnes. Além disso, foi avaliado os níveis das defesas antioxidantes, níveis de citocinas, atividade da enzima Na+, K+-ATPase e volume hipocampal. Como a N-acetilcisteína (NAC) possui propriedades antioxidantes e antiinflamatórias, foi testado se esse composto poderia melhorar as alterações comportamentais, bioquímicas e estruturais induzidas pela administração de AG e LPS. Para isso, os ratos jovens foram injetados com AG (5 μmol/g do peso corporal-1; subcutaneamente; duas vezes por dia; do 5º ao 28º dia de vida), e foram suplementados com NAC (150 mg/kg/dia; por gavagem; pelo mesmo período). A fim de mimetizar um estado infeccioso, LPS (2 mg/Kg: E. coli 055 B5) ou veículo (salina 0.9%) foi injetado intraperitonealmente uma vez por dia, do 25º ao 28º dia de vida. Nesse estudo, AG causou déficit de aprenizagem espacial no labirinto de Barnes, e o LPS potencializou esse prejuízo de memória induzido pelo AG nos ratos jovens. Em adição, a administração de AG e LPS aumentou os níveis de citocinas pró-inflamatórias (TNF- and IL-1), e a associação desses compostos potencializou o aumento dos níveis de IL-1, mas não de TNF-α no hipocampo dos animais. Embora a associação de AG e LPS tenha causado o aumento o conteúdo TBARS (espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico), a redução das defesas antioxidantes e inibição da atividade da Na+,K+-ATPase (total e subunidade α1), a associação de AG e LPS não teve efeito aditivo nos marcadores de estresse oxidativo e na atividade da bomba de Na+ e K+. O volume hipocampal não foi alterado após a administração do AG e LPS. A N-acetilcisteína protegeu contra o prejuízo de aprendizagem espacial e aumento de citocinas inflamatórias induzido pelo AG e LPS. A NAC também protegeu contra os efeitos deletérios induzidos pelo AG e LPS, caracterizado pela inibição da atividade da Na+,K+-ATPase (total e subunidade α1) e aumento do conteúdo de TBARS, bem como a redução das defesas antioxidantes (tiós não-proteicos, conteúdo de glutationa, avitidade da superóxido dismutase e catalase). Esses resultados sugerem que marcadores inflamatórios e oxidativos podem estar envolvidos, em parte, na neuropatologia da AG-I neste modelo. Dessa forma, a proteção farmacológica com a NAC durante crises encefalopáticas pode ser considerada como uma terapia adjuvante para prevenir a disfunção hipocampal e a progressão da doença em crianças com AG-I.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The aim of this study was to evaluate the effect of the essential oil of Lippia alba (EOLA) as a feed additive on ionoregulatory and metabolic parameters, and pituitary hormones expression in silver catfish, Rhamdia quelen. Fish were fed for 20 days with different concentrations of EOLA (0.0 control, 0.25 and 0.50 mL kg-1 food). Plasma Na+, Cl- , K+ and cortisol, and metabolic parameters were not affected by the diet, with the exception of ALT (alanine aminotransferase), which was higher in the liver of fish fed 0.50 mL EOLA kg-1 food. Fish fed 0.25 mL EOLA kg-1 food presented higher Na+/K+-ATPase activity and somatolactin expression, but H+-ATPase activity and growth hormone and prolactin expression did not change. The EOLA can be used as a dietary supplement for silver catfish at the evaluated concentrations, but using 0.25 mL EOLA kg-1 food seems to be more suitable than 0.50 mL EOLA kg-1 food since the latter may be related to liver damage. / O objetivo deste estudo foi analisar o efeito do óleo essencial de Lippia alba (EOLA) adicionado à ração de Rhamdia quelen (jundiá) em parâmetros metabólicos, osmorregulatórios e endócrinos. Os peixes foram alimentados por 20 dias com diferentes concentrações de OELA (0,00; 0,25 e 0,50 mL kg-1 ração). Os peixes foram alimentados durante 20 dias com diferentes concentrações de OELA (0,0 - controle, 0,25 e 0,50 mL kg-1 de ração). Parâmetros metabólicos, Na+, Cl-, K+ e cortisol no plasmas não foram afetados pela dieta, com a exceção de ALT (alanina aminotransferase), que foi maior no fígado dos peixes alimentados com 0,50 mL OELA kg -1 de ração. Os peixes alimentados com 0,25 mL EOLA kg-1 de ração, apresentaram maior atividade de Na+/K+-ATPase e da expressão da somatolactina, mas a atividade de H+-ATPase e da expressão do hormônio do crescimento e da prolactina não alterou-se. O OELA pode ser utilizado como um suplemento dietético para o jundiá nas concentrações testadas, mas 0,25 mL EOLA kg -1 de ração, parece ser melhor do que a concentração de 0,50 mL kg-1, uma vez que esta última pode estar relacionada com danos no fígado.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Epilepsy is a syndrome characterized by spontaneous recurrent seizures, result of paroxys-mal discharges , excessive or synchronous a neural population . Despite the good prognosis, the high number of patients with epilepsy who have seizures refractory to medication, reflects the lack of a bet-ter understanding of excitotoxic disorders characteristic of this disease. Thus, it becomes important to understand the mechanisms for induction and maintenance of seizures as well, the search for new antiepileptic compounds that may prevent the development of this pathology. As nociception and epi-lepsy have mechanisms in common and several anticonvulsant drugs are used in treatment of pain , we investigated the effect of triterpene 3β , 6β , 16β Trihidroxilup -20 ( 29) -ene (TTHL), a compound with antinociceptive properties in convulsions induced by pentylenetetrazol (PTZ). The TTHL admin-istration ( 30 mg / kg , po) increased the latency to the first myoclonic seizures and tonic- clonic sei-zure and decreased the duration of generalized seizures induced by PTZ . In addition , the administra-tion of TTHL reduced lipid peroxidation and protein carbonylation , as well as protected from inhibition of glutamate uptake and activity of the Na+, K+-ATPase (α1and α2/α3 subunits ) caused by PTZ . Alt-hough the TTHL showed no antioxidant activity per se and not alter the binding of [ 3H ] flunitrazepam to the site of the GABAA receptor bezodiazepínico , this protected compound of convulsions and inhi-bition of Na+, K+-ATPase activity induced by ouabain . These results suggest that the anticonvulsant action is due TTHL s maintenance of Na+, K+-ATPase . In fact , the experiments performed in the cer-ebral cortex in vitro showed that PTZ ( 10 mM ) reduced the activity of Na+, K+-ATPase and that prein-cubation with TTHL ( 10 mM ) protected from this inhibition.Thus , these data indicate that the protec-tion exerted by TTHL this seizure model is not related to antioxidant activity or GABAergic activity . However, these results demonstrate that effective protection of Na+, K+-ATPase activity induced by this compound protects against oxidative and excitotoxic damage induced by PTZ . / A epilepsia é uma síndrome caracterizada por crises espontâneas e recorrentes, resultado de descargas paroxísticas, excessivas e sincrônicas de uma população neural. Apesar do bom prognós-tico, o elevado número de pacientes com epilepsia, que apresentam convulsões refratárias aos medi-camentos, reflete a falta de um melhor entendimento dos distúrbios excitotóxicos característico desta doença. Desta forma, torna-se importante o entendimento dos mecanismos de indução e manuten-ção das convulsões, bem como, a busca por novos compostos anticonvulsivantes que possam evitar o desenvolvimento desta patologia. Como a nocicepção e a epilepsia possuem mecanismos em co-mum, e vários anticonvulsivantes são usados no tratamento da dor, foi investigado o efeito do Triter-peno 3β,6β,16β Trihidroxilup-20(29)-eno (TTHL), um composto com propriedades antinociceptivas, nas convulsões induzidas pelo pentilenotetrazol (PTZ). A administração do TTHL (30 mg/kg; p.o) au-mentou a latência para a primeira convulsão mioclônica e tônico-clônica e reduziu a duração das convulsões generalizadas induzidas pelo PTZ. Além disso, a administração do TTHL reduziu a pero-xidação lipídica e a carbonilação de proteínas, assim como, protegeu da inibição da captação de glu-tamato e da atividade da Na+,K+-ATPase (subunidades α1 e α2/α3) causadas pelo PTZ. Embora, o TTHL não mostrou uma atividade antioxidante per se e não alterou a ligação do [3H]flunitrazepam ao sítio para bezodiazepínico do receptor GABAA, este composto protegeu das convulsões e da inibição da atividade da Na+, K+- ATPase induzidos pela ouabaina. Estes resultados sugerem que a ação an-ticonvulsivante do TTHL é devido s manutenção da atividade da Na+,K+-ATPase. De fato, os experi-mentos realizados no córtex cerebral in vitro mostraram que o PTZ (10 mM) reduziu a atividade da Na+,K+-ATPase e que a incubação prévia com TTHL (10 μM) protegeu desta inibição. Dessa forma, estes dados indicam que a proteção exercida pela TTHL neste modelo de convulsão não está relaci-onado com atividade antioxidante ou a atividade GABAérgica. No entanto, estes resultados demons-traram que a proteção eficaz da atividade da Na+,K+-ATPase , induzida por este composto, protege contra os danos excitotóxic e oxidativos induzidos pelo PTZ.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The contamination of the aquatic environment occurs as a consequence of industrial, agricultural and anthropogenic activities. Aquatic ecosystems are often contaminated with metals such as copper and zinc, which are essential in low concentrations but toxic at high concentrations. Thus, the aim of this study was to establish the mean lethal concentration (LC50) within 96 hours of zinc for silver catfish (Rhamdia quelen) and to evaluate the possible effects on biochemical parameters of fish exposed to 0.0 (control), 1.0 and 5.0 mg/L zinc for 96h. The parameters analyzed were reactive substances to thiobarbituric acid (TBARS), protein carbonyl, acetylcholinesterase (AChE), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione S-transferase (GST), non-protein thiols (NPSH) and Na+/K+-ATPase. The LC50 value found was 8.07 mg/L. The results of sublethal exposure showed that TBARS levels decreased in liver and brain at every tested Zn concentration. In gills, there was an increase on TBARS levels at 1.0 mg/L and a decrease at 5.0 mg/L, while no changes in muscle were observed. Exposure to zinc decreased protein carbonyls in liver of silver catfish exposed to 5.0 mg/L and gills in every tested concentration. In brain there were no changes in protein carbonyl and in muscle there was an increase at both concentrations. In liver, the SOD activity increased at both zinc concentrations. CAT activity in liver did not change at any concentration. The GST activity decreased in liver and brain increased at both concentrations used. In gills, GST increased in fish exposed to 1.0 mg/L and in muscle at 5.0 mg/L. NPSH levels showed no changes in liver either in gills. In brain there was an increase on NPSH levels at 5.0 mg/L, while the muscle declined at both concentrations. The AChE activity in brain decreased at both zinc concentrations, whereas there was no change in muscle activity for this enzyme. The Na+/K+-ATPase activity was inhibited in gill and intestine in every used concentration. We may conclude that zinc altered biochemical parameters of silver catfish and also the inhibition of brain AChE and Na+/K+-ATPase activity in intestine and gills may be used as biomarkers of waters contaminated by zinc. / A contaminação do ambiente aquático ocorre como consequência das atividades industriais, agrícolas e antropogênicas. Ecossistemas aquáticos são frequentemente contaminados com metais como cobre e zinco, que são essenciais em baixas concentrações, mas tóxicos em concentrações elevadas. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi estabelecer a concentração letal média (CL50) em 96 horas do zinco para jundiá (Rhamdia quelen) e avaliar os possíveis efeitos sobre parâmetros bioquímicos destes peixes expostos a 0,0 (controle), 1,0 e 5,0 mg/L de zinco por 96h. Os parâmetros analisados foram substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), proteína carbonil, acetilcolinesterase (AChE), superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa S-transferase (GST), tióis não-proteicos (NPSH) e Na+/K+-ATPase. O valor da CL50 encontrado foi de 8,07 mg/L. Os resultados da exposição subletal mostraram que os níveis de TBARS diminuíram no fígado e no cérebro em todas concentrações de Zn testadas. Nas brânquias, houve um aumento dos níveis de TBARS na concentração de 1,0 mg/L e uma diminuição na 5,0 mg/L, enquanto que no músculo não foram observadas alterações. A exposição ao zinco diminuiu a carbonilação de proteínas no fígado de jundiás expostos a 5,0 mg/L e nas brânquias nas duas concentrações testadas. No cérebro não houve alterações na proteína carbonil e no músculo, houve um aumento nas duas concentrações. No fígado, a atividade da SOD aumentou em ambas as concentrações de zinco testadas. A atividade da CAT no fígado não teve alteração em nenhuma das concentrações. A atividade da GST diminuiu no fígado e aumentou no cérebro para ambas as concentrações utilizadas. Nas brânquias, o aumento da GST ocorreu na concentração de 1,0 mg/L e no músculo dos peixes expostos a 5,0 mg/L. Os níveis de NPSH não mostraram alterações no fígado e nem nas brânquias. No cérebro houve um aumento nos níveis de NPSH na concentração de 5,0 mg/L, enquanto que no músculo diminuiu nas duas concentrações. A atividade da AChE em cérebro diminuiu nas duas concentrações de zinco, enquanto que no músculo não houve alteração na atividade desta enzima. A atividade da Na+/K+-ATPase foi inibida em brânquias e intestino em todas as concentrações usadas. Com estes resultados, podemos concluir que o zinco alterou os parâmetros bioquímicos dos jundiás e que a inibição da AChE cerebral e da Na+/K+-ATPase no intestino e brânquias podem ser utilizadas como biomarcadores de águas contaminadas por zinco.

Ouabain and other cardiotonic steroids are known to inhibit Na + ,K + -ATPase (NKA), theion pump responsible for the ionic gradient across the plasma membrane. These steroidsdisplay a selective toxicity towards several tumour cells in comparison to primary humancells, however, the mechanism behind this is not yet understood. Here, we examined theouabain toxicity in renal epithelial cells, proximal tubular cells (PTCs) of different origin. Weinvestigated the relative cytotoxicity in cancer cells (A-498) and papilloma virus-transformedPTCs (HK-2) as well as to primary human PTCs (hPTC) to validate key components in theeffect. In exposure to ouabain, we examined the cell viability and density by MTT and CrystalViolet assays, and cell migration by a scratch assay. The cytotoxic effect was also studied invarious pH, glucose and potassium ion concentrations. In addition, apoptosis was examinedby the TUNEL assay, and if ouabain kills cancer cells through activation of thevolume-regulated anion channel VRAC channel via NKA. We found that there is a decrease in viable cells when cells are exposed to ouabain ≥ 10nM, however, the effect was not seen to be selective towards cancer cells, nor due toapoptosis and the activation of VRAC. The cytotoxic effect was greater in more acidicextracellular pH ~6.8, but independent of glucose concentration in the medium. Interestingly,the effect was also reversed at an increased extracellular concentration of potassium, andouabain did selectively inhibit the cancer cells to migrate. Thus, there could be potential forouabain to act as an anti-cancer agent for renal cancer and to inhibit tumour metastasization. / Ouabain och andra kardiotoniska steroider är kända för att inhibera Na + ,K + -ATPas (NKA),membranpumpen som är ansvarig för den aktiva jontransporten av natrium och kalium ochjongradienten över plasmamembranet. De har påvisat en selektiv toxicitet mot vissatumörceller i jämförelse med primära humana celler, men det är dock inte förstått hurmekanismen bakom denna företeelse fungerar. I denna studien undersökte vi ouabainstoxicitet i njurcancerceller (A-498) och papillomavirustransformerade proximala tubuliceller(hPTC) för att identifiera effektens nyckelkomponenter. Vid exponering av ouabain undersökte vi cellviabiliteten och -densiteten genom MTT- ochkristallviolett-analyser, samt cellmigrering genom scratch-analys. Den cytotoxiska effektenstuderades också under olika pH-förhållanden samt glukos- och kaliumkoncentrationer.Dessutom undersöktes det om apoptos orsakar celldöd genom TUNEL-analys, och omouabain dödar njurcancerceller genom aktivering av den volymreglerade anjonkanalen(VRAC) via NKA. Vi fann minskning av cellernas livskraft vid exponering av ≥ 10 nM ouabain, men effektentycktes dock inte se ut att vara selektiv gentemot cancerceller, inte heller på grund av apoptosoch aktivering av VRAC. Den cytotoxiska effekten var större vid lägre pH, men oberoendeav mediets glukoskoncentrationen. Intressant nog motverkades också effekten vid förhöjdkoncentration av kaliumjoner, och ouabain hämmade selektivt cancercellerna att migrera.Således finns det en viss potential för ouabain att kunna fungera som ett anticancermedel motnjurcancer och att hämma metastasutveckling.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.