Este estudo teve como objetivo analisar a qualidade dos sedimentos do complexo estuarino de Cananéia-Iguape-Peruíbe (CIP), utilizando Biomarcadores, análises químicas e ecotoxicológicas, a fim de determinar se os metais nos sedimentos estariam biodisponíveis para os organismos bentônicos. As estações PT e PM apresentaram as piores condições, com toxicidade crônica (PT e PM) e aguda (PT), concentração de metais no sedimento e maior indução dos biomarcadores. As piores condições tendem a estar associadas aos sedimentos finos. Os elementos Pb, V, Co, Ni e ZN ultrapassaram os limites de \"Sediment Quality Guidelines\" (SQVs) nas estações PT e PM, Pb ultrapassou também os limites de TEL. A indução dos biomarcadores analisados e danos nos tecidos apresentaram maiores valores durante o inverno. As diferentes ferramentas utilizadas mostram que a contaminação por metais, advindas das atividades de mineração do Alto do Rio Ribeira de Iguape estão influenciando o estuário. A toxicidade encontrada foi atribuída principalmente aos metais, sugerindo que os fatores antrópicos produzem riscos ecológicos. Além disso, como a toxicidade durante o verão se apresenta mais na parte superior do estuário e no inverno essa mesma toxicidade se apresenta nas estações mais ao sul, esse estudo evidenciou que as áreas de deposição parecem mover-se ao longo do estuário, o que depende da quantidade da entrada de água doce no sistema, que se apresenta associada a sazonalidade. / This study aimed to analyze the sediment quality of the Cananéia-Iguape-Peruíbe estuarine complex (CIP) by using biomarkers, geochemical and ecotoxicological analyses, in order to determine if metals from sediments were bioavailable to benthic organisms to the point of causing negative effects. Stations PT and PM presented the worst conditions, with chronic (PT and PM) and acute toxicity (PT), metal contamination and biomarkers induction. Worst condition tend to be associated to fines. Elements Pb, V, Co, Ni and Zn exceeded Sediment Quality Guidelines (SQVs) limits for stations PT and PM, Pb exceeding also TEL values. Biomarkers induction and tissue damage appears to be worse during winter. The different lines of evidence showed that the metal contamination from mining activities on upper Ribeira de Iguape River alters the estuary. Toxicities were attributed mainly to metals suggesting that the anthropic factors are capable of producing ecological risks. Additionally, such as summer toxicity are present in the northern estuarine portion and during winter, this same toxicity appears to be in the southern portion, this study evidenced that depositional areas appears to move along the estuary, which in its turn depends on the freshwater inputs associate to seasonality.

Este estudo teve como objetivo analisar a qualidade dos sedimentos do complexo estuarino de Cananéia-Iguape-Peruíbe (CIP), utilizando Biomarcadores, análises químicas e ecotoxicológicas, a fim de determinar se os metais nos sedimentos estariam biodisponíveis para os organismos bentônicos. As estações PT e PM apresentaram as piores condições, com toxicidade crônica (PT e PM) e aguda (PT), concentração de metais no sedimento e maior indução dos biomarcadores. As piores condições tendem a estar associadas aos sedimentos finos. Os elementos Pb, V, Co, Ni e ZN ultrapassaram os limites de \"Sediment Quality Guidelines\" (SQVs) nas estações PT e PM, Pb ultrapassou também os limites de TEL. A indução dos biomarcadores analisados e danos nos tecidos apresentaram maiores valores durante o inverno. As diferentes ferramentas utilizadas mostram que a contaminação por metais, advindas das atividades de mineração do Alto do Rio Ribeira de Iguape estão influenciando o estuário. A toxicidade encontrada foi atribuída principalmente aos metais, sugerindo que os fatores antrópicos produzem riscos ecológicos. Além disso, como a toxicidade durante o verão se apresenta mais na parte superior do estuário e no inverno essa mesma toxicidade se apresenta nas estações mais ao sul, esse estudo evidenciou que as áreas de deposição parecem mover-se ao longo do estuário, o que depende da quantidade da entrada de água doce no sistema, que se apresenta associada a sazonalidade. / This study aimed to analyze the sediment quality of the Cananéia-Iguape-Peruíbe estuarine complex (CIP) by using biomarkers, geochemical and ecotoxicological analyses, in order to determine if metals from sediments were bioavailable to benthic organisms to the point of causing negative effects. Stations PT and PM presented the worst conditions, with chronic (PT and PM) and acute toxicity (PT), metal contamination and biomarkers induction. Worst condition tend to be associated to fines. Elements Pb, V, Co, Ni and Zn exceeded Sediment Quality Guidelines (SQVs) limits for stations PT and PM, Pb exceeding also TEL values. Biomarkers induction and tissue damage appears to be worse during winter. The different lines of evidence showed that the metal contamination from mining activities on upper Ribeira de Iguape River alters the estuary. Toxicities were attributed mainly to metals suggesting that the anthropic factors are capable of producing ecological risks. Additionally, such as summer toxicity are present in the northern estuarine portion and during winter, this same toxicity appears to be in the southern portion, this study evidenced that depositional areas appears to move along the estuary, which in its turn depends on the freshwater inputs associate to seasonality.

A caracterização bioquímica da (Na+,K+)-ATPase, uma importante enzima envolvida no controle osmo-iônico nos crustáceos osmorreguladores, foi realizada a partir de centrifugação diferencial de frações microsomais do tecido branquial do siri eurialino C. danae, coletado na Baía de Ubatuba e mantido a 33o/oo de salinidade (animais recém-capturados). A ultracentrifugação da fração microsomal em um gradiente contínuo de sacarose (10-50%) revelou a presença de um único pico de atividade (Na+, K+)-ATPase, coincidente com o pico de atividade K+-fosfatase. Ambas as atividades foram inibidas completamente pela ouabaína. O Western blotting da fração microsomal apresentou uma única banda imunoespecífica contra a subunidade alfa da (Na+, K+)-ATPase, sugerindo a presença de uma única isoforma para a cadeia alfa da enzima. A hidrólise do ATP ocorreu em sítios de alta afinidade que apresentaram interações sítio-sítio (nH=3,6) com uma atividade específica V= 35,4 ± 2,1 U/mg e K0,5= 54,0 ± 4,0 nM, bem como em sítios de baixa afinidade, que obedeceram uma cinética Michaeliana, com V= 271,5 ± 17,2 U/mg e KM = 55,0 ± 3,0 uM. A estimulação da atividade da enzima pelos íons Na+ (V= 302,1 ± 14,1 U/mg e K0,5= 5,80 ± 0,3 mM), Mg2+ (V= 309,7 ± 15,7 U/mg e K0,5= 0,48 ± 0,02 mM) e K+ (V= 294,0 ± 11,8 U/mg e K0,5= 1,61 ± 0,06 mM) ocorreu através de interações sítio-sítio, enquanto a estimulação pelos íons NH4+ obedeceu a uma cinética Michaeliana com V= 377,8 ± 22,7 U/mg e KM= 4,61 ± 0,27 mM). Interessantemente, os íons NH4+ estimularam sinergisticamente a atividade específica da enzima em cerca de 90% (V= 557,0 ± 28,3 U/mg), sugerindo que esses íons se ligam em diferentes sítios na molécula. A (Na+,K+)-ATPase do tecido branquial de C. danae hidrolisou o PNFF com V= 125,4 ± 7,5 U/mg, K0,5= 1,2 ± 0,1 mM, através de interações cooperativas (nH= 1,5). Além disso, essa atividade K+-fosfatase foi inibida competitivamente pelo ATP (KI= 57,2 ± 2,6 µM), sugerindo que os dois substratos foram hidrolisados no mesmo sítio da enzima. A estimulação da atividade K+-fosfatase da (Na+,K+)-ATPase pelos íons K+ (V= 121,0 ± 6,1 U/mg; K0,5= 2,1 ± 0,1 mM), Mg2+ (V= 125,3 ± 6,3 U/mg; K0,5= 1,0 ± 0,1 mM) e NH4+ (V= 126,1 ± 4,8 U/mg; K0,5= 13,7 ± 0,5 mM) ocorreram através de interações sítio-sítio, similarmente ao observado para o ATP. A ouabaína e o ortovanadato inibiram completamente a atividade (Na+,K+)-ATPase (KI= 147,2 ± 7,2 uM; KI= 11,2 ± 0,6 nM, respectivamente). Entretanto, para a atividade K+-fosfatase os valores determinados foram significativamente superiores (KI= 830,3 ± 42,5 uM; KI= 34,0 ± 1,4 nM, respectivamente). A inibição da atividade da (Na+,K+)-ATPase por essas duas substâncias foi afetada pela presença de íons NH4+. Entretanto, o mesmo não ocorreu com a atividade K+-fosfatase da enzima. A representação de Arrhenius revelou a ocorrência de uma transição de fase próximo a 19°C, com deltaH1= 15.939 cal/mol e outra a 38°C com deltaH2= 7.719 cal/mol. Temperaturas acima de 43°C provocaram uma rápida inativação da (Na+,K+)-ATPase. Esta é a primeira demonstração da presença de um sítio de alta afinidade para o ATP na (Na+,K+)-ATPase de crustáceo. Os resultados obtidos sugerem que as atividades (Na+,K+)-ATPase e K+-fosfatase pertencem à mesma enzima e que a preparação não apresenta contaminações por outras ATPases e/ou fosfatases. Do ponto de vista fisiológico, os resultados deste trabalho são relevantes em relação à excreção ativa dos íons NH4+ pelos crustáceos. / The modulation by Mg+2, Na+, K+, NH4+ ions and ATP of the (Na+, K+)-ATPase activity in a microsomal fraction from Callinectes danae gills was analyzed. ATP was hydrolyzed at high-affinity binding sites at a maximal rate of V= 35.4 ± 2.1 U/mg and K0.5= 54.0 ± 3.6 nM, obeying cooperative kinetics (nH= 3.6). At low-affinity sites, the enzyme hydrolyzed ATP obeying Michaelis-Menten kinetics with KM= 55.0 ± 3.0 uM and V= 271.5 ± 17.2 U/mg. This is the first demonstration of a crustacean (Na+, K+)-ATPase possessing two ATP hydrolyzing sites. Stimulation by sodium (K0.5= 5.80 ± 0.30 mM), magnesium (K0.5= 0.48 ± 0.02 mM) and potassium ions (K0.5= 1.61 ± 0.06 mM) exhibited site-site interactions, while that by ammonium ions obeyed Michaelis-Menten kinetics (KM= 4.61 ± 0.27 mM). Ouabain (KI= 147.2 ± 7.2 uM) and orthovanadate (KI= 11.2 ± 0.6 nM) completely inhibited ATPase activity, indicating the absence of contaminating ATPase and/or neutral phosphatase activities. Ammonium and potassium ions synergistically stimulated the enzyme, increasing specific activities up to 90%, suggesting that these ions bind to different sites on the molecule and that the presence of each ion modulates enzyme stimulation by the other. The kinetic properties of a microsomal gill (Na+,K+)-ATPase were also analyzed using p-nitrophenylphosphate as substrate. The (Na+,K+)-ATPase hydrolyzed the substrate obeying cooperative kinetics (n= 1.5) at rates of V= 125.4 ± 7.5 U/mg and K0.5= 1.2 ± 0.1 mM and ATP competitively inhibited K+-phosphatase activity (KI= 57.2 ± 2.6 µM). Enzyme stimulation by potassium (V= 121.0 ± 6.1 U/mg; K0.5= 2.1 ± 0.1 mM) and magnesium ions (V= 125.3 ± 6.3 U/mg; K0.5= 1.0 ± 0.1 mM) was cooperative. Ammonium ions stimulated the enzyme through site-site interactions to a rate of V= 126.1 ± 4.8 U/mg with K0.5= 13.7 ± 0.5 mM. However, the K+-phosphatase activity was not synergistically stimulated using potassium plus ammonium ions. Sodium ions (KI= 36.7 ± 1.7 mM), ouabain (KI= 830.3 ± 42.5 uM) and orthovanadate (KI= 34.0 ± 1.4 nM) completely inhibited K+-phosphatase activity. The data show that the K+-phosphatase activity corresponds strictly to the (Na+,K+)-ATPase. This is the first invertebrate (Na+,K+)-ATPase shown to exhibit both high- and low-affinity sites for ATP hydrolysis and synergistic stimulation by potassium and ammonium ions (Masui et al., 2002). Further characterization of the K+-phosphatase activity will reveal its specific kinetic characteristics and may become a useful tool in comparative osmoregulatory studies.

O presente estudo teve como objetivo desenvolver uma nova proposta de uso de um biomonitor na identificação de fontes emissoras de metais no meio ambiente. Foi selecionada a espécie de siri Callinectes danae como biomonitor e o estuário de Santos como área de estudo. Numa primeira etapa e considerando que o siri é um organismo bentônico, foi realizada uma avaliação preliminar do teor de metais no sedimento do estuário. Em seguida, foi realizada uma avaliação preliminar do teor de metais nos diferentes tecidos de indivíduos coletados na região (brânquias, hepatopâncreas e músculos). Baseado nos experimentos anteriores, foi proposto um modelo de distribuição dos metais entre os tecidos e destes em relação aos sedimentos. A validação deste modelo de distribuição (assinatura química) foi realizada por meio de um conjunto de procedimentos que visaram testar: 1) a robustez em função do tempo; 2) a especificidade para a região de estudo; 3) a sensibilidade às alterações dos níveis de metais em cada tecido. A partir deste modelo, foram identificados indícios para atribuição de fontes emissoras de metais. Desta forma, concluiu-se que, para a região do estuário de Santos, o siri da espécie C. danae pode ser utilizado como um biomonitor. O modelo proposto foi eficaz, uma vez que foi capaz de responder de forma conclusiva-positiva a todos os testes realizados na sua validação, confirmando esta espécie como um biomonitor definitivo para região. A robustez do modelo irá aumentar com novas coletas e a realimentação do banco de dados. / This study aimed to develop a new methodology for the use of a biomonitor in the identification of metal discharges in environmental evaluations. Crabs of Callinectes danae species were used in an evaluation conducted in the Santos Estuarine System. In the first experiment and since C. danae is a benthic species, a preliminary assessment of the metal concentrations in sediment samples collected in the Santos Estuarine System was performed. Subsequently, a preliminary assessment of metal concentrations in the C. danae tissues was also peformed. The last experiment aimed to identify a chemical fingerprint for the Santos Estuarine System.The development of validation procedures for this model (chemical fingerprint) was conducted and aimed to test: 1) the stability of this model through time; 2) its local specificity for the Santos Estuarine System; 3) the sensibility of this model due to modifications in the metal concentrations in each tissue (gills, hepatopancreas and muscles). By the use of this model, it was possible to identify the sources of metal emissions. According to the results, C. danae can be used as a biomonitor for the Santos Estuarine System. The established model was able to responde in a positive-conclusive way to all the tests performed in its validation, confirming this species as a definitive biomonitor for this area. Thus, the stability of this model will increase with new sampling campaings and consequently introduction of new information in the database.

O presente estudo teve como objetivo desenvolver uma nova proposta de uso de um biomonitor na identificação de fontes emissoras de metais no meio ambiente. Foi selecionada a espécie de siri Callinectes danae como biomonitor e o estuário de Santos como área de estudo. Numa primeira etapa e considerando que o siri é um organismo bentônico, foi realizada uma avaliação preliminar do teor de metais no sedimento do estuário. Em seguida, foi realizada uma avaliação preliminar do teor de metais nos diferentes tecidos de indivíduos coletados na região (brânquias, hepatopâncreas e músculos). Baseado nos experimentos anteriores, foi proposto um modelo de distribuição dos metais entre os tecidos e destes em relação aos sedimentos. A validação deste modelo de distribuição (assinatura química) foi realizada por meio de um conjunto de procedimentos que visaram testar: 1) a robustez em função do tempo; 2) a especificidade para a região de estudo; 3) a sensibilidade às alterações dos níveis de metais em cada tecido. A partir deste modelo, foram identificados indícios para atribuição de fontes emissoras de metais. Desta forma, concluiu-se que, para a região do estuário de Santos, o siri da espécie C. danae pode ser utilizado como um biomonitor. O modelo proposto foi eficaz, uma vez que foi capaz de responder de forma conclusiva-positiva a todos os testes realizados na sua validação, confirmando esta espécie como um biomonitor definitivo para região. A robustez do modelo irá aumentar com novas coletas e a realimentação do banco de dados. / This study aimed to develop a new methodology for the use of a biomonitor in the identification of metal discharges in environmental evaluations. Crabs of Callinectes danae species were used in an evaluation conducted in the Santos Estuarine System. In the first experiment and since C. danae is a benthic species, a preliminary assessment of the metal concentrations in sediment samples collected in the Santos Estuarine System was performed. Subsequently, a preliminary assessment of metal concentrations in the C. danae tissues was also peformed. The last experiment aimed to identify a chemical fingerprint for the Santos Estuarine System.The development of validation procedures for this model (chemical fingerprint) was conducted and aimed to test: 1) the stability of this model through time; 2) its local specificity for the Santos Estuarine System; 3) the sensibility of this model due to modifications in the metal concentrations in each tissue (gills, hepatopancreas and muscles). By the use of this model, it was possible to identify the sources of metal emissions. According to the results, C. danae can be used as a biomonitor for the Santos Estuarine System. The established model was able to responde in a positive-conclusive way to all the tests performed in its validation, confirming this species as a definitive biomonitor for this area. Thus, the stability of this model will increase with new sampling campaings and consequently introduction of new information in the database.

A caracterização bioquímica da (Na+,K+)-ATPase, uma importante enzima envolvida no controle osmo-iônico nos crustáceos osmorreguladores, foi realizada a partir de centrifugação diferencial de frações microsomais do tecido branquial do siri eurialino C. danae, coletado na Baía de Ubatuba e mantido a 33o/oo de salinidade (animais recém-capturados). A ultracentrifugação da fração microsomal em um gradiente contínuo de sacarose (10-50%) revelou a presença de um único pico de atividade (Na+, K+)-ATPase, coincidente com o pico de atividade K+-fosfatase. Ambas as atividades foram inibidas completamente pela ouabaína. O Western blotting da fração microsomal apresentou uma única banda imunoespecífica contra a subunidade alfa da (Na+, K+)-ATPase, sugerindo a presença de uma única isoforma para a cadeia alfa da enzima. A hidrólise do ATP ocorreu em sítios de alta afinidade que apresentaram interações sítio-sítio (nH=3,6) com uma atividade específica V= 35,4 ± 2,1 U/mg e K0,5= 54,0 ± 4,0 nM, bem como em sítios de baixa afinidade, que obedeceram uma cinética Michaeliana, com V= 271,5 ± 17,2 U/mg e KM = 55,0 ± 3,0 uM. A estimulação da atividade da enzima pelos íons Na+ (V= 302,1 ± 14,1 U/mg e K0,5= 5,80 ± 0,3 mM), Mg2+ (V= 309,7 ± 15,7 U/mg e K0,5= 0,48 ± 0,02 mM) e K+ (V= 294,0 ± 11,8 U/mg e K0,5= 1,61 ± 0,06 mM) ocorreu através de interações sítio-sítio, enquanto a estimulação pelos íons NH4+ obedeceu a uma cinética Michaeliana com V= 377,8 ± 22,7 U/mg e KM= 4,61 ± 0,27 mM). Interessantemente, os íons NH4+ estimularam sinergisticamente a atividade específica da enzima em cerca de 90% (V= 557,0 ± 28,3 U/mg), sugerindo que esses íons se ligam em diferentes sítios na molécula. A (Na+,K+)-ATPase do tecido branquial de C. danae hidrolisou o PNFF com V= 125,4 ± 7,5 U/mg, K0,5= 1,2 ± 0,1 mM, através de interações cooperativas (nH= 1,5). Além disso, essa atividade K+-fosfatase foi inibida competitivamente pelo ATP (KI= 57,2 ± 2,6 µM), sugerindo que os dois substratos foram hidrolisados no mesmo sítio da enzima. A estimulação da atividade K+-fosfatase da (Na+,K+)-ATPase pelos íons K+ (V= 121,0 ± 6,1 U/mg; K0,5= 2,1 ± 0,1 mM), Mg2+ (V= 125,3 ± 6,3 U/mg; K0,5= 1,0 ± 0,1 mM) e NH4+ (V= 126,1 ± 4,8 U/mg; K0,5= 13,7 ± 0,5 mM) ocorreram através de interações sítio-sítio, similarmente ao observado para o ATP. A ouabaína e o ortovanadato inibiram completamente a atividade (Na+,K+)-ATPase (KI= 147,2 ± 7,2 uM; KI= 11,2 ± 0,6 nM, respectivamente). Entretanto, para a atividade K+-fosfatase os valores determinados foram significativamente superiores (KI= 830,3 ± 42,5 uM; KI= 34,0 ± 1,4 nM, respectivamente). A inibição da atividade da (Na+,K+)-ATPase por essas duas substâncias foi afetada pela presença de íons NH4+. Entretanto, o mesmo não ocorreu com a atividade K+-fosfatase da enzima. A representação de Arrhenius revelou a ocorrência de uma transição de fase próximo a 19°C, com deltaH1= 15.939 cal/mol e outra a 38°C com deltaH2= 7.719 cal/mol. Temperaturas acima de 43°C provocaram uma rápida inativação da (Na+,K+)-ATPase. Esta é a primeira demonstração da presença de um sítio de alta afinidade para o ATP na (Na+,K+)-ATPase de crustáceo. Os resultados obtidos sugerem que as atividades (Na+,K+)-ATPase e K+-fosfatase pertencem à mesma enzima e que a preparação não apresenta contaminações por outras ATPases e/ou fosfatases. Do ponto de vista fisiológico, os resultados deste trabalho são relevantes em relação à excreção ativa dos íons NH4+ pelos crustáceos. / The modulation by Mg+2, Na+, K+, NH4+ ions and ATP of the (Na+, K+)-ATPase activity in a microsomal fraction from Callinectes danae gills was analyzed. ATP was hydrolyzed at high-affinity binding sites at a maximal rate of V= 35.4 ± 2.1 U/mg and K0.5= 54.0 ± 3.6 nM, obeying cooperative kinetics (nH= 3.6). At low-affinity sites, the enzyme hydrolyzed ATP obeying Michaelis-Menten kinetics with KM= 55.0 ± 3.0 uM and V= 271.5 ± 17.2 U/mg. This is the first demonstration of a crustacean (Na+, K+)-ATPase possessing two ATP hydrolyzing sites. Stimulation by sodium (K0.5= 5.80 ± 0.30 mM), magnesium (K0.5= 0.48 ± 0.02 mM) and potassium ions (K0.5= 1.61 ± 0.06 mM) exhibited site-site interactions, while that by ammonium ions obeyed Michaelis-Menten kinetics (KM= 4.61 ± 0.27 mM). Ouabain (KI= 147.2 ± 7.2 uM) and orthovanadate (KI= 11.2 ± 0.6 nM) completely inhibited ATPase activity, indicating the absence of contaminating ATPase and/or neutral phosphatase activities. Ammonium and potassium ions synergistically stimulated the enzyme, increasing specific activities up to 90%, suggesting that these ions bind to different sites on the molecule and that the presence of each ion modulates enzyme stimulation by the other. The kinetic properties of a microsomal gill (Na+,K+)-ATPase were also analyzed using p-nitrophenylphosphate as substrate. The (Na+,K+)-ATPase hydrolyzed the substrate obeying cooperative kinetics (n= 1.5) at rates of V= 125.4 ± 7.5 U/mg and K0.5= 1.2 ± 0.1 mM and ATP competitively inhibited K+-phosphatase activity (KI= 57.2 ± 2.6 µM). Enzyme stimulation by potassium (V= 121.0 ± 6.1 U/mg; K0.5= 2.1 ± 0.1 mM) and magnesium ions (V= 125.3 ± 6.3 U/mg; K0.5= 1.0 ± 0.1 mM) was cooperative. Ammonium ions stimulated the enzyme through site-site interactions to a rate of V= 126.1 ± 4.8 U/mg with K0.5= 13.7 ± 0.5 mM. However, the K+-phosphatase activity was not synergistically stimulated using potassium plus ammonium ions. Sodium ions (KI= 36.7 ± 1.7 mM), ouabain (KI= 830.3 ± 42.5 uM) and orthovanadate (KI= 34.0 ± 1.4 nM) completely inhibited K+-phosphatase activity. The data show that the K+-phosphatase activity corresponds strictly to the (Na+,K+)-ATPase. This is the first invertebrate (Na+,K+)-ATPase shown to exhibit both high- and low-affinity sites for ATP hydrolysis and synergistic stimulation by potassium and ammonium ions (Masui et al., 2002). Further characterization of the K+-phosphatase activity will reveal its specific kinetic characteristics and may become a useful tool in comparative osmoregulatory studies.

As propriedades bioquímicas da (Na+,K+)-ATPase branquial do siri eurialino Callinectes danae aclimatado à salinidade de 15 o/oo foram estudadas. A análise do gradiente de centrifugação em sacarose revelou a presença de um único pico entre 30-35% de sacarose, com uma boa correlação entre as atividades PNFFase a ATPase totais e (Na+,K+)-ATPase. A atividade residual observada na presença de ouabaína 3 mM sugere a presença de outros sistemas de enzimas atuantes. A eletroforese em condições desnaturantes nos microsomas de brânquias de C. danae em animais recém-coletados em salinidade de 33 o/oo (não aclimatados) e de aclimatados a salinidades de 15 e 33 o/oo por um período de 10 dias mostrou a presença de pequenas diferenças nos padrões eletroforéticos das diferentes amostras. A análise por Western blot mostrou um aumento significativo da proporção relativa da subunidade alfa da (Na+,K+)-ATPase em relação à proteína total na fração microsomal do tecido branquial de animais aclimatados à salinidade de 15 o/oo quando comparados aos animais aclimatados a 33 o/oo. Entretanto, proporções similares de subunidade alfa foram observadas para amostras de animais recém-coletados a salinidade de 33 o/oo e aclimatados a 15 o/oo. A estimulação da atividade (Na+,K+)-ATPase pelo ATP ocorreu através de uma curva de saturação monofásica apresentando interações sítio-sítio (nH=1,2), com V= 298,8 ± 16,7 U/mg, com K0,5 de 174,2 ± 9,8 uM. A estimulação da atividade ATPase da (Na+,K+)-ATPase por íons Mg2+ (V= 299,16 ± 14,06 U/mg; K0,5= 767,31 ± 36,06 uM), íons Na+ (V= 309,0 ± 15,8 U/mg; K0,5= 7,8 ± 0,4 mM), íons K+ (V= 300,6 ± 15,3 U/mg; K0,5= 1,63 ± 0,08 mM) e íons NH4+ (V= 345,1 ± 19,0 U/mg; K0,5= 6,0 ± 0,3 mM) ocorreu através de interações sítio-sítio. A atividade da enzima foi modulada sinergisticamente pelos íons K+ com atividade máxima variando de 300,6 ± 15,3 U/mg para 514,6 ± 26,2 U/mg, na ausência e na presença 50 mM de íons NH4+, respectivamente. Além disso, foi observado um significativo aumento na afinidade aparente da enzima pelo íon K+ da ordem de 10 vezes (diminuiu de 1,6 ± 0,08 mM para 0,157 ± 0,008 mM). Similarmente ao observado para os íons K+, o íon NH4+ estimulou sinergisticamente a atividade da enzima na presença de diferentes concentrações de íons K+. A estimulação da atividade da enzima pelo íon NH4+ também ocorreu através de interações cooperativas entre os sítios. Embora tenha sido observado um aumento da atividade específica da enzima de 345,1 ± 19,0 U/mg para 516,8 ± 27,9 U/mg, não foram observadas variações significativas nos valores de nH e K0,5 com o aumento da concentração de íons K+. A ouabaína inibiu cerca de 90% da atividade ATPase total. A inibição pela ouabaína apresentou valor de KI de 45,09 ± 2,51 uM. O ortovanadato também inibiu atividade (Na+,K+)-ATPase na mesma faixa (90%) através de uma curva de inibição monofásica, com valor de KI da ordem de 1,31 ± 0,06 uM. O emprego de bafilomicina A1, tapsigargina e teofilina, juntamente com a ouabaína, na atividade ATPase total descartam a presença de V-ATPase, Ca2+-ATPase ou fosfatase, respectivamente. Apesar da inibição por oligomicina corresponder a menos de 3,7%, esse valor aparentemente sugere a presença de uma F0F1-ATPase. Além disso, a inibição por ácido etacrínico, em conjunto com os experimentos de estimulação por da atividade ATPase da enzima por íons Na+ sugere fortemente a presença de uma K+-ATPase. A (Na+,K+)-ATPase hidrolisou o substrato PNFF obedecendo à cinética Michaeliana com velocidade de V= 102,9 ± 4,3 U/mg e KM= 1,7 ± 0,1 mM. Já a estimulação da atividade K+-fosfatase da enzima por íons Mg2+ (V= 93,7 ± 2,3 U/mg; K0,5= 1,40 ± 0,03 mM), K+ (V= 94,9 ± 3,5 U/mg; K0,5= 2,9 ± 0,1 mM) e NH4+ (V= 106,2 ± 2,2 U/mg; K0,5= 9,8 ± 0,2 mM) seguiu uma cinética cooperativa, sugerindo a presença de múltiplos sítios de ligação. Entretanto, a atividade K+-fosfatase não foi estimulada sinergísticamente na presença de íons K+ mais NH4+. Os íons sódio (KI= 22,7 ± 1,7 mM) e ortovanadato (KI= 28,1 ± 1,4 nM) inibiram completamente a atividade fosfatase total através de uma única curva de inibição. / The biochemical properties of the (Na+,K+)-ATPase from the gill microsomal tissue of the euryhaline, marine, swimming crab Callinectes danae, acclimated to 15 0/00 salinity, were investigated. Sucrose gradient centrifugation analyses revealed a unique peak, between 30-35% sucrose, coincident with the total PNPPase, ATPase, and (Na+,K+)-ATPase activities. The residual activity observed in the presence of 3 mM ouabain suggests the existence of other enzyme systems. Electrophoresis under denaturing conditions, using material from fresh-caught crabs (33 o/oo salinity, not acclimated), and from crabs acclimated to 15 or 33 o/oo salinity, for 10 days, revealed differences in migration pattern. Western blot analyses showed a significant increase in the amount of (Na+,K+)-ATPase alpha-subunit relative to total protein, for crabs acclimated to 15 o/oo compared to those acclimated to 33 o/oo salinity. However, the proportion of alpha-subunit in samples from fresh-caught crabs acclimated to 33 o/oo and those acclimated to 15 o/oo salinity was similar. (Na+,K+)-ATPase activity was stimulated by ATP and showed a single saturation curve, exhibiting site-site interactions (nH=1.2), with V= 298.8 ± 16.7 U/mg, and K0.5= 174.2 ± 9.8 uM. Stimulation of the ATPase activity by Mg2+ (V= 299.16 ± 14.06 U/mg; K0.5= 767.31 ± 36.06 uM), Na+ (V= 309.0 ± 15.8 U/mg; K0.5= 7.8 ± 0.4 mM), K+ (V= 300.6 ± 15.3 U/mg; K0.5= 1.63 ± 0.08 mM) and NH4+ ions (V= 345.1 ± 19.0 U/mg; K0.5= 6.0 ± 0.3 mM) occurred through site-site interactions. (Na+,K+)-ATPase activity was synergistically modulated by K+ ions, maximum activity varying from 300.6 ± 15.3 U/mg to 514.6 ± 26.2 U/mg, in the absence and presence of 50 mM NH4+ ions, respectively. K+ ions induced a 10-fold increase in enzyme apparent affinity (from 1.6 ± 0.08 mM to 0.157 ± 0.008 mM). As for K+ ions, NH4+ synergistically stimulated enzyme activity in the presence of variable K+ concentrations. The stimulation by NH4+ ions exhibited cooperative, site-site interactions. Although an increase in specific activity from 345.1 ± 19.0 U/mg to 516.8 ± 27.9 U/mg was seen, no significant changes in nH and K0.5 were observed. Ouabain inhibited total ATPase activity by about 90%, showing a KI= 45.09 ± 2.51 uM. Orthovanadate also inhibited the (Na+,K+)-ATPase with a KI of 1.31 ± 0.06 uM. Although the inhibitory effect of oligomycin was minimal (3.7%), this inhibition may suggest F0F1-ATPase activity. The inhibition by ethacrynic acid, in association with Na+ ion stimulation of the ATPase activity, suggests the presence of a K+-ATPase. The (Na+,K+)-ATPase hydrolyzed PNPP (K+-phosphatase activity) obeying Michaelian kinetics, with V= 102.9 ± 4.3 U/mg and KM= 1.7 ± 0.1 mM. The stimulation of K+-phosphatase activity by Mg2+ (V= 93.7 ± 2.3 U/mg; K0.5= 1.4 ± 0.03 mM), K+ (V= 94.9 ± 3.5 U/mg; K0.5= 2.9 ± 0.1 mM), and NH4+ ions (V= 106.2 ± 2.2 U/mg; K0.5= 9.8 ± 0.2 mM) following cooperative kinetics, suggests multiple binding sites. K+-phosphatase activity, however, was not synergistically stimulated by K+ and NH4+. Sodium ions (KI= 22.7 ± 1.7 mM), and orthovanadate (KI= 28.1 ± 1.4 nM) totally inhibited the total phosphatase activity.

As propriedades bioquímicas da (Na+,K+)-ATPase branquial do siri eurialino Callinectes danae aclimatado à salinidade de 15 o/oo foram estudadas. A análise do gradiente de centrifugação em sacarose revelou a presença de um único pico entre 30-35% de sacarose, com uma boa correlação entre as atividades PNFFase a ATPase totais e (Na+,K+)-ATPase. A atividade residual observada na presença de ouabaína 3 mM sugere a presença de outros sistemas de enzimas atuantes. A eletroforese em condições desnaturantes nos microsomas de brânquias de C. danae em animais recém-coletados em salinidade de 33 o/oo (não aclimatados) e de aclimatados a salinidades de 15 e 33 o/oo por um período de 10 dias mostrou a presença de pequenas diferenças nos padrões eletroforéticos das diferentes amostras. A análise por Western blot mostrou um aumento significativo da proporção relativa da subunidade alfa da (Na+,K+)-ATPase em relação à proteína total na fração microsomal do tecido branquial de animais aclimatados à salinidade de 15 o/oo quando comparados aos animais aclimatados a 33 o/oo. Entretanto, proporções similares de subunidade alfa foram observadas para amostras de animais recém-coletados a salinidade de 33 o/oo e aclimatados a 15 o/oo. A estimulação da atividade (Na+,K+)-ATPase pelo ATP ocorreu através de uma curva de saturação monofásica apresentando interações sítio-sítio (nH=1,2), com V= 298,8 ± 16,7 U/mg, com K0,5 de 174,2 ± 9,8 uM. A estimulação da atividade ATPase da (Na+,K+)-ATPase por íons Mg2+ (V= 299,16 ± 14,06 U/mg; K0,5= 767,31 ± 36,06 uM), íons Na+ (V= 309,0 ± 15,8 U/mg; K0,5= 7,8 ± 0,4 mM), íons K+ (V= 300,6 ± 15,3 U/mg; K0,5= 1,63 ± 0,08 mM) e íons NH4+ (V= 345,1 ± 19,0 U/mg; K0,5= 6,0 ± 0,3 mM) ocorreu através de interações sítio-sítio. A atividade da enzima foi modulada sinergisticamente pelos íons K+ com atividade máxima variando de 300,6 ± 15,3 U/mg para 514,6 ± 26,2 U/mg, na ausência e na presença 50 mM de íons NH4+, respectivamente. Além disso, foi observado um significativo aumento na afinidade aparente da enzima pelo íon K+ da ordem de 10 vezes (diminuiu de 1,6 ± 0,08 mM para 0,157 ± 0,008 mM). Similarmente ao observado para os íons K+, o íon NH4+ estimulou sinergisticamente a atividade da enzima na presença de diferentes concentrações de íons K+. A estimulação da atividade da enzima pelo íon NH4+ também ocorreu através de interações cooperativas entre os sítios. Embora tenha sido observado um aumento da atividade específica da enzima de 345,1 ± 19,0 U/mg para 516,8 ± 27,9 U/mg, não foram observadas variações significativas nos valores de nH e K0,5 com o aumento da concentração de íons K+. A ouabaína inibiu cerca de 90% da atividade ATPase total. A inibição pela ouabaína apresentou valor de KI de 45,09 ± 2,51 uM. O ortovanadato também inibiu atividade (Na+,K+)-ATPase na mesma faixa (90%) através de uma curva de inibição monofásica, com valor de KI da ordem de 1,31 ± 0,06 uM. O emprego de bafilomicina A1, tapsigargina e teofilina, juntamente com a ouabaína, na atividade ATPase total descartam a presença de V-ATPase, Ca2+-ATPase ou fosfatase, respectivamente. Apesar da inibição por oligomicina corresponder a menos de 3,7%, esse valor aparentemente sugere a presença de uma F0F1-ATPase. Além disso, a inibição por ácido etacrínico, em conjunto com os experimentos de estimulação por da atividade ATPase da enzima por íons Na+ sugere fortemente a presença de uma K+-ATPase. A (Na+,K+)-ATPase hidrolisou o substrato PNFF obedecendo à cinética Michaeliana com velocidade de V= 102,9 ± 4,3 U/mg e KM= 1,7 ± 0,1 mM. Já a estimulação da atividade K+-fosfatase da enzima por íons Mg2+ (V= 93,7 ± 2,3 U/mg; K0,5= 1,40 ± 0,03 mM), K+ (V= 94,9 ± 3,5 U/mg; K0,5= 2,9 ± 0,1 mM) e NH4+ (V= 106,2 ± 2,2 U/mg; K0,5= 9,8 ± 0,2 mM) seguiu uma cinética cooperativa, sugerindo a presença de múltiplos sítios de ligação. Entretanto, a atividade K+-fosfatase não foi estimulada sinergísticamente na presença de íons K+ mais NH4+. Os íons sódio (KI= 22,7 ± 1,7 mM) e ortovanadato (KI= 28,1 ± 1,4 nM) inibiram completamente a atividade fosfatase total através de uma única curva de inibição. / The biochemical properties of the (Na+,K+)-ATPase from the gill microsomal tissue of the euryhaline, marine, swimming crab Callinectes danae, acclimated to 15 0/00 salinity, were investigated. Sucrose gradient centrifugation analyses revealed a unique peak, between 30-35% sucrose, coincident with the total PNPPase, ATPase, and (Na+,K+)-ATPase activities. The residual activity observed in the presence of 3 mM ouabain suggests the existence of other enzyme systems. Electrophoresis under denaturing conditions, using material from fresh-caught crabs (33 o/oo salinity, not acclimated), and from crabs acclimated to 15 or 33 o/oo salinity, for 10 days, revealed differences in migration pattern. Western blot analyses showed a significant increase in the amount of (Na+,K+)-ATPase alpha-subunit relative to total protein, for crabs acclimated to 15 o/oo compared to those acclimated to 33 o/oo salinity. However, the proportion of alpha-subunit in samples from fresh-caught crabs acclimated to 33 o/oo and those acclimated to 15 o/oo salinity was similar. (Na+,K+)-ATPase activity was stimulated by ATP and showed a single saturation curve, exhibiting site-site interactions (nH=1.2), with V= 298.8 ± 16.7 U/mg, and K0.5= 174.2 ± 9.8 uM. Stimulation of the ATPase activity by Mg2+ (V= 299.16 ± 14.06 U/mg; K0.5= 767.31 ± 36.06 uM), Na+ (V= 309.0 ± 15.8 U/mg; K0.5= 7.8 ± 0.4 mM), K+ (V= 300.6 ± 15.3 U/mg; K0.5= 1.63 ± 0.08 mM) and NH4+ ions (V= 345.1 ± 19.0 U/mg; K0.5= 6.0 ± 0.3 mM) occurred through site-site interactions. (Na+,K+)-ATPase activity was synergistically modulated by K+ ions, maximum activity varying from 300.6 ± 15.3 U/mg to 514.6 ± 26.2 U/mg, in the absence and presence of 50 mM NH4+ ions, respectively. K+ ions induced a 10-fold increase in enzyme apparent affinity (from 1.6 ± 0.08 mM to 0.157 ± 0.008 mM). As for K+ ions, NH4+ synergistically stimulated enzyme activity in the presence of variable K+ concentrations. The stimulation by NH4+ ions exhibited cooperative, site-site interactions. Although an increase in specific activity from 345.1 ± 19.0 U/mg to 516.8 ± 27.9 U/mg was seen, no significant changes in nH and K0.5 were observed. Ouabain inhibited total ATPase activity by about 90%, showing a KI= 45.09 ± 2.51 uM. Orthovanadate also inhibited the (Na+,K+)-ATPase with a KI of 1.31 ± 0.06 uM. Although the inhibitory effect of oligomycin was minimal (3.7%), this inhibition may suggest F0F1-ATPase activity. The inhibition by ethacrynic acid, in association with Na+ ion stimulation of the ATPase activity, suggests the presence of a K+-ATPase. The (Na+,K+)-ATPase hydrolyzed PNPP (K+-phosphatase activity) obeying Michaelian kinetics, with V= 102.9 ± 4.3 U/mg and KM= 1.7 ± 0.1 mM. The stimulation of K+-phosphatase activity by Mg2+ (V= 93.7 ± 2.3 U/mg; K0.5= 1.4 ± 0.03 mM), K+ (V= 94.9 ± 3.5 U/mg; K0.5= 2.9 ± 0.1 mM), and NH4+ ions (V= 106.2 ± 2.2 U/mg; K0.5= 9.8 ± 0.2 mM) following cooperative kinetics, suggests multiple binding sites. K+-phosphatase activity, however, was not synergistically stimulated by K+ and NH4+. Sodium ions (KI= 22.7 ± 1.7 mM), and orthovanadate (KI= 28.1 ± 1.4 nM) totally inhibited the total phosphatase activity.

Made available in DSpace on 2014-06-12T22:57:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo1333_1.pdf: 727183 bytes, checksum: e370d1619a847ea6e2834f8c66cea7d2 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Nas regiões tropicais e subtropicais destacam-se os manguezais por apresentarem condições favoráveis para alimentação, proteção e reprodução de diversas espécies de animais. O complexo estuarino do Canal de Santa Cruz merece atenção por sua alta produtividade e por apresentar uma atividade pesqueira intensa. Neste contexto, o siri Callinectes danae Smith, 1869 possui importante papel na dinâmica trófica desses ecossistemas, atuando principalmente como necrófagos e ativos predadores. Nesse intere, o presente trabalho teve por objetivo promover o estudo qualitativo e quantitativo da fauna bêntica do infralitoral e conhecer a alimentação natural de C. danae nos estuários dos Rios Botafogo e Carrapicho através da análise do conteúdo estomacal. Como definido pelo Instituto Milênio Uso e recursos da zona costeira , foi definido o Rio Botafogo como área experimental e o Rio Carrapicho como área controle. Ao longo de cada rio foram demarcadas quatro estações, nas quais foram realizadas coletas diurnas nos meses de agosto e outubro de 2003, janeiro, fevereiro, junho e agosto de 2004, através de arrastos com rede de porta com saco em malha de 5mm, com duração de 15 minutos. Em campo as amostras foram etiquetadas, acondicionadas em sacos plásticos e mantidas em caixa térmica com gelo. Foram anotados dados de profundidade, salinidade e temperatura da água de cada estação de coleta. No Laboratório de Carcinologia - DOCEAN/UFPE os organismos foram triados, identificados sob estereomicroscópio com auxílio de literatura pertinente, contados e mantidos em potes plásticos com álcool a 75%. Foram identificados sete grupos taxonômicos: Sipuncula, Porifera, Polychaeta, Mollusca, Echinodermata, Crustacea e Chordata; e 51 espécies, com duas novas ocorrências para as áreas estudadas (Charybdis hellerii e Paguristes triangulopsis). Destas, o Rio Botafogo apresentou 31 espécies em 8055 indivíduos, dos quais 70,9% são Mollusca, 27,6% Crustacea e 1,5% Echinodermata. Enquanto o Rio Carrapicho apresentou 47 espécies de um total de 1.013 indivíduos dos quais 62,2% são Crustacea, 20,5% Echinodermata, 9,2% Mollusca e 8,1% Polychaeta. Os demais grupos taxonômicos não foram utilizados nas análises estatísticas e o Rio Botafogo não apresentou organismos do grupo Polychaeta. Anomalocardia brasiliana foi a espécie mais abundante e dominante no Rio Botafogo e C. danae no Rio Carrapicho. As espécies da fauna bêntica apresentaram maiores valores de freqüência de ocorrência e abundância durante o período seco para as áreas estudadas. Separadamente os C. danae foram sexados e aferidos peso e largura da carapaça. Posteriormente os estômagos foram retirados, pesados e estimado o grau de repleção estomacal. Também sob estereomicroscópio e literatura pertinente os itens alimentares foram identificados e aplicada a metodologia de pontos. Foram identificados 9 itens na alimentação natural de C. danae nos rios estudados, Algae, Macrophyta, Foraminiferida, Mollusca, Polychaeta, Crustacea, Echinodermata, Teleostei e MOA (Matéria Orgânica Animal). MOA, Mollusca e Crustacea foram os itens mais freqüentes encontrados. Na análise da alimentação de machos e fêmeas não se verificou diferenças na preferência alimentar. Nas áreas estudadas Mollusca foi o item de maior contribuição durante o período seco e MOA no período chuvoso. No Rio Botafogo, as categorias adulto e jovem apresentaram diferenças na preferência alimentar durante o período seco, Mollusca e MOA, respectivamente, e semelhantes no período chuvoso, MOA para ambas as categorias. Já no Rio Carrapicho os resultados foram semelhantes, uma vez que as categorias adulto e jovem consumiram preferencialmente Mollusca no período seco e Crustacea no período chuvoso. Portanto, C. danae é uma espécie de hábito alimentar oportunista e sua preferência alimentar pode refletir a quantidade de suas presas no ambiente, uma vez que seus itens preferenciais corresponderam ao grupo das espécies mais abundantes neste trabalho