Die Herzinsuffizienz und damit einhergehend die beeinträchtigte kardiale Funktion bei chronischer Ischämie nach Myokardinfarkt (MI) wird mit niedrigerer Aktivität der Na+/K+-ATPase (NKA) in Zusammenhang gebracht. Die beiden Isoformen der katalytischen Untereinheit NKA-α1 und α2 unterscheiden sich teilweise in Lokalisation, Funktion und Interaktion mit dem NCX und weiterer Signalpartner. Das Ziel des Projekts war es herauszufinden, ob die Isoform NKA-α2 im Gegensatz zu NKA-α1 einen protektiven Effekt bei chronischer Ischämie nach einem Myokardinfarkt aufweist und was die Hintergründe hierfür sind. Hierfür wurden transgene Mäuse verwendet, die kardial entweder NKA-α1 oder NKA-α2 stark überexprimieren. Diese Mäuse wurden mit WT Mäuse verglichen. Ein Myokardinfarkt wurde mittels Legierung der LAD induziert und die Herzen nach acht Wochen entnommen. Um das Remodeling bei chronischer Ischämie in Mäusen zu untersuchen, wurden die Zellgröße (WGA Färbung) und der Anteil des fibrotisch umgebauten Gewebes (PSR Färbung) gemessen. TG α2 Tiere zeigten nach chronischer Ischämie einerseits weniger stark hypertrophierte Zellen, andererseits in der kritischen Borderzone zwischen vitalem Gewebe und infarziertem Bereich weniger Fibrose. Dies ging einher mit einem signifikant weniger starkem Verlust der linksventrikulären Verkürzungsfraktion nach MI, welche ein Parameter der kardialen Funktion ist. Das Level des oxidativen Stresses (ROS Detektion) änderte sich nach acht Wochen MI in TG α2 Tieren im Vergleich zu TG α1 und WT nicht. Nach acht Wochen MI zeigte sich die Expression der totalen NKA reduziert; v.a. TG α2 Tiere zeigten tendenziell sehr niedrige Expressionslevel der totalen NKA. Die geringere NKA Aktivität könnte mit der verbesserten kardialen Funktion zusammenhängen. Da jedoch nach MI in WT Mäusen die NKA-α2 verstärkt und NKA-α1 reduziert exprimiert wird, gehen wir davon aus, dass die Expression der NKA-α2 eine für die Zelle protektive Anpassung nach chronischer Ischämie ist, um sich vor Remodeling und damit einhergehendem Funktionsverlust zu schützen. Vermutlich wird NKA so lange auf geringerem Niveau exprimiert, bis die Natrium- und Calciumkonzentration so stark ansteigt, dass die Gefahr der Arrhythmie und die kardiale Dysfunktion zu groß wird. Der Vorteil der TG α2 Tiere entsteht vermutlich aus der Reduzierung der totalen NKA nach acht Wochen MI, um die Inotropie kompensatorisch hoch zu halten, bis spezifisch die Isoform NKA-α2 verstärkt exprimiert wird, um den Natriumüberhang und konsekutiv via NCX den Calciumüberhang zu reduzieren. Hinzu kommt, dass die Isoform NKA-α2 die prädominierende Isoform ist, die in der Mikrodomäne der T-Tubuli mit dem NCX agiert und für den Ausgleich des Natrium- und Calciumhaushalts nach MI sorgt. Die gesteigerte Expression des NCXs nach MI in TG α2 Tieren mit verbessertem Abtransport von Calcium könnte zu der reduzierten Entwicklung von Hypertrophie und Fibrosierung beitragen. Dies wiederum verhindert den Progress der dilatativen Herzinsuffizienz bei chronischer Ischämie und bringt somit einen protektiven Effekt auf die Prognose und die kardiale Funktion nach MI mit sich. / An inhibited Na+/K+-ATPase (NKA) pump activity could result in impaired cardiac function and reactive remodeling particularly in heart failure associated with myocardial infarction (MI). There are two different catalytic NKA isoforms, NKA-α1 and NKA-α2, which exhibit different characteristics regarding their sodium affinity, localization, and association with the Na/Ca exchanger (NCX) and regulation by signaling partners. Aim of the present study was to determine whether the overexpression of NKA-α2 and not NKA-α1 affects functional deterioration and remodeling during MI and why this protective benefit occurs. Transgenic mice with a cardiac overexpression of NKA-α2 (TG α2) and NKA-α1 (TG α1) were subjected to chronic MI injury for eight weeks. MI was induced by the surgical ligation of the left coronary artery. Non-transgenic (wildtype, WT) littermates were used as controls. The analyses of hypertrophy (gravimetry, WGA staining) and fibrosis (Picrosirius red staining) showed less cardiac remodeling after MI in TG α2 mice. Elevated NKA α2 expression in transgenic mice protects against functional deterioration which was shown in preserved fractional shortening after MI. Although the expression of total NKA is decreased after chronic ischemia, the increased expression of NKA isoform α2 and not α1 could be a favorable alteration that protects from heart failure progression induced by MI injury. We assume that total NKA expression is depressed in chronic heart failure especially in TG α2 mice to increase natrium and calcium load in the cell. This triggers greater calcium transients and strengthens cardiomyocyte contractions and thus cardiac output. But it is also a risk factor that promotes arrhythmias. So, by specifically increasing the expression of isoform NKA-α2 and not NKA-α1 excessive sodium elevation, functional deterioration and adverse remodeling could be limited. Presumably, NKA-α2 is the predominant isoform that regulates calcium cycling and interacts with NCX in the microdomain of the t-tubules. TG α2 mice are therefore more capable of preserving calcium homeostasis and regulating excitation contraction-coupling after chronic MI. The expression of NCX after MI is very likely increased, thus NCX helps in reverse mode to reduce calcium load in heart failure. This also protects TG α2 from hypertrophy and adverse remodeling after chronic MI, which implements better outcome in terms of deterioration of heart failure and cardiac dysfunction.

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Submitted by Marcos Anselmo (marcos.anselmo@unipampa.edu.br) on 2016-04-18T19:43:16Z No. of bitstreams: 1 Juliana Bernera Ramalho.pdf: 1079700 bytes, checksum: 8fe6895eb29d1faefd61f672d9c35b58 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-18T19:43:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Juliana Bernera Ramalho.pdf: 1079700 bytes, checksum: 8fe6895eb29d1faefd61f672d9c35b58 (MD5) Previous issue date: 2014-03-19 / O glutamato é um dos mais importantes neurotransmissores excitatórios presentes no sistema nervoso central e participa de uma variedade de processos fisiológicos, desempenhando papel importante na plasticidade sináptica, aprendizagem e memória. Seu excesso leva a uma ativação excessiva dos seus receptores, desencadeando excitação das células nervosas podendo levá-las à morte e, essa tem sido apontada como causa de diversas doenças neurodegenerativas. O glutamato monossódico (MSG) é um realçador de sabor amplamente utilizado na indústria de alimentos e, embora vários agonistas glutamatérgicos específicos possam imitar os efeitos tóxicos do glutamato, o MSG é possivelmente o agente mais comumente utilizado para caracterizar os mecanismos celulares e moleculares envolvidos na excitotoxicidade induzida pelo glutamato. Ainda, diversos estudos têm demonstrado prejuízos de aprendizagem e memória em animais expostos ao MSG. Já está estabelecido que o selênio (Se) é eficaz na prevenção de uma série de condições degenerativas, incluindo doenças inflamatórias e neurológicas e, estudos têm relatado que os compostos orgânicos de Se são capazes de melhorar a memória em roedores. O Selenofuranosídeo é um composto orgânico de Se e sua capacidade neuroprotetora foi demonstrada recentemente em um modelo de demência esporádica em camundongos. O objetivo deste trabalho foi avaliar o possível efeito protetor do selenofuranosídeo frente ao prejuízo à memória de longa duração, atividades das enzimas Na+, K+-ATPase e AChE e estresse oxidativo em ratos Wistar machos com 5 semanas de idade expostos ao MSG. O MSG (2g/kg) e o selenofuranosídeo (5 mg/kg) foram administrados por via oral durante 10 dias. Nos dias 11 e 12, os animais foram submetidos aos testes comportamentais (open-field e esquiva inibitória) e posterior eutanásia. Sangue, fígado, rim, córtex e hipocampo foram removidos para determinação dos parâmetros de estresse oxidativo e bioquímicos. Ainda, os tecidos cerebrais foram utilizados para determinar a atividade das enzimas Na+, K+-ATPase e AChE. Os resultados obtidos demonstram que a exposição ao MSG levou a uma alteração de memória, observada através da diminuição no tempo de latência no teste de esquiva inibitória, acompanhada da diminuição da atividade da Na+, K+-ATPase no hipocampo e córtex. O tratamento com selenofuranosídeo mostrou-se eficaz em proteger contra o prejuízo de memória associado à exposição ao MSG, através do aumento na latência no teste de esquiva inibitória e da atividade da enzima Na+, K+-ATPase no hipocampo. Não houve alteração nos parâmetros de estresse oxidativo avaliados e na atividade da AChE. Nossos resultados sugerem que o tratamento com selenofuranosídeo foi efetivo em melhorar a alteração de memória apresentada pelos animais expostos ao MSG e que esse composto pode ser um potencial agente terapêutico alternativo para o tratamento de doenças neurodegenerativas. / Glutamate is the major excitatory neurotransmitter present in the central nervous system. It participates in a variety of physiological processes and plays an important role in synaptic plasticity, learning and memory. Its excess leads to excessive activation of its receptors, triggering excitation of nerve cells and may lead them to death, and this has been identified as the cause of several neurodegenerative diseases. Monosodium glutamate (MSG) is a flavor enhancer widely used in the food industry and, although several specific glutamatergic agonists can mimic the toxic effects of glutamate, MSG is possibly the most commonly used agent to characterize the cellular and molecular mechanisms involved in glutamate-induced excitotoxicity. Also, several studies have shown learning and memory loss in animals exposed to MSG. It is already established that the selenium (Se) is effective in preventing a number of degenerative conditions, including inflammatory and neurological diseases, and studies have reported that organoselenium compounds are able of enhancing memory function in rodents. The Selenofuranoside is a new organoselenium compound and their neuroprotective capacity was recently demonstrated in a sporadic dementia model in mice. The aim of this study was to evaluate the possible protective effect of selenofuranoside against impairment to long-term memory, the enzymes Na+, K+-ATPase and AChE activities and oxidative stress in male Wistar rats at 5 weeks of age exposed to MSG. The MSG (2g/kg) and selenofuranoside (5mg/kg) were orally administered for 10 days. In the days 11 and 12, the animals were subjected to behavioral tests (open-field and inhibitory avoidance) and subsequent euthanasia. Blood, liver, kidney cortex and hippocampus were removed for determination of oxidative stress and biochemical parameters. Also, the brain tissues were used to determine enzymes Na+, K+-ATPase and AChE activities. The results showed that exposure to MSG led to memory loss observed by decreasing the latency time in the inhibitory avoidance test, accompanied by decreased activity of Na+, K+-ATPase in the hippocampus and cortex. Treatment with selenofuranoside proved effective in protecting against memory loss associated with exposure to MSG by increasing the latency in the inhibitory avoidance test and the enzyme activity of Na+, K+ -ATPase in the hippocampus. There was no change in the evaluated parameters of oxidative stress and the AChE activity. Our results suggest that treatment with selenofuranoside was effective in improving the memory impairment presented by animals exposed to MSG and that this compound can be a potential alternative therapeutic for the treatment of neurodegenerative diseases.

A Na,K-ATPase é uma proteína encontrada na membrana plasmática de praticamente todas as células animais, que utiliza a energia derivada da hidrólise do ATP para transportar 3 íons Na+ e 2 íons K+. É composta por duas subunidades denominadas e . Um aspecto que ainda gera controvérsias se refere à sua forma de associação nativa e funcional como um protômero ou ainda na forma de oligômeros ()2 ou ()4. Uma forma de estudar essa enzima é pela sua solubilização da membrana, e posteriormente reconstituição em lipossomos de DPPC:DPPE. A caracterização cinética e estrutural desse sistema mostra que a enzima se apresenta na forma oligomérica ()2. O objetivo desse trabalho foi avaliar os mecanismos de dissociação e de desnaturação da Na,K-ATPase solubilizada bem como da reconstituída em lipossomos de DPPC:DPPE, por agentes físicos (temperatura) e químicos (relação proteína:detergente, uso de agentes caotrópicos como a guanidina e mudanças de pH), para interpretar as suas formas de associação e regulação. Para isso, foram realizados experimentos de dicroísmo circular (CD), calorimetria (DSC), infravermelho (FTIR), fluorescência de emissão do triptofano, tensão superficial, elasticidade, atividade catalítica (ATPase e pNPPase). Os estudos de CD em função da variação de temperatura mostraram que ocorre uma transição na curva de elipticidade (222 nm) a 43,7°C para a enzima solubilizada e a 42,0°C para a enzima reconstituída em lipossomos. Estas transições foram também encontradas pela técnica de FTIR. Os experimentos por DSC para a enzima solubilizada revelaram a presença de três picos em 54,7; 64,7 e 67,8°C. Já para a enzima reconstituída observam-se transições em menores temperaturas entre 30 a 40ºC (referentes aos lipídios) e ainda a preservação do pico de transição para proteína em 68,0°C. A análise de fluorescência de triptofano para ambas formas de enzima revelou deslocamentos de pico máximo de emissão a partir de 60°C. Já a presença de guanidina mostrou dois pontos de transição em 3 e 5 mol.L-1 para a Na,K-ATPase solubilizada. O efeito de diferentes meios tamponantes revelou que a enzima apresenta maiores conteúdos em -hélice em pH 7,5, concomitante com um aumento na intensidade de emissão de fluorescência do triptofano na faixa de pH de 5,0 a 8,5. Analisando conjuntamente todas as técnicas podemos propor um mecanismo de dissociação/desnaturação da enzima em função da temperatura. Primeiramente a enzima passa do seu estado oligomérico ()2 e forma protômeros . A atividade ATPase é perdida completamente (acima de 60ºC) quando as subunidades são completamente separadas, ocorrendo então uma agregação das subunidades , através dos domínios citoplasmáticos. Finalmente, a análise da enzima em diferentes proporções de proteína:detergente revela que a Na,K-ATPase, na presença de concentrações abaixo da CMC, se encontra na forma ()2 ou ainda ()4 (dependendo da concentração de proteína). Já para concentrações acima da CMC ocorre a separação das subunidades e consequente perda de atividade catalítica. Devido à dependência da atividade ATPase com seu estado conformacional e seu estado de oligomerização, este estudo realizado por técnicas bioquímicas e biofísicas, resulta em novas informações acerca da compreensão dos mecanismos que controlam o processo de associação, o qual é importante para a função da enzima na membrana natural. / Na,K-ATPase is a protein found in the plasmatic membrane of almost all animal cells and it uses the energy from ATP hydrolysis to transport 3 Na+ ions and 2 K+ ions. It is formed by subunits called and. One controversial aspect refers to its native and functional association form as a protomer or still in ()2 or ()4 oligomers form. One way to study this protein in our laboratory is by its solubilization from membrane, and later reconstitution in liposome from DPPC:DPPE. The kinetic and structural characterization fo this system shows that the enzyme presents itself in the oligomeric form ()2. The aim of this work was to evaluate the dissociation and denaturation mechanisms of the solubilized NA,K-ATPase as well as the one reconstituted in DPPC:DPPE liposome, by physic (temperature) and chemical agents (relation protein:detergent, use of chaotropic agents as Guanidine chloride, or still by the pH changes, to interpret its association and regulation forms. To that end, experiments of circular dichroism (CD), calorimetry (DSC), superficial tension, elasticity , catalytic activity (ATPase an pNPPase) were done. The CD studies in function of temperature variation have shown that a transition occurs in the ellipticity curve (222 nm) at 43.7ºC for the solubilized enzyme and at 42.0ºC for the enzyme reconstituted in liposome. These transitions were also found by the FTIR technique. The experiments by DSC for the solubilized enzyme have shown the presence of three peaks at 54.7ºC, 64.7ºC and 67.8ºC. As for the reconstituted enzyme, transitions in lower temperatures between 30ºC and 40ºC (concerning the lipids) and also the preservation of the transition peak for the protein at 68.0ºC were observed. The Tryptophane fluorescence analysis for both enzyme forms has revealed emission maximum peak shifts starting from 60ºC. The Guaniddine presence has shown two transition points at 3 and 5 mol.L-1 for the solubilized Na,K-ATPase. The effect of different buffer media has shown that the enzyme presents higher contents in -helix at pH 7.5, concomitant with an increase of the intensity of tryptophane fluorescence emission in the pH range of 5.0 to 8.5. Analyzing all the techniques together we can propose a dissociation/denaturation mechanism in function of the temperature. First, the enzyme goes from its oligomeric ()2 state and forms protomers. The ATPase activity é totally lost ( over 60ºC) when the subunits are completely separated, when an subunits aggregation then occurs, through the cytoplasmatic domains. Finally, the analysis of the enzyme in different proportions of protein:detergent reveals that the NA,K-ATPase, in the presence of concentrations bellow CMS, is in the ()2 or yet in the ()4 form (Depending on protein concentration). Now for concentrations above CMS, the separation of the subunits occurs and consequent catalytic activity loss. Due to the ATPase activity dependence on its conformational form and oligomerization state, this study done with biophysical and biochemistry techniques, results in new information on the comprehension of the mechanisms that control the association processes, which is important to the enzyme function in the natural membrane.

Toxinas animais são moléculas aplicáveis na geração de agentes terapêuticos e/ou de ferramentas experimentais para a pesquisa básica e aplicada, justificando sua purificação e análise funcional. Considerando que estudos de venenos de sapos são relevantes, por serem estes considerados uma boa fonte de toxinas que atuam sobre diferentes sistemas biológicos, os objetivos deste trabalho foram isolar toxinas presentes no veneno de Rinella schneideri e avaliar suas ações sobre a atividade da enzima Na+K+-ATPase e os sistemas nervosos central e periférico. O veneno de Rhinella schneideri foi inicialmente submetido a diferentes extrações resultando em quatro amostras. A AMOSTRA A, que apresenta apenas componentes de baixa massa molecular, foi a mais efetiva na redução da atividade da Na+K+-ATPase e foi, portanto, liofilizada e submetida a uma cromatografia de fase reversa em sistema CLAE em coluna C2C18. Das 5 frações majoritárias obtidas nesta cromatografia apenas as Rs3, Rs4 e Rs5 induziram uma redução concentração-dependente da atividade da Na+K+-ATPase, mostrando IC50% de 33,6 g, 47,7 g e 98,92 g, respectivamente. Estes resultados indicam que o veneno de R. schneideri apresenta pelo menos três substâncias capazes de inibir a Na+K+-ATPase. As frações Rs3, Rs4 e Rs5, foram submetidas à espectrometria de massa e revelaram massas moleculares de 403, 401 e 387 Da, provavelmente correspondentes à Telocinobufagina, Desacetilcinobufagina e Bufalina, respectivamente. Estes compostos mostraram também neuroproteção central muito relevante sobre crises convulsivas induzidas por PTZ (Pentilenotetrazol) e NMDA (n-metil-d-aspartato), sendo que a Rs5 foi a que causou maior neuroproteção. No entanto, estas mesmas frações apresentaram ação neurotóxica periférica, induzindo bloqueio da junção neuromuscular de pintainhos. Manifestações como alucinações, dormência, confusão mental também são observadas em envenenamentos por sapos, que podem ser induzidos por alcalóides presentes no veneno, o que justifica os estudos para a identificação dos mesmos. Neste trabalho confirmou-se a presença de ii alcalóides no veneno. No entanto, foram priorizados os estudos com as toxinas isoladas Rs3, Rs4 e Rs5, por apresentarem ações biológicas importantes. Concluindo, neste trabalho foram isolados 3 compostos de baixa massa molecular, denominados Rs3, Rs4 e Rs5, que são capazes de inibir a atividade da Na+K+- ATPase, bloquear a transmissão do impulso nervoso na junção neuromuscular de pintainhos e, principalmente a Rs5, proteger crises convulsivas induzidas por PTZ e NMDA. Estudos adicionais serão necessários para estabelecer a correlação entre estes efeitos e determinar o mecanismo de ação destas toxinas. / Animal toxins are molecules applicable in the generation of therapeutic agents and / or experimental tools for basic and applied research, justifying its purification and functional analysis. Whereas studies of poison toads are relevant, since these are considered a good source of toxins that act on different biological systems, the objectives of this work were to isolate toxins in the venom of Rinella schneideri and evaluate their actions on the Na+K+-ATPase activity and the central and peripheral nervous systems. The venom Rhinella schneideri was initially submitted to different extractions resulting in four samples. The SAMPLE A, with only low molecular mass components, was the most effective in reducing the activity of Na+K+-ATPase and was lyophilized and subjected to reverse phase chromatography in the HPLC system in C2C18 column. Five majority fractions were obtained from this chromatography and only Rs3, Rs4 and Rs5 induced a concentration-dependent reduction in activity of Na+K+-ATPase, showing IC50% 33.6 g, 47.7 g and 98.92 g, respectively. These results indicate that R. schneideri venom presents at least three substances that can inhibit the Na+K+-ATPase. Fractions Rs3, Rs4 and Rs5 were submitted to mass spectrometry assay showing molecular masses of 403, 401and 387 Da, probably corresponding to Telocinobufagin, Desacetylcinobufagin and Bufalin, respectively. These compounds also showed a very relevant central neuroprotection on seizures induced by PTZ (Pentylenetetrazole) and NMDA (N-methyl-d-aspartate), and the Rs5 caused the highest neuroprotection. However, these same fractions showed neurotoxicity on peripheral nervous system, inducing blockade of the neuromuscular junction of chicks. Manifestations such as hallucinations, numbness, mental confusion are also seen in poisoning by toads, which can be induced by alkaloids present in the venom, which justifies the studies for their identification. This work confirmed the presence of alkaloids in the venom. However, have been prioritized the studies with isolated toxins Rs3, Rs4 and Rs5, because they have important biological actions. In conclusion, in this study were isolated three compounds with iv low molecular mass, known as Rs3, Rs4 and Rs5, which are capable of inhibiting the activity of Na+K+-ATPase, blocking the nerve impulse transmission at the neuromuscular junction of chickens, and especially the Rs5 by protecting seizures induced by PTZ and NMDA. Additional studies are necessary to establish the correlation between these effects and determine the mechanism of action of these toxins.

No presente trabalho foram estudadas a caracterização cinética e as propriedades bioquímicas da (Na+, K+)-ATPase branquial dos estágios ontogenéticos juvenil e adulto do camarão de água doce M. amazonicum. Em ambos os estágios de desenvolvimento foi expressa uma (Na+, K+)-ATPase com peso molecular de 105 kDa. A estimulação da atividade (Na+, K+)-ATPase de animais adultos pelo ATP apresentou comportamento michaeliano (V=181,8±77,83 U mg-1; KM=0,11±0,01 mmol L-1). Entretanto a estimulação da atividade (Na+, K+)-ATPase pelo Mg2+ (V=174,7±74,76 U mg-1; K0,5=0,27±0,05 mmol L-1; n= 2,5), Na+ (V=175,5±75,12 U mg-1; K0,5=4,73±0,81 mmol L-1; n= 1,9), K+ (V=171,2±73,28 U mg-1; K0,5=1,00±0,17 mmol L-1; n=1,2) e NH4+ (V=194,2±63,34 U mg-1; K0,5= 4,76±2,15 mmol L-1; n=1,9) ocorreu segundo cinética cooperativa. Nos animais juvenis, a modulação da atividade (Na+, K+)-ATPase pelo ATP, também apresentou comportamento michaeliano (V=189,52±32,45 U mg-1; KM= 0,14±0,02 mmol L-1). O mesmo foi observado para o K+ (V=178,56±30,58 U mg-1; KM= 1,30±0,22 mmol L-1) e o NH4+ (V=205,91±35,26 U mg-1; KM=1,88±0,32 mmol L-1). Para o Mg2+ (V=168,35±28,83 U mg-1; K0,5=0,51±0,09 mmol L-1; n=3,5) e o Na+ (V=165,48±28,33 U mg-1; K0,5=4,92±0,84 mmol L-1; n=1,3), a estimulação da enzima ocorreu através de interações sítio-sítio. Na presença de K+ e NH4+ a atividade da enzima de animais adultos, foi estimulada 30% e o K0,5 aumentou 3 vezes. Já os animais juvenis, apresentaram um aumento de 12% na velocidade máxima e o K0,5 aumentou 2 vezes. Na presença de K+ a atividade ATPase total dos animais adultos foi inibida 62% pela ouabaína com Ki=114±2,41 µmol L-1. Já para os animais juvenis, a inibição foi da ordem de 87% com Ki=91,22±15,62 µmol L-1. Na presença de NH4+ a inibição pela ouabaína da atividade ATPase total dos animais adultos foi da ordem de 70% com Ki=57,95±17,04 µmol L-1 enquanto para os juvenis a inibição foi da ordem de 85% com Ki=53,98±9,24 µmol L-1. / In the present work the kinetic characterization and biochemical properties of the (Na+, K+)-ATPase gill in ontogenetic stages of juvenile and adult freshwater prawn M. amazonicum was studied. In both stages of development the (Na+, K+)-ATPase was expressed as a molecular weight of 105 kDa. The stimulation of activity (Na+, K+)-ATPase by ATP in adult animals showed a michaeliano comportament (V=181.8±77.83 U mg-1, KM=0.11±0.01 mmol L -1). However the stimulation of activity (Na+, K+)-ATPase by Mg2 + (V=174.7±74.76 U mg-1, K0,5 =0.27±0.05 mmol L-1, n=2.5 ), Na+ (V=175.5±75.12 U mg-1, K0,5=4.73±0.81 mmol L-1, n=1.9), K+ (V =171.2±73,28 U mg-1, K0,5=1.00±0.17 mmol L-1, n=1,2) and NH4+ (V=194.2±63.34 U mg-1, K0,5=4, 76±2.15 mmol L-1, n=1.9) ocorred second cooperative kinetics. In juvenile animals, modulation of the activity (Na+, K+)-ATPase by ATP, exhibited behavior michaeliano (V=189.52±32.45 U mg-1, KM=0.14±0.02 mmol L-1). The same was observed for K+ (V=178.56±30.58 U mg-1, KM=1.30±0.22 mmol L-1) and NH4+ (V=205.91±35.26 U mg -1, KM=1.88±0.32 mmol L-1). For Mg2 + (V=168.35±28.83 U mg-1, K0,5=0.51 ± 0.09 mmol L-1, n=3.5) and Na+ (V=65.48±28 mmol L-1, 33 U mg-1, K0,5=4.92±0.84 mmol L-1, n=1.3), stimulation of the enzyme occurred through site-site interactions. In the presence of K+ and NH4+ the enzyme activity of adult animals, was stimulated 30% and K0,5 increased by 3 times. Already the young animals showed a 12% increase in speed and K0,5 increased by 2 times. In the presence of K+ ATPase activity of the total adult animals was inhibited 62% by ouabain with Ki=114±2.41 mmol L-1. As for the juvenile animals, the inhibition was approximately 87% with Ki=1.22±15.62 mmol L-1. In the presence of NH4+ by ouabain inhibition of total ATPase activity of adult animals was about 70% with Ki=57.95±17.04 mmol L-1 while for juveniles the inhibition was approximately 85% with Ki=53.98 ± 9.24 mmol L-1.

A (Na+,K+)-ATPase presente no tecido branquial dos crustáceos osmorreguladores é um componente essencial de seu sistema de regulação iônica e osmótica. Esta enzima também apresenta um papel relevante no processo de excreção ativa de NH4+ através do tecido branquial dos crustáceos. Uma fração microsomal rica em (Na+, K+)ATPase foi preparada por centrifugação diferencial a partir de um homogeneizado do tecido branquial de Callinectes ornatus. A centrifugação em gradiente de sacarose revelou a presença de um unico pico de proteina com atividade ATPase, mas a eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes revelou a presença de várias bandas protéicas. O uso do anticorpo monoclonal 5 contra a subunidade da (Na+, K+) ATPase, revelou a presença de uma única banda proteica de 110 kDa com atividade (Na+, K+)?ATPase. A (Na+, K+) ATPase hidrolisou o PNPP (V= 52,0 ± 2,0 U/mg e K0,5 = 1,1 ± 0,1 mM) através de interações sítio-sítio (nH= 1,6). A modulação da enzima pelos íons magnésio (V= 52,3 ± 1,3 U/mg e K0,5 = 1,1 ± 0,05 mM), potássio (V= 51,4 ± 1,5 U/mg e K0,5 = 2,3 ± 0,1 mM) e amônio (V= 56,7 ± 2,6 U/mg e K0,5 = 9,8 ± 0,4 mM) ocorreu através de interações sítio-sítio. Os íons sódio atuaram como inibidores da atividade K+-fosfatase da enzima (Ki= 1,7 ± 0,1 mM) e a ouabaína inibiu cerca de 80% a atividade PNPPase independentemente da presença de íons amônio. A (Na+, K+) ATPase hidrolisou o ATP de acordo com cinética de Michelis-Menten, com KM= 0,16 0,01 mM e V= 116,3 5,6 U/mg, enquanto a modulação da atividade da enzima pelos íons magnésio (V= 111,0 ± 5,4 U/mg e K0,5= 0,54 ± 0,03 mM), sódio (V= 110,6 ± 5,3 U/mg e K0,5= 6,3 ± 0,3 mM), potássio (V= 116,0 ± 5,5 U/mg e K0,5= 1,5 ± 0,1 mM) e amônio (V= 173,3 ± 5,4 U/mg e K0,5= 5,4 ± 0,3 mM) ocorreram através de interações sítio-sítio. Também foi observado que na presença de concentrações crescentes de ions amonio, a estimulação da atividade (Na+,K+)-ATPase pelo íons potássio acarretou um aumento de 50% na atividade específica da enzima. A ouabaína inibiu cerca de 86% a atividade (Na+,K+)-ATPase com Ki= 74,5 ?M, sugerindo a presença de 14% de fosfatases e/ou outras ATPase contaminantes. Este é o primeiro trabalho onde se observa uma estimulação sinergística da atividade K-fosfatase da (Na+,K+)-ATPase de crustáceo pelos íons potássio e amônio. Os resultados cinéticos obtidos para a (Na+,K+)-ATPase branquial de Callinectes ornatus, analisados em conjunto com os já descritos para outras espécies de crustáceos poderão abrir novas perspectivas em relação ao papel dessa enzima na adaptação fisiológica-bioquímica, bem como para a sobrevivência desses animais em diferentes ambientes. / (Na+, K+)-ATPase present on branchial tissue osmoregulatory crustaceans is an essential component of their osmotic and ionic regulation system. Apparently, this enzyme also have a relevant role in the active excretion de NH4+ through the branchial crustacean tissue. A (Na+, K+) ATPase-rich microsomal fraction was prepared by differential centrifugation from Callinectes ornatus homogenized branchial tissue. The sucrose gradient sucrose centrifugation showed the presence of a single protein peak with ATPase activity, and SDS-PAGE revealed the presence of several proteins bands. The use of the 5 monoclonal antibody, against the ? subunit, revealed the presence of a unique protein band of 110 kDa corresponding to the (Na+, K+) ATPase. (Na+, K+) ATPase hydrolyzed the PNPP (V= 52.0 2.0 U/mg and K0.5= 1.1 0.1 mM) through the site-site interactions (nH= 1.6). The modulation of (Na+, K+) ATPase by magnesium (V= 52.3 1.3 U/mg and K0.5= 1.1 ? 0.05 mM), potassium (V= 51.4 1.5 U/mg and K0.5= 2.3 0.1 mM) and ammonia ions (V= 56.7 2.7 U/mg and K0.5= 9.8 ? 0.4 mM) followed cooperative kinetics. However, sodium ions inhibited PNPPase activity of (Na+, K+)?ATPase with Ki= 1.7 0.1 mM. Ouabain also inhibited up to 80% the total activity PNPPase independent of the presence of ammonium ions. The hydrolysis of ATP by (Na+, K+) ATPase followed Michaelis-Menten kinetics with Km= 0.16 0.01 mM and V= 116.3 5.6 U/mg, while enzyme modulation by magnesium (V= 111.0 5.4 U/mg and K0.5= 0.54 0.03 mM), sodium (V= 110.6 5.3 U/mg and K0.5= 6.3 0.3 mM), potassium (V= 116.0 5.5 U/mg and K0.5= 1.5 ? 0.1 mM) and ammonium ions (V= 173.3 . Interestingly, the stimulation of (Na+, K+)-ATPase activity by potassium ions in the presence of increasing concentration of ammonium ions to K+ resulted in a 50% higher specific activity. Ouabain inhibited approximately 86% the activity (Na+, K+) ATPase with (Ki= 74.5 M), suggesting the presence of about 14% of phosphatases and/or other ATPases. This is the first work showing synergistic stimulation of crustacean (Na+, K+) ATPase by potassium and ammonium ions when PNPP is used a substrate. The results reported herein for Callinectes ornatus branchial (Na+, K+) ATPase might open new perspectives concerning the physiological adaption and the survival of these animals in different environmental.

A Na, K-ATPase (NKA) é uma proteína de membrana encontrada em organismos eucariotos multicelulares cuja atividade e funções já são amplamente discutidas na literatura. Sua unidade funcional corresponde a um heterodímero formado por duas subunidades , com regiões transmembrana. Espécies multiméricas como dímeros e tetrâmeros dessa enzima também são conhecidos por exercer atividade enzimática. As interações lipídio-proteína são intrínsecas para a NKA, por tal motivo, proteolipossomos constituídos de DPPC e DPPC:DPPE foram preparados por co-solubilização. Como controle, lipossomos de mesma composição foram produzidos por extrusão e/ou sonicação. Para as imagens de AFM, as amostras foram fixadas com glutaraldeído, para proteção mecânica e contra desidratação das vesículas. Para lipossomos de DPPC as imagens topográficas de AFM das vesículas apresentaram formato oval, superfície perfeitamente lisa e diâmetro médio de 151 + 46 nm, enquanto as vesículas de composição DPPC:DPPE, apesar de lisas, tiveram cantos pontiagudos e diâmetro médio de 98 + 28 nm. Imagens de fase de ambas as composições não apresentaram qualquer indicativo de diferenças na composição química, provavelmente devido à natureza de carga neutra dos dois fosfolipídios. As imagens de fase por AFM para os proteolipossomos tanto de DPPC-NKA, quanto DPPC:DPPE-NKA, revelaram resultados inéditos na literatura, onde a inserção da NKA aparece como nítidas regiões transições de fase de composição química distinta quando comparadas com os lipossomos. No entanto, as mudanças de fase são diferentes entre as composições estudadas, aparecendo como manchas escuras circulares para DPPC-NKA e mais visíveis como interstícios brilhantes para composição de DPPC:DPPE-NKA. As vesículas de DPPC-NKA apresentaram diâmetro médio de 390 + 326 nm e, nas imagens de topografia tridimensionais, protusões de 38 a 115 nm correspondentes às regiões de mudanças de fase, que, indicaram o diâmetro dos microdomínios relacionados à proteína. Já nas imagens para DPPC:DPPE-NKA o diâmetro médio dos proteolipossomos foi de 189 + 156 nm, e as protusões apareceram entre os interstícios, variando de 20 a 66 nm. O estudo de DSC dos lipossomos revelou que a concentração de glutaraldeído nas condições das análises de AFM, em torno de 5% (v/v), afetam as características físico-químicas para as composições com DPPE. A AFM foi eficiente para confirmar a reinserção da NKA em proteolipossomos pelas imagens de fase, e, para medir o diâmetro dos microdomínios pelas imagens de topografia. / Na, K-ATPase (NKA) is a membrane protein present in eukaryotic multicellular organisms. Its functions and activity are already widely described in the literature. Its minimal functional structure is a heterodimer of two main subunits , with transmembrane domains. However, dimers and tetramers of the enzyme are also known to have enzymatic activity. Since there are intrinsic lipid-protein interactions, NKA proteoliposomes composed of DPPC and DPPC:DPPE (1:1 molar ratio) were prepared by the co-solubilization method and liposomes of the same compositions were obtained by extrusion and/or sonication to be used as control. The samples to the AFM study were prepared using glutaraldehyde to protect the vesicles from mechanical shocks and dehydration. Liposomes composed of DPPC and DPPC:DPPE (1:1 molar ratio) were prepared by extrusion and sonication, respectively, as control. The topographical images for DPPC liposomes showed vesicles with an oval shape and smoothed surfaces with a mean diameter of 151 + 46 nm. DPPC:DPPE vesicles also presented smoothed surfaces, but with pointed corners and mean diameter of 98 + 28 nm. Phase images for both lipid compositions showed no differences in chemical composition. For DPPC:DPPE samples, this can be explained by the neutral net charge of both lipids. The proteoliposomes observed in the AFM phase images showed darker and large circular spots in the vesicles. These spots represent delays in the phase oscillation of the AFM probe and are associated with different chemical composition. The phase changes showed the reconstitution of the NKA in the proteoliposomes. When compared with topographical images, this spots matched protrusions. The mean diameter of DPPC-NKA proteoliposomes determined by AFM was 390 + 326 nm. In the three-dimensional topographical images of composition, protrusions from 38 to 115 nm near the areas of different phases indicate the diameters of the NKA microdomains. The phase changes for DPPC:DPPE-NKA appeared as bright interstices with the protrusions of the topographical images in between them. The size of these protrusions ranged from 20 to 66 nm and the mean diameter of the proteoliposomes was 189 + 156 nm. The DSC liposomes data showed that the glutaraldehyde concentration used in the AFM analysis affect the physical chemistry properties of the samples with DPPE. AFM proved to be an efficient method to confirm the reconstitution of into proteoliposomes with phase images and to determine the diameter of the protein microdomains with the topographical images.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Creatine, an endogenous guanidino compound produced on liver, kidneys, pancreas, testes and brain, has been aim of several studies over the last years. Although most studies attribute the effects of creatine to their energetic buffer role, recent findings have suggested actions non-related to energy metabolism. Researches have shown that this compound may act as a neuromodulator in the central nervous system (CNS). Among these neuromodulatory actions, was demonstrated that creatine modulates NMDA receptors in rat hippocampal slices. It is well know that stimulation of these receptors activates Na+,K+-ATPase. Moreover, little is known about the acute role of this compound on CNS. Thus, the objective of the chapter I of this paper was to investigate the effect of creatine on Na+,K+-ATPase activity and the intracellular signaling pathway involved. The results showed that creatine treatment of rat hippocampal slices increased Na+,K+-ATPase α2/3 activity in vitro. The intracerebroventricular administration of this compound also increased the enzyme activity, ex vivo. Furthermore, creatinine and phosphocreatine treatment of hippocampal slices did not alter the enzyme activity, suggesting that the creatine mechanism of action is independent of energy metabolism. Additionally, we showed the involvement of NMDA-NR2B and calcineurin. We found also the involvement of the PKA and PKC in the effect of creatine on Na+,K+-ATPase activity. In the second chapter of this study, we decide to verify the effect of acute creatine administration on PTZ-induced seizures, since this convulsant agent inhibits Na+,K+-ATPase activity without alter bioenergetic cellular state. We found that creatine treatment protected against behavioral and electroencephalographic seizures induced by PTZ. Moreover, creatine acute treatment prevented PTZ-induced inhibition of Na+,K+-ATPase activity. Based on present findings, we suggest that creatine may act through an alternative mechanism, independent of energetic metabolism, by modulation of Na+,K+-ATPase activity. / A creatina, um composto guanidínico endógeno, sintetizado pelos rins, fígado, pâncreas, testículos e cérebro, tem sido alvo de diversos estudos ao longo dos últimos anos. Apesar da grande maioria dos estudos atribuírem os efeitos da creatina ao seu papel de tamponamento de energia, recentes achados têm proposto ações não relacionadas ao metabolismo energético. Estudos têm demonstrado que este composto pode agir como neuromodulador no Sistema Nervoso Central (SNC). Dentre estas ações neuromodulatórias, demonstrou-se que a creatina pode modular os receptores do subtipo N-metil- D-aspartato (NMDA) em fatias de hipocampo de ratos. É bem descrito na literatura que a estimulação destes receptores ativa a enzima Na+,K+-ATPase. Além disso, pouco se sabe sobre o papel agudo deste composto no SNC. Desta forma, o objetivo do capítulo I deste estudo foi verificar o efeito da creatina sobre a atividade da enzima Na+,K+-ATPase, bem como sua provável via de sinalização intracelular. Os resultados demonstraram que a incubação de fatias de hipocampo de ratos, com creatina, aumentou a atividade da enzima Na+,K+-ATPase α2/3 in vitro e, que a injeção intracerebroventrical (i.c.v) deste composto, aumentou a atividade da enzima ex vivo. Verificou-se também que o tratamento das fatias hipocampais com fosfocreatina e creatinina não alterou a atividade enzimática, sugerindo que o mecanismo de ação da creatina é independente do metabolismo energético. Além disso, foi evidenciada a participação dos receptores NMDA-NR2B, bem como a ativação da enzima calcineurina. Nós constatamos também o envolvimento das enzimas proteína quinase dependente de AMPc (PKA) e da proteína quinase C (PKC) no efeito da creatina sobre a atividade da enzima Na+,K+-ATPase. No segundo capítulo deste estudo, decidimos verificar o efeito da administração aguda de creatina sobre as convulsões induzidas por pentilenotetrazol (PTZ), uma vez que este agente quimioconvulsivante inibe a enzima Na+,K+-ATPase sem alterar o status bioenergético celular. Constatamos que a creatina protegeu contra as convulsões comportamentais e eletroencefalográficas induzidas por PTZ. Além disso, o tratamento agudo com creatina preveniu a inibição da atividade da enzima Na+,K+-ATPase induzida por PTZ. Com base nestas evidências, sugerimos que este composto guanidínico pode estar atuando através de um mecanismo alternativo, não dependente do metabolismo energético, através da modulação da atividade da enzima Na+,K+-ATPase.

No presente trabalho foram estudadas a caracterização cinética e as propriedades bioquímicas da (Na+, K+)-ATPase branquial dos estágios ontogenéticos juvenil e adulto do camarão de água doce M. amazonicum. Em ambos os estágios de desenvolvimento foi expressa uma (Na+, K+)-ATPase com peso molecular de 105 kDa. A estimulação da atividade (Na+, K+)-ATPase de animais adultos pelo ATP apresentou comportamento michaeliano (V=181,8±77,83 U mg-1; KM=0,11±0,01 mmol L-1). Entretanto a estimulação da atividade (Na+, K+)-ATPase pelo Mg2+ (V=174,7±74,76 U mg-1; K0,5=0,27±0,05 mmol L-1; n= 2,5), Na+ (V=175,5±75,12 U mg-1; K0,5=4,73±0,81 mmol L-1; n= 1,9), K+ (V=171,2±73,28 U mg-1; K0,5=1,00±0,17 mmol L-1; n=1,2) e NH4+ (V=194,2±63,34 U mg-1; K0,5= 4,76±2,15 mmol L-1; n=1,9) ocorreu segundo cinética cooperativa. Nos animais juvenis, a modulação da atividade (Na+, K+)-ATPase pelo ATP, também apresentou comportamento michaeliano (V=189,52±32,45 U mg-1; KM= 0,14±0,02 mmol L-1). O mesmo foi observado para o K+ (V=178,56±30,58 U mg-1; KM= 1,30±0,22 mmol L-1) e o NH4+ (V=205,91±35,26 U mg-1; KM=1,88±0,32 mmol L-1). Para o Mg2+ (V=168,35±28,83 U mg-1; K0,5=0,51±0,09 mmol L-1; n=3,5) e o Na+ (V=165,48±28,33 U mg-1; K0,5=4,92±0,84 mmol L-1; n=1,3), a estimulação da enzima ocorreu através de interações sítio-sítio. Na presença de K+ e NH4+ a atividade da enzima de animais adultos, foi estimulada 30% e o K0,5 aumentou 3 vezes. Já os animais juvenis, apresentaram um aumento de 12% na velocidade máxima e o K0,5 aumentou 2 vezes. Na presença de K+ a atividade ATPase total dos animais adultos foi inibida 62% pela ouabaína com Ki=114±2,41 µmol L-1. Já para os animais juvenis, a inibição foi da ordem de 87% com Ki=91,22±15,62 µmol L-1. Na presença de NH4+ a inibição pela ouabaína da atividade ATPase total dos animais adultos foi da ordem de 70% com Ki=57,95±17,04 µmol L-1 enquanto para os juvenis a inibição foi da ordem de 85% com Ki=53,98±9,24 µmol L-1. / In the present work the kinetic characterization and biochemical properties of the (Na+, K+)-ATPase gill in ontogenetic stages of juvenile and adult freshwater prawn M. amazonicum was studied. In both stages of development the (Na+, K+)-ATPase was expressed as a molecular weight of 105 kDa. The stimulation of activity (Na+, K+)-ATPase by ATP in adult animals showed a michaeliano comportament (V=181.8±77.83 U mg-1, KM=0.11±0.01 mmol L -1). However the stimulation of activity (Na+, K+)-ATPase by Mg2 + (V=174.7±74.76 U mg-1, K0,5 =0.27±0.05 mmol L-1, n=2.5 ), Na+ (V=175.5±75.12 U mg-1, K0,5=4.73±0.81 mmol L-1, n=1.9), K+ (V =171.2±73,28 U mg-1, K0,5=1.00±0.17 mmol L-1, n=1,2) and NH4+ (V=194.2±63.34 U mg-1, K0,5=4, 76±2.15 mmol L-1, n=1.9) ocorred second cooperative kinetics. In juvenile animals, modulation of the activity (Na+, K+)-ATPase by ATP, exhibited behavior michaeliano (V=189.52±32.45 U mg-1, KM=0.14±0.02 mmol L-1). The same was observed for K+ (V=178.56±30.58 U mg-1, KM=1.30±0.22 mmol L-1) and NH4+ (V=205.91±35.26 U mg -1, KM=1.88±0.32 mmol L-1). For Mg2 + (V=168.35±28.83 U mg-1, K0,5=0.51 ± 0.09 mmol L-1, n=3.5) and Na+ (V=65.48±28 mmol L-1, 33 U mg-1, K0,5=4.92±0.84 mmol L-1, n=1.3), stimulation of the enzyme occurred through site-site interactions. In the presence of K+ and NH4+ the enzyme activity of adult animals, was stimulated 30% and K0,5 increased by 3 times. Already the young animals showed a 12% increase in speed and K0,5 increased by 2 times. In the presence of K+ ATPase activity of the total adult animals was inhibited 62% by ouabain with Ki=114±2.41 mmol L-1. As for the juvenile animals, the inhibition was approximately 87% with Ki=1.22±15.62 mmol L-1. In the presence of NH4+ by ouabain inhibition of total ATPase activity of adult animals was about 70% with Ki=57.95±17.04 mmol L-1 while for juveniles the inhibition was approximately 85% with Ki=53.98 ± 9.24 mmol L-1.