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Avaliação da atividade antileucêmica in vitro e toxicológica in vivo do composto LQFM-018 / Evaluation of in vitro anti-leukemic and in vivo toxicologic activity of LQFM-018 lead compoundCosta, Fabiana Bettanin 31 August 2011 (has links)
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Previous issue date: 2011-08-31 / Cancer is a serious public health problem not only in Brazil but worldwide. Among the various types of cancer known, leukemia is a one of high incidence. In this context, our study aimed to verify the citotoxicity of the compound LQFM-018, in leukemic cells. Both the method of trypan blue exclusion as in the MTT, it was observed a concentration and time dependent response after treatment with the compound LQFM-018. The cell death mechanism was assessed by flow cytometry. The cell cycle analysis showed a decrease of cells in G1 phase with a consequent increase in S phase and G2 / M. The cell death mechanism detected by annexin-V test showed that the K-562 cells were mainly in necrosis. The increased release of LDH also corroborated with the necrotic process. In the treated cells, there was not a significant expression of tumor suppressor protein p-53. The expression of nuclear factor кB increased and decreased expression of ROS. It was also found an increased expression of TNF-R1 receptor, cytochrome-c, decreased ΔΨm and not the expression of proteins Bax and Bcl-2. Acute oral toxicity test was done in vivo. According to the results, the compound LQFM-018 was classified as category 5. The statistical analysis was done using Student t test and ANOVA followed or not by Bonferroni post-test. Was considered statistically significant p<0.05. From these results, we found that the compound LQFM-018 presents potential antitumor activity, but other tests are needed to confirm these results. / O câncer consiste em um grave problema de saúde pública, não só no Brasil, mas em todo mundo. Dentre os diversos tipos de câncer conhecidos, temos a leucemia, um tipo de neoplasia que vêm apresentando alta incidência. Neste contexto, nossos estudos objetivaram avaliar a atividade antitumoral do composto LQFM-018, em linhagem leucêmica. A investigação do potencial citotóxico foi realizada usando dois métodos in vitro: o MTT e o método de exclusão do azul de tripano. Tanto no método de exclusão do azul de tripano como no MTT, foi observado uma resposta concentração e tempo dependente após tratamento com o composto LQFM-018. Também foi avaliado o mecanismo de morte celular por citometria de fluxo. A análise do ciclo celular mostrou uma diminuição de células na fase G1 com consequente aumento na fase S e G2/M. A avaliação do mecanismo de morte celular pelo teste de anexina-V mostrou que as células K-562 encontram-se principalmente em necrose. O aumento de LDH liberado também corrobora com o processo necrótico. Nas células tratadas, não foi encontrada expressão significativa da proteína supressora de tumor p-53. Já a expressão do fator nuclear кB mostrou-se aumentada. Foi também encontrado um aumento na expressão do receptor TNF-R1, do citocromo-c, diminuição do ΔΨm e do ROS e não expressão das proteínas Bax e BcL-2. Como ensaio de segurança in vivo foi feito o teste de toxicidade oral aguda. Nesse ensaio, a substância teste foi classificada como pertencente à categoria 5. A estatística foi feita usando teste t e ANOVA seguido ou não do pós-teste de Bonferroni. Foi considerado estatisticamente significativo p<0,05. A partir desses resultados, observamos que a molécula LQFM-018 apresenta potencial antitumoral, porém outros ensaios são necessários para confirmação desses resultados.
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Avaliação da atividade citotóxica e indutora de apoptose da grandisina em células leucêmicas K-562 com fenótipo de resistência a fármacosMenezes, Elizabeth Gomes Paulino 03 November 2009 (has links)
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Previous issue date: 2009-11-03 / In this study the antileukemic potential of grandisin, a neolignan extracted from Piper solmsianum, was investigated against K-562 lymphocytic genealogy, which demonstrates a phenotype of resistance to new drugs. The cytotoxicity of grandisin (0.018 to 2.365 μMol) was evaluated in K-562 and in normal peripheral blood lymphocytes by using Blue of Trypan and MTT({[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium] bromide}) methods. In the cytotoxic activity research about grandisin on K-562 cells and lymphocytes during 24 hours by the Blue of Trypan method, the grandisin got IC50 (inhibitory concentration to fifty percent) of 1.075 and 0.375 μMol to lymphocytes and K-562, respectively. After 48 hours, the cytotoxicity in normal cells remained themselves and we noticed there was an increase in IC50 leukemic cells of 0.198 μMol and 0.200 μMol in K-562 and lymphocytes, respectively. For the MTT test, results were similar to those found during the previous experiment (IC50K-562 11,98 μMol IC50lymphocytes 0,425 μMol for a period of 24 hours and IC50K-562 0,685 IC50lymphocytes 0,851 μMol for a period of 48 hours). The research about cell death mechanisms showed the treatment in K-562 cells joined to 0.036 μMol of grandisin during 24 hours, induces to an increase of cells population in G1 stage of cell cycle and it also induces to a decline of cells population in G2 stage and S, respectively. These factors also indicate that the grandisin was induced to a cell cycle standstill in G1 stage, which is proportionated to the most antileukemic agents existing. Cell death with apoptosis signs was showed by the research about these cells morphology. Moreover, the treatment of leukemic cells with 0.072, 0.036, 0.018 μMol of grandisin during 24 hours has promoted exposure of annexin V, wich is a first indicator of apoptosis. In these cells, the activity research of 3, 6 and 9 caspases and cell death mediators Bcl2 and Bax showed that cell death happens in dependent-caspase way and with balance induction between Bcl2 and Bax. Collectively, these results introduce a new model able to induce apoptosis in a leukemic cell genealogy with important features of resistance to the process of programmed cell death. / Neste estudo, o potencial antileucêmico da grandisina, uma neolignana extraída de Piper solmsianum, foi investigado contra a linhagem leucêmica K-562, a qual apresenta fenótipo de resistência a fármacos. A citotoxicidade da grandisina (0,018 – 2,365 μMol) foi avaliada em K-562 e em linfócitos do sangue periférico normal utilizando os métodos de Azul de Tripano e MTT({brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolio]}). Na investigação da atividade citotóxica da grandisina sobre células K-562 e linfócitos por 24 horas pelo método azul de tripano, a grandisina apresentou IC50 (concentração inibitória para cinqüenta porcento) de 1,075 μMol e 0,375 μMol para linfócitos e K-562, respectivamente. Após 48 horas a citotoxicidade para as células normais se manteve e observamos aumento para as células leucêmicas IC50 0,198 μMol e 0,200 μMol para K-562 e linfócitos, respectivamente. Para o teste de MTT os resultados foram semelhantes aos encontrados no ensaio anterior (IC50K-562 11,98 μMol IC50linfócitos 0,425 μMol para 24 horas e IC50K-562 0,685 μMol IC50linfócitos 0,851 μMol para 48 horas ). A investigação dos mecanismos de morte celular demonstrou que o tratamento das células K-562 com 0,036 μMol de grandisina por 24 horas induz ao aumento da população de células em fase G1 do ciclo celular e uma diminuição da população de células em fase G2 e S, respectivamente, indicando que a grandisina induziu parada do ciclo celular em fase G1, o que condiz com a maioria dos antileucêmicos existentes. A investigação da morfologia destas células indicou morte celular com sinais de apoptose. Além disto, o tratamento das células leucêmicas com 0,072, 0,036, 0, 018 μMol de grandisina por 24 horas promoveu a externalização da anexina V, um indicador primário de apoptose. Nestas células, a investigação da atividade das caspases 6, 8 e 9 e dos mediadores do processo de morte celular Bcl2 e Bax demonstrou que a morte celular ocorre via caspase-dependente e com indução de modulação entre Bcl2 e Bax. Coletivamente estes resultados introduzem um novo modelo capaz de induzir apoptose em uma linhagem celular leucêmica com importantes características de resistência ao processo de morte celular programada.
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Avaliação da expressão de genes de resistência às múltiplas drogas (MDRs) e de metabolização em diferentes linhagens celulares tratadas com complexos metálicos de rutênio / Expression of multiple drug resistance gene (MDR) on different cell lines treated with ruthenium (III) complexesCosta, Cesar Augusto Sam Tiago Vilanova 21 February 2013 (has links)
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Previous issue date: 2013-02-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Não consta resumo em outro idioma. / Foi com a descoberta da atividade antimitótica da cisplatina por Rosenberg na década se
1960 e 70, em seu célebre estudo com bactérias Escherichia coli, que surgiu o interesse em
sintetizar e entender as bases moleculares responsáveis pelo mecanismo de ação biológica dos
compostos metálicos, visto que a própria cisplatina foi inicialmente sintetizada por Peyrone nos
idos de 1840.
Os primeiros estudos envolvendo o uso de complexos metálicos de rutênio como agentes
antitumorais foram realizados por Tochter no final dos anos 1980 (Dale et al., 1992). Àquela
época, foi inferido que todos os compostos de rutênio apresentavam como mecanismo de ação, a
sua ligação com o DNA, formando adutos e desencadeando processos celulares de natureza
deletéria que, por fim, levariam a morte celular. É interessante lembrar que esse é o mesmo
mecanismo de ação dos compostos de platina mais aceitos nos dias atuais.
Sadler e Dyson (2003) estudando compostos de rutênio que continham cloro em sua
estrutura, como o cloreto de cis-(dicloro)tetraaminorutênio(III) [cis-[RuCl2(NH3)4]Cl],
observaram que estes compostos apresentavam mecanismos de ação biológica muito parecidos
com os apresentados pela cisplatina [Pt(NH3)2Cl2], onde a hidrólise da ligação Ru–Cl pode ser
fortemente influenciada pela natureza dos coligantes presentes na estrutura do rutenato, como
grupamentos amino ou até mesmo pela presença de átomos de carbono. A alta concentração de
cloretos no sangue permite a esses compostos metálicos, levados por proteínas séricas, chegar até
as células e atravessar sua membrana celular e nuclear. Uma vez no interior do núcleo, a ligação
Ru–Cl é hidrolisada, devido a queda abrupta da concentração de cloretos (que é cerca de 25
vezes menor), levando o composto a se ligar ao DNA, mais especificamente à posição N7 da
base nitrogenada guanina.
Por outro lado, compostos que não possuem cloro em sua estrutura, parecem apresentar
mecanismos de ação diferentes ao padrão "ligação ao DNA". Sabe-se que compostos que
apresentam carboxilatos em sua molécula, como a carboplatina, oxaliplatina e o próprio ditionato
de cis-tetraammino(oxalato)rutênio(III) [Cis-[Ru(C2O2)(NH3)4]2(S2O6)], uma vez no interior das
células, são hidrolisados muito mais lentamente do que os compostos ricos em cloretos, o que
leva a um acúmulo desses compostos no citoplasma, diminuindo sua migração até o núcleo e,
assim reduzindo a sua capacidade de se ligar ao DNA.
Mas se o DNA não é o alvo desses compostos, então, quem poderia ser?
Essa pergunta está sendo respondida com recentes estudos, que revelaram a interação
desses compostos, ricos em carboxilatos, com uma miríade de proteínas e enzimas, que vão
desde catepsinas, chegando até mesmo à Pgp (Melchart & Sadler, 2008).
Estudos realizados por Dyson e colaboradores (2007), utilizando alguns inibidores da
proteína Pgp, como fenoxazinas e antracenos, coordenados com compostos de rutênio,
observaram que estes novos complexos não somente inibiram a ação da enzima, como também
induziram morte celular, demonstrando uma multifuncionalidade. Seguindo essa linha de
pensamento, acreditamos que a capacidade do composto ditionato de cistetraammino(oxalato)rutênio(III)
em induzir apoptose nas células tumorais, assim como os
baixos níveis de expressão de Pgp apresentados pelas células tratadas, corroboram os resultados
previamente observados por outros grupos, utilizando compostos de rutênio similares.
A resistência a fármacos mediada por Pgp é o mecanismo de MDR mais estudado
atualmente. Apesar do desenvolvimento de novos agentes antitumorais, a MDR mediada pela
Pgp protege as células de possíveis agentes citotóxicos, limitando a eficácia dos tratamentos
quimioterápicos em pacientes com câncer. Atualmente, a extensa maioria dos inibidores da Pgp
disponíveis estão associados a vários inconvenientes, que limitam o seu uso no
reestabelecimento da eficácia da quimioterapia antineoplásica, após o aparecimento do fenótipo
MDR. A procura de inibidores de Pgp alternativos, com um processo sintético exequível e
efeitos secundários reduzidos, continua a ser um desafio para os químicos, farmacêuticos e
pesquisadores. É nesse contexto que estão sendo desenvolvidos e estudados novos agentes
antitumorais que possam agir como inibidores de Pgp, apresentando um efeito dual, ou até
mesmo multifuncional, no tratamento clínico das neoplasias malignas.
Muito tem se discutido que a próxima geração de fármacos antitumorais poderá ser
formada por substâncias que se ligam a mais do que um único alvo terapêutico, o que poderia
acelerar tratamento contra a doença, reduzindo o número e a concentração de fármacos que
deveriam ser administrados, como os coquetéis atualmente utilizados, e até mesmo aumentando a
adesão ao tratamento por parte do paciente.
No presente trabalho, estudamos dois complexos de rutênio, o cloreto e o ditionato de
rutênio(III), que se apresentam como promissores no possível desenvolvimento de um novo
fármaco antitumoral. Essa promessa transparece no fato de ambos serem de síntese química
relativamente simples (processo sintético exequível) e, principalmente, por apresentarem efeito
biológico de interesse em células tumorais, como citotoxicidade e indução de morte celular,
especialmente por apoptose.
Pelo que foi observado nos resultados de nossa pesquisa, os complexos aqui estudados,
podem constituir um modelo para o estudo de novos agentes anticancerígenos com concomitante
capacidade de não induzir MDR. Esta característica se mostrou muito evidente sobre a linhagem
leucêmica K-562, onde os níveis de expressão de MDR1, após o tratamento com os rutenatos,
foram muito inferiores aos apresentados pelas células tumorais tratadas com o fármaco controle
Cisplatina. Ainda, é importante pontuar que o composto ditionato de cistetraammino(oxalato)rutênio(III)
apresentou efeito citotóxico em ambas as linhagens tumorais
K-562 e A549, sem contudo induzir altos níveis de expressão de Pgp (MDR1), apresentados
pelos fármacos platinados.
Assim, estudos mais aprofundados sobre a estrutura e funcionamento biológico desses
complexos de rutênio, representam um ponto de partida interessante para o desenvolvimento de
fármacos multifuncionais e de efeito desejável, auxiliando na delineação de estudos clínicos
dirigidos a grupos selecionados de pacientes que reúnam características genotípicas e fenotípicas
preditivas de máxima resposta terapêutica com mínima toxicidade. Posteriormente, estes estudos
podem levar às realizações de testes diagnósticos e farmacológicos mais eficazes que poderão ser
estabelecidos como rotina voltada para uma melhor definição de tratamentos. Isso traria um
maior sucesso no teste de novos medicamentos e reduziria os custos e riscos, minimizando o
tempo gasto para aprovação de um novo medicamento e a sua disponibilização para a sociedade.
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