Universiẗat, Diss., 2003--Dortmund.

For the quality assurance of substances for pharmaceutical use, a variety of analytical techniques are available to address specific analytical problems. In this field of application, liquid chromatography (LC) stands out as the gold standard in the pharmaceutical industry. Various detectors can be employed, which are e.g. based on UV/Vis spectroscopy for the examination of molecules with a chromophore, or mass spectrometry (MS) for structural elucidation of analytes. For the separation of enantiomers, the use of capillary electrophoresis (CE) may be more favorable due to the high separation efficiency and easy-to-use and comparatively inexpensive chiral selectors, in contrast to chiral columns for LC, which are usually very expensive and limited to a restricted number of analytes. For structure elucidation in impurity profiling, one- and multidimensional 1H NMR spectroscopy is a valuable tool as long as the analyte molecule has got nuclei that can be detected, which applies for the magnitude of organic pharmaceutical substances. For the evaluation of the amount of mineral oil aromatic hydrocarbons (MOAH) in various paraffin samples from different suppliers, a straightforward method based on 1H NMR spectroscopy was elaborated. The MOAH/MOSH ratio was used to indicate the amount of MOAH of paraffins and to evaluate the extent of refining. In addition, a representative paraffin sample was measured without sample solvent at high temperatures (about 340 K) to avoid the interfering residual solvent signals in the spectral regions of interest. The results of both methods were in good accordance. Moreover, the 1H NMR results were complemented with the UV measurements from the purity testing of paraffins according to the DAB 8. Correlations of the NMR and UV spectroscopic data indicated a linear relationship of both methods for the determination of MOAH in paraffins. Finally, the 1H NMR data was evaluated by principal component analysis (PCA) to explore differences within the paraffin samples and the spectral regions in the 1H NMR spectrum which are responsible for the formation of groups. It could be found that most variation is due to the MOSH of the paraffins. The PCA model was capable of differentiating between soft, liquid and solid paraffins on the one hand and between natural and synthetic liquid paraffins on the other hand. The impurity profiling of L-ascorbic acid 2-phosphate magnesium (A2PMg) was performed by means of one- and two-dimensional NMR spectroscopy. Several ethylated impurities could be detected, which were likely to be formed during synthesis of A2PMg. The structures of two of the ethylated impurities were identified as ascorbic acid 2-phosphate ethyl ester and ethanol, (residual solvent from synthesis). NMR spectroscopic studies of the fractions obtained from preparative HPLC of A2PMg revealed two additional impurities, which were identified as phosphorylated derivatives of ascorbic acid, ascorbic acid 3,5-phosphate and ascorbic acid 5-phosphate. Solid state mechanochemistry as an alternative approach for stress testing was applied on the drug substances S-Ibuprofen (Ibu) and Clopidogrel (CLP) using a ball mill, in order to study their degradation profile: First, the isomerization of S-Ibu was investigated, which was stressed in the solid state applying several milling frequencies and durations under basic, acidic and neutral conditions. For the separation of Ibu enantiomers, a chiral CE method was developed and validated according to ICH Q2(R1). It was found that S-Ibu is overall very stable to isomerization; it shows minor conversion into the R-enantiomer under basic environment applying long milling times and high frequencies. Last, the degradation profile of clopidogrel hydrogen sulfate (CLP) was investigated, which was stressed in the solid state under various oxidative conditions. An already existing HPLC-UV method was adjusted to sufficiently separate the degradation products, which were characterized by means of UV and MS/(MS) detection. Most of the degradation products identified were already reported to result from conventional CLP stress tests. The degradation profile of CLP was mainly influenced by the material of the milling jar and the type of catalyst used. / Für die Qualitätssicherung von Arznei- und Hilfsstoffen steht eine Vielzahl von analytischen Techniken für spezifische analytische Fragestellungen zur Verfügung. In der pharmazeutischen Industrie hat sich dabei die Flüssigkeitschromatographie als Goldstandard etabliert. Es können verschiedene Detektoren eingesetzt werden, die z. B. auf UV/Vis-Spektroskopie zur Untersuchung von Molekülen mit einem Chromophor oder auf Massenspektrometrie zur Strukturaufklärung von Analyten basieren. Für die Trennung von Enantiomeren kann die Verwendung von Kapillarelektrophorese aufgrund der hohen Trenneffizienz und der einfach zu handhabenden und vergleichsweise preiswerten chiralen Selektoren gegenüber chiralen Säulen in der Flüssigchromatographie bevorzugt sein, die in der Regel sehr teuer und auf eine begrenzte Anzahl von Analyten beschränkt sind. Für die Strukturaufklärung im Rahmen der Erstellung von Verunreinigungsprofilen ist die ein- und mehrdimensionale 1H-NMR-Spektroskopie eine sehr wertvolle Methode, solange das Analytmolekül Kerne besitzt, die der NMR-Spektroskopie zugänglich sind, was für den Großteil der organischen Arznei- und Hilfsstoffe zutrifft. Um die Menge an „mineral oil aromatic hydrocarbons (MOAH)“ in verschiedenen Paraffinproben von unterschiedlichen Herstellern zu bestimmen, wurde eine einfache 1H-NMR-Spektroskopie-Methode erarbeitet. Das Verhältnis von MOAH zu „mineral oil saturated hydrocarbons (MOSH)“ wurde dazu verwendet, um die Menge der MOAH in Paraffinen zu bestimmen und ihren Raffinationsgrad zu beurteilen. Zusätzlich wurde eine repräsentative Paraffinprobe ohne Probenlösungsmittel bei hohen Temperaturen (ca. 340 K) vermessen, um die interferierenden Restlösemittel Signale in den relevanten Spektralbereichen zu vermeiden. Die Ergebnisse beider Methoden stimmten gut überein. Weiterhin wurden die 1H-NMR-Ergebnisse durch die UV-Messungen aus der Reinheitsprüfung von Paraffinen gemäß DAB 8 ergänzt. Korrelationen der NMR- und UV-spektroskopischen Daten wiesen auf eine lineare Beziehung beider Methoden für die Bestimmung der MOAH in Paraffinen hin. Schließlich wurden die 1H-NMR-spektroskopischen Daten mittels Hauptkomponentenanalyse ausgewertet, um Unterschiede innerhalb der Paraffinproben und die für die Gruppenbildung verantwortlichen Spektralbereiche im 1H-NMR-Spektrum zu ermitteln. Es konnte festgestellt werden, dass der Hauptanteil der Varianz auf die MOSH zurückzuführen ist. Das PCA-Modell war dazu in der Lage, zwischen weichen, flüssigen und festen Paraffinen einerseits und zwischen natürlichen und synthetischen flüssigen Paraffinen andererseits zu unterscheiden. Das Verunreinigungsprofil von L-Ascorbinsäure-2-phosphat-Magnesium (A2PMg) wurde mittels ein- und zweidimensionaler NMR-Spektroskopie untersucht. Es konnten mehrere ethylierte Verunreinigungen nachgewiesen werden, die vermutlich während des Syntheseprozesses von A2PMg gebildet wurden. Die Strukturen von zwei der ethylierten Verunreinigungen wurden als Ascorbinsäure-2-phosphat ethylester und Ethanol (Restlösungsmittel aus der Synthese) identifiziert. NMR spektroskopische Untersuchungen der aus der präparativen HPLC von A2PMg erhaltenen Fraktionen ergab zwei weitere Verunreinigungen, die als phosphorylierte Derivate von Ascorbinsäure, Ascorbinsäure-3,5-phosphat und Ascorbinsäure-5-phosphat, identifiziert wurden. Die Festkörper-Mechanochemie als alternativer Ansatz für Stresstests wurde auf die Arzneistoffe S-Ibuprofen und Clopidogrel unter Einsatz einer Kugelmühle angewandt, um deren Abbauprofil zu analysieren: Zunächst wurde die Isomerisierung von S-Ibuprofen (Ibu) untersucht, das im festen Zustand unter Anwendung verschiedener Mahlfrequenzen und -dauern unter basischen, sauren und neutralen Bedingungen gestresst wurde. Für die Trennung der Ibu-Enantiomere wurde eine chirale Kapillarelektrophorese-Methode entwickelt und gemäß ICH Q2(R1) Leitlinie validiert. Es wurde festgestellt, dass S-Ibu insgesamt sehr stabil gegenüber Isomerisierung ist, jedoch unter basischen Bedingungen und hohen Mahldauern und -frequenzen eine geringe Umwandlung in das R-Enantiomer zeigt. Zuletzt wurde das Abbauprofil von Clopidogrelhydrogensulfat (CLP) untersucht, das im festen Zustand unter oxidativen Bedingungen gestresst wurde. Eine bereits bestehende HPLC-UV Methode wurde optimiert, um die Abbauprodukte ausreichend zu trennen und anschließend mittels UV- und MS/(MS)-Detektion zu charakterisieren. Die meisten der identifizierten Abbauprodukte waren bereits aus konventionellen CLP-Stresstests bekannt. Das Abbauprofil von CLP wurde hauptsächlich durch das Material der Kugelmühle und den Typ des verwendeten Katalysators beeinflusst.

Um Proteine und Peptide ohne Verluste in der Trennleistung mit Hilfe der Kapillarelektrophorese zu analysieren, wurde der Innenkanal von fused silica Kapillaren mit 2-Hydroxyethylmethacrylat (HEMA) nach dem Prinzip der radikalischen Atomtransferpolymerisation beschichtet. Durch die Variation einiger Reaktionsparameter konnten dabei vier HEMA-Beschichtungen erhalten werden. Mit diesen wurden dann nach den Methoden der Kapillarzonenelektrophorese bei pH 3 und pH 9 und der isoelektrischen Fokussierung Vergleichsmessungen durchgeführt. Die Detektion erfolgte dabei teilweise mit einem Elektrosprayionisations-Flugzeit-Massenspektrometer. Es stellte sich heraus, dass sich die entwickelten Kapillarbeschichtungen im Bezug auf Trenneffizienz wie auch Stabilität im basischen Bereich teilweise stark voneinander unterschieden. Die Betrachtung der Polymerschichten mit Hilfe der Atomkraftmikroskopie zeigte, dass die Morphologie der HEMA-Beschichtung stark vom gewählten Reaktionsmedium abhängig ist.

Regensburg, Univ., Diss., 2008

München, Techn. Univ., Diss., 2003.

Universiẗat, Habil.-Schr., 1999--Bielefeld.

Um Proteine und Peptide ohne Verluste in der Trennleistung mit Hilfe der Kapillarelektrophorese zu analysieren, wurde der Innenkanal von fused silica Kapillaren mit 2-Hydroxyethylmethacrylat (HEMA) nach dem Prinzip der radikalischen Atomtransferpolymerisation beschichtet. Durch die Variation einiger Reaktionsparameter konnten dabei vier HEMA-Beschichtungen erhalten werden. Mit diesen wurden dann nach den Methoden der Kapillarzonenelektrophorese bei pH 3 und pH 9 und der isoelektrischen Fokussierung Vergleichsmessungen durchgeführt. Die Detektion erfolgte dabei teilweise mit einem Elektrosprayionisations-Flugzeit-Massenspektrometer. Es stellte sich heraus, dass sich die entwickelten Kapillarbeschichtungen im Bezug auf Trenneffizienz wie auch Stabilität im basischen Bereich teilweise stark voneinander unterschieden. Die Betrachtung der Polymerschichten mit Hilfe der Atomkraftmikroskopie zeigte, dass die Morphologie der HEMA-Beschichtung stark vom gewählten Reaktionsmedium abhängig ist.

PCR und Fluoreszenz - DNA - Fragment - Analyse zum Nachweis einer monoklonalen B-Zell-Population zur Diagnostik der kutanen B-Zell Lymphome (CBCL) Der Nachweis einer monoklonalen B-Zell Population mittels PCR hat sich seit ca. zehn Jahren ergänzend zu Klinik und Histopathologie in der Diagnostik der kutanen B-Zell Lymphome etabliert. Zu diesem Zweck wurden Primer für die IgH Framework-Regionen (FR1, 2, 3), die Leader-Sequenz und für die JH-Region sequenziert. Alle Primervarianten führen zur Amplifikation der hochvariablen CDR-3 Region, welche für jede B-Zelle spezifisch ist. Die Kapillarelektrophorese mit fluoreszenzmarkierten PCR-Produkten an automatischen Sequenziergeräten (z. B. Genescan ABI Prism 310) ermöglicht eine exakte Größenbestimmung des jeweiligen Fragmentes und ist daher in diesem Zusammenhang die geeignetste Methode. Zunächst wurden alle relevanten Primer mit der Simulationssoftware Oligo hinsichtlich ihrer Bindungseigenschaften geprüft. Danach wurden ausgewählte Primer-Sets an 58 in Paraffin eingebetteten und an 5 Kryoproben von sicher diagnostizierten CBCL-Patienten getestet. Die fluoreszenzmarkierten Produkte wurden mit dem Sequenziergerät ABI Prism 310 analysiert. Die ungeschachtelte FR3/JH-PCR konnte nur in 30% und zusammen mit der halbgeschachtelten FR3/JH-PCR nur in 37% der Fälle klonale B-Zellen nachweisen. Die Detektionsrate erhöhte sich auf 54% unter Einbeziehung der geschachtelten FR1/JH-PCR und schließlich auf 60% mit einer zusätzlichen geschachtelten FR2/JH-PCR. Das Auftreten von Pseudoklonen (variierende Größe des klonalen Peaks bei Wiederholung der PCR) bei den geschachtelten PCR machte eine Prüfung auf Reproduzierbarkeit der Ergebnisse unbedingt erforderlich. Die höchste Rate an Pseudoklonen zeigte die FR2/JH-PCR. Aufgrund der schlechten Qualität der IgH Leader-PCR konnten mit in Paraffin-eingebetteten Proben keine Amplifikate erzeugt werden. Zusammenfassend ist zu sagen, daß gemeinsame Verwendung der in dieser Arbeit entwickelten PCR eine Sensitivitätssteigerung von 30% auf 60% ermöglichen. / Clonality detection in cutaneous B-cell lymphomas (CBCL) using immunoglobulin heavy chain gene PCR assays and fluorescence PCR-fragment analysis on automated DNA sequencer Detection of clonally expanded immunoglobulin heavy chain (Igh) gene rearrangements by PCR and subsequent electrophoresis is increasingly used in the diagnosis of cutaneous B-cell lymphomas (CBCL). To this end, primers for the three Igh framework regions (FR1,2, 3), the leader sequence and the Jh region are applied, all amplifying the highly variable IgH third complementary region (CDR3) Recently, fluorescence PCR-fragment analysis on automated DNA sequencers (GeneScan analysis, GSA), providing an exact sizing has been applied as appropriate seperation technique in this context. We have evaluated all Igh primers hitherto known by a PC primer analysis program. Then, fluorescently labeled products generated from DNAs of 58 paraffin embedded and 5 frozen lesional skin biopsies of confirmed CBCL cases using the primer sets selected, were analysed by GSA on the ABI 310 Prism instrument. Single round or seminested FR3/JH-PCR showed clonal B-cells only in 30 or 37% of cases, respectively. This fraction was increased to 54% including a nested FR1/JH-PCR, and, to 60% applying a supplementary nested FR2/JH-PCR. However false clonal results, indicated by peaks of varying sizes from repeated PCR, have been received by nested PCR, mostly by FR2/JH. Obviously due to their poor quality, the IgH leader-PCR has not yielded amplification products from paraffin-derived DNAs. Our data show that the FR3/JH-PCR only is not sufficient for detecting B-cell clonality in CBCL, but following inclusion of additional IgH-PCR, an increase of detection rate up to 60% is possible. A substantial number of cases still fail to show clonality.

Im ersten Teil der Arbeit wurden Strategien zur Analyse von Transkripten erarbeitet. Die ersten Versuche zielten darauf ab, in mit Glaskapillaren genommenen Einzelzellproben verschiedener Gewebeschichten RT-PCR durchzuführen, um spezifische Transkripte nachweisen zu können. Dies gelang für eine Reihe von Genen aus verschiedenen Pflanzenspezies. Dabei konnten sowohl Transkripte stark wie auch schwach exprimierter Gene nachgewiesen werden. <br /> Für die Erstellung von Gewebe-spezifischen Expressionsprofilen war es notwendig, die in vereinigten Zellproben enthaltene mRNA zunächst zu amplifizieren, um eine ausreichende Menge für Arrayhybridisierungen zu erhalten. Vor der Vermehrung wurde die mRNA revers transkribiert. Es wurden daran anschließend verschiedene Amplifikationsstrategien getestet: Die neben Tailing, Adapterligation und anderen PCR-basierenden Protokollen getestete Arbitrary-PCR hat sich in dieser Arbeit als einfache und einzige Methode herausgestellt, die mit so geringen cDNA-Mengen reproduzierbar arbeitet. Durch Gewebe-spezifische Array-hybridisierungen mit der so amplifizierten RNA konnten schon bekannte Expressionsmuster verschiedener Gene, vornehmlich solcher, die an der Photosynthese beteiligt sind, beobachtet werden. Es wurden aber auch eine ganze Reihe neuer offensichtlich Gewebe-spezifisch exprimierter Gene gefunden. Exemplarisch für die differentiell exprimierten Gene konnte das durch Arrayhybridisierungen gefundene Expressionsmuster der kleinen Untereinheit von Rubisco verifiziert werden. Hierzu wurden Methoden zum Gewebe-spezifischen Northernblot sowie semiquantitativer und Echtzeit-Einzelzell-RT-PCR entwickelt.<br /> Im zweiten Teil der Arbeit wurden Methoden zur Analyse von Metaboliten einschließlich anorganischer Ionen verwendet. Es stellte sich heraus, daß die multiparallele Methode der Gaschromatographie-Massenspektrometrie keine geeignete Methode für die Analyse selbst vieler vereinigter Zellinhalte ist. Daher wurde auf Kapillarelektrophorese zurückgegriffen. Eine Methode, die mit sehr kleinen Probenvolumina auskommt, eine hohe Trennung erzielt und zudem extrem geringe Detektionslimits besitzt. Die Analyse von Kohlenhydraten und Anionen erfordert eine weitere Optimierung. Über UV-Detektion konnte die K+-Konzentration in verschiedenen Geweben von A. thaliana bestimmt werden. Sie lag in Epidermis und Mesophyll mit ca. 25 mM unterhalb der für andere Pflanzenspezies (Solanum tuberosum und Hordeum vulgare) publizierten Konzentration. Weiter konnte gezeigt werden, daß zwölf freie Aminosäuren mittels einer auf Kapillarelektrophorese basierenden Methode in vereinigten Zellproben von Cucurbita maxima identifiziert werden konnten. Die Übertragung der Methode auf A. thaliana-Proben muß jedoch weiter optimiert werden, da die Sensitivität selbst bei Laser induzierter Fluoreszenz-Detektion nicht ausreichte.<br /> Im dritten und letzten Teil der Arbeit wurde eine Methode entwickelt, die die Analyse bekannter wie unbekannter Proteine in Gewebe-spezifischen Proben ermöglicht. Hierzu wurde zur Probennahme mittels mechanischer Mikrodissektion eine alternative Methode zur Laser Capture Microdissection verwendet, um aus eingebetteten Gewebeschnitten distinkte Bereiche herauszuschneiden und somit homogenes Gewebe anzureichern. Aus diesem konnten die Proteine extrahiert und über Polyacrylamidgelelektrophorese separariert werden. Banden konnten ausgeschnitten, tryptisch verdaut und massenspektrometrisch die Primärsequenz der Peptidfragmente bestimmt werden. So konnten als Hauptproteine im Mesophyll die große Untereinheit von Rubisco sowie ein Chlorophyll bindendes Protein gefunden werden.<br /> Die in dieser Arbeit entwickelten und auf die Modellpflanze Arabidopsis thaliana angewandten Einzelzellanalysetechniken erlauben es in Zukunft, physiologische Prozesse besser sowohl räumlich als auch zeitlich aufzulösen. Dies wird zu einem detaillierteren Verständnis mannigfaltiger Vorgänge wie Zell-Zell-Kommunikation, Signalweiterleitung oder Pflanzen-Pathogen-Interaktionen führen. / The subject of this thesis was the analysis of single plant cells in respect to their contents of i) transcripts, ii) inorganic cations and anions, iii) metabolites like amino acids and carbohydrates as well as iv) proteins. One task was the transfer of existing methods to single cell analysis on leaf tissues of the model plant Arabisopsis thaliana L., the second one was the refinement and the development, respectively, of new protocols for the analysis of such picoliter samples. For cell type specific sampling two different complimentary methods were applied: Using micro glass capillaries specific single cell contents could be harvested from intact plants, whereas typical sample volumes were in the picoliter range. Even the sampling of inner cell types such as companion cells could be demonstrated. Using mechanical micro dissection of embedded tissue a larger amount of homogenous tissue could be collected.<br /> Because single cell samples contain only femtogram amounts of mRNA, direct detection of transcripts is impossible. Therefore, two amplification protocols were applied to the cell samples: The first procedure makes use of specifically primed RT-PCR for amplification. Several genes derived from different plants and tissues could be detected after successful RT-PCR, including high as well as low expressed genes. The second method was developed to monitor the activity of many genes in parallel using array hybridisation with filters containing the cDNA of as many as 16.000 ESTs. For this purpose, unspecific RT-PCR as it is applied in the differential display was used to amplify different transcripts in just one reaction. However, in these tissue specific array hybridisations the expression patterns of several hundreds genes could be monitored. These included known tissue specific expression patterns (of mainly photosynthesis related genes) as well as a couple of unknown expression patterns. To verify the tissue specificity of gene activity some results were reconsidered using tissue specific northern blot hybridisations and real time RT-PCR, respectively. <br /> Secondly, metabolites (including inorganic ions) were investigated: Because gas chromatography-mass spectrometry does not reveal the sensitivity which in necessary for the analysis of even multiple pooled single cell samples capillary electrophoresis was applied for these studies. This method has a high potential as it needs only small amounts of starting material, has uncomparable low detection limits and exhibits a high number of theoretical plates.<br /> The analysis of inorganic anions and carbohydrates needs further optimisations. Using UV absorption-detection potassium could be detected in different cell types whereas the concentrations in mesophyll and epidermis were found around 25 mM each. These concentrations are lower than in other species as Solanum tuberosum or Hordeum vulgare. For investigations of amino acids the cell samples were derivatized to make the use of laser induced fluorescence-detection capable. In samples derived from pumpkin (Cucurbita maxima) mesophyll twelve amino acids could be detected and identified. The transfer of this method to A. thaliana derived samples exhibited no results which may be due to the low concentration of free amino acids in these plants.<br /> Finally, a method was developed with which the existence of known and unknown proteins in tissue specific samples could be monitored. For this, mechanical micro dissection was used to: After embedding and sectioning the tissue of interest was cut out by an vibrating steel chisel to get homogenous samples. The proteins contained in these tissue pieces were extracted and separated by one dimensional SDS polyacrylamid gel electrophoresis. Several protein bands could be detected after staining with either silver or coomassie blue stain. These bands were cut out and sequenced by mass spectrometry. The large subunit of rubisco as well as one chlorophyll binding protein could be identified as the major proteins within the mesophyll.<br /> The single cell analysis methods which were developed and applied to the model plant A. thaliana in this thesis allow a better spatial as well as temporal resolution of analysis. This will lead to a more detailed understanding of physiological processes like cell to cell communication, signalling or plant-pathogen interactions.