Les kinines sont des peptides neuro- et vaso- actifs impliqués dans les processus hémodynamiques, inflammatoires et douloureux. Leurs effets biologiques sont produits par l’entremise de deux types de récepteurs couplés aux protéines G, soit B1 (B1R) et B2 (B2R). Le B1R est inductible, son expression est augmentée à la suite d’un dommage tissulaire ou de l’exposition à des endotoxines bactériennes (lipopolysaccharide bactérien (LPS)), à des cytokines pro-inflammatoires (interleukine-1β (IL-1β), facteur de nécrose tumorale-α (TNF-α)) ou à des espèces réactives oxygénées (ROS). Les travaux présentés dans cette thèse avaient pour objectif d’élucider et/ou de raffiner les connaissances sur 1) la localisation, 2) le mécanisme d’induction et 3) le rôle physiopathologique du B1R dans des modèles expérimentaux de douleur chez le rat. Nos données ont permis de démontrer pour la première fois que le B1R est augmenté de façon significative dans la moelle épinière du rat diabétique de type 1 où il est localisé sur les fibres sensorielles de type C, les astrocytes et les cellules de la microglie (1er article). Également, l’inhibition de l’activation des cellules de la microglie supprime les neuropathies diabétiques, l’expression de médiateurs pro-inflammatoires ainsi que l’activité pro-nociceptive du B1R (2e et 3e articles). Finalement, nous avons démontré que la stimulation systémique du TRPV1 par la capsaïcine induit une surexpression du B1R au niveau microgliale, via un mécanisme impliquant l’augmentation de la production de ROS et possiblement de cytokines (4e article). Ces données nous permettent de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’expression et l’activité du B1R. Aussi, elles nous permettent d’imaginer de nouvelles stratégies pour prévenir l’induction du B1R (inhibition du TRPV1) ou son activité délétère (inhibition de l’activation des cellules de la microglie) dans la douleur inflammatoire et neuropathique. / Kinins are vaso- and neuro-active peptides involved in hemodynamic, inflammatory and pain processes. Their biological effects are mediated by two G Protein Coupled Receptors (GPCR), termed B2R (constitutive) and B1R (inducible). B1R is expressed following tissue damage or exposure to bacterial endotoxin (LPS), pro-inflammatory cytokines (IL-1β, TNF-α) and increased reactive oxygen species (ROS) levels. The objectives of this doctoral thesis were to define 1) the localisation, 2) the mechanism of induction and 3) the pathophysiological role of B1R in experimental models of pain in rat. Our data showed that B1R is significantly upregulated on sensory C fibers, astrocytes and microglia in spinal cord of type 1 diabetic rat (paper #1). Moreover, pharmacological inhibition of microglia reversed diabetic pain neuropathy, reduced levels of pro-inflammatory mediators and prevented B1R pro-nociceptive activity (papers #2 and 3). Finally, our data showed that systemic stimulation of TRPV1 with capsaicin upregulated B1R expression, mainly on microglia, through the increase of ROS and possibly cytokines (paper #4). Altogether, these data increased our knowledge related to B1R mechanism of induction and B1R activity. Also, these data shed light on new strategies to prevent B1R expression (TRPV1 blockade) and B1R deleterious activity (inhibition of microglia activation) in inflammatory and neuropathic pain.

Les kinines sont des peptides neuro- et vaso- actifs impliqués dans les processus hémodynamiques, inflammatoires et douloureux. Leurs effets biologiques sont produits par l’entremise de deux types de récepteurs couplés aux protéines G, soit B1 (B1R) et B2 (B2R). Le B1R est inductible, son expression est augmentée à la suite d’un dommage tissulaire ou de l’exposition à des endotoxines bactériennes (lipopolysaccharide bactérien (LPS)), à des cytokines pro-inflammatoires (interleukine-1β (IL-1β), facteur de nécrose tumorale-α (TNF-α)) ou à des espèces réactives oxygénées (ROS). Les travaux présentés dans cette thèse avaient pour objectif d’élucider et/ou de raffiner les connaissances sur 1) la localisation, 2) le mécanisme d’induction et 3) le rôle physiopathologique du B1R dans des modèles expérimentaux de douleur chez le rat. Nos données ont permis de démontrer pour la première fois que le B1R est augmenté de façon significative dans la moelle épinière du rat diabétique de type 1 où il est localisé sur les fibres sensorielles de type C, les astrocytes et les cellules de la microglie (1er article). Également, l’inhibition de l’activation des cellules de la microglie supprime les neuropathies diabétiques, l’expression de médiateurs pro-inflammatoires ainsi que l’activité pro-nociceptive du B1R (2e et 3e articles). Finalement, nous avons démontré que la stimulation systémique du TRPV1 par la capsaïcine induit une surexpression du B1R au niveau microgliale, via un mécanisme impliquant l’augmentation de la production de ROS et possiblement de cytokines (4e article). Ces données nous permettent de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’expression et l’activité du B1R. Aussi, elles nous permettent d’imaginer de nouvelles stratégies pour prévenir l’induction du B1R (inhibition du TRPV1) ou son activité délétère (inhibition de l’activation des cellules de la microglie) dans la douleur inflammatoire et neuropathique. / Kinins are vaso- and neuro-active peptides involved in hemodynamic, inflammatory and pain processes. Their biological effects are mediated by two G Protein Coupled Receptors (GPCR), termed B2R (constitutive) and B1R (inducible). B1R is expressed following tissue damage or exposure to bacterial endotoxin (LPS), pro-inflammatory cytokines (IL-1β, TNF-α) and increased reactive oxygen species (ROS) levels. The objectives of this doctoral thesis were to define 1) the localisation, 2) the mechanism of induction and 3) the pathophysiological role of B1R in experimental models of pain in rat. Our data showed that B1R is significantly upregulated on sensory C fibers, astrocytes and microglia in spinal cord of type 1 diabetic rat (paper #1). Moreover, pharmacological inhibition of microglia reversed diabetic pain neuropathy, reduced levels of pro-inflammatory mediators and prevented B1R pro-nociceptive activity (papers #2 and 3). Finally, our data showed that systemic stimulation of TRPV1 with capsaicin upregulated B1R expression, mainly on microglia, through the increase of ROS and possibly cytokines (paper #4). Altogether, these data increased our knowledge related to B1R mechanism of induction and B1R activity. Also, these data shed light on new strategies to prevent B1R expression (TRPV1 blockade) and B1R deleterious activity (inhibition of microglia activation) in inflammatory and neuropathic pain.

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Les kinines sont des peptides vasoactifs et des neuromédiateurs centraux impliqués dans le contrôle cardiovasculaire, la douleur et l’inflammation. Leurs actions sont relayées par deux types de récepteurs couplés aux protéines G : le récepteur B2 (RB2), constitutif, et le récepteur B1 (RB1), inductible en présence de lésions tissulaires, de cytokines pro-inflammatoires, d’endotoxines bactériennes et dans certaines pathologies tel que le diabète. Le diabète sucré augmente à l’échelle mondiale et son étiologie est complexe; il aggrave les infections sévères et augmente la mortalité par hyperbactériémie résistante à un contrôle thérapeutique et une prise en charge en soins intensifs. Les décès surviennent dans la grande majorité des cas à la suite de l'apparition d'une coagulation intra- vasculaire disséminée (CIVD). Ce projet a pour but d’étudier le rôle du RB1 dans la CIVD dans un modèle de diabète de type 1 induit par la streptozotocine (STZ) (Article 1) et dans l’insulite (Article 2). La CIVD est produite par l’injection de lipopolysaccharide (LPS, 2 mg/kg, i.p.), 4 jours après le traitement à la STZ (65 mg/kg, i.p.). Dans le premier article, nous avons montré une augmentation significative de l'œdème et de la perméabilité vasculaire par le bleu d’Évans dans le rein, le poumon, le coeur et le foie chez les rats traités au LPS et/ou à la STZ, une situation qui favorise une hémoconcentration et le développement d'un état d'hypercoagulabilité. Nous avons aussi montré la présence d'indices de thrombus et de lésions tissulaires dans l'étude histologique ainsi qu’une augmentation de l'expression du RB1 dans le coeur, le rein et les plaquettes sanguines. Un traitement avec l’antagoniste du RB1, le SSR240612, a corrigé l’apparition de ces anomalies et a rendu normale la glycémie chez les rats STZ et l’hyperthermie induite par le LPS. De même, le SSR240612 a nettement amélioré la survie des animaux. Les bénéfices du SSR240612 ont été reproduits par l’inhibition de la iNOS avec le 1400W et de la COX-2 avec l’acide niflumique, suggérant que les médiateurs de ces enzymes pro-inflammatoires agissent en aval du RB1.Dans le deuxième article, le rat STZ est traité du jour 4 au jour 7 avec le SSR240612 (10 mg/kg/jr per os). Cet antagoniste du RB1 bloque l’infiltration du pancréas par les macrophages et les lymphocytes TCD4+ qui sont porteurs du RB1. L’antagoniste prévient aussi l’augmentation de l’expression de la iNOS, du TNF-α, du RB1 et du TRPV1 dans le pancréas des rats diabétiques. Le traitement avec l’antagoniste du RB1 a limité la perte des cellules β des îlots de Langerhans et a corrigé l’hypoinsulinémie et l’hyperglycémie. Ces deux études mettent en lumière un rôle important du RB1 dans la létalité associée au choc septique, à la thrombose et à l’insulite. Par conséquent, le RB1 représente une cible thérapeutique prometteuse dans le traitement du diabète et de ses complications. / Kinins are vasoactive peptides and central neuromediators involved in cardiovascular control, pain and inflammation. Their effects are mediated by two G protein-coupled receptors: the constitutive B2 receptor (B2R) and the inducible B1 receptor (B1R) that is upregulated during tissue injury, in the presence of proinflammatory cytokines, bacterial endotoxins and diabetes. Diabetes has reached epidemic level and its etiology is complex. Diabetes mellitus worsens severe infections and increases mortality caused by hyperbacteremia resistant to therapeutic control and management in intensive care units. Mortality is largely secondary to the occurrence of disseminated intravascular coagulation (DIC). This project examines the role of B1R in DIC in a model of type 1 diabetes induced by streptozotocin (STZ) (Article 1) and insulitis (Article 2). DIC was induced by injection of lipopolysaccharide (LPS, 2 mg/kg i.p.) four days after treatment with STZ (65 mg/kg, i.p.). In the first article, we have shown a significant increase in edema and vascular permeability (Evans blue) in kidney, lung, heart and liver in rats treated with LPS and/or STZ, increasing the haemoconcentration and the development of hypercoagulability state. Also, we showed the presence of thrombus formation and tissue damage by histological studies, and increased expression of B1R in the heart, kidney and platelets. Treatment with the B1R antagonist, SSR240612, alleviated all those abnormalities, in addition to reducing hyperglycemia in STZ rats, LPS-induced hyperthermia and improving survival. The beneficial effects of SSR240612 were reproduced by the inhibition of iNOS with 1400W and of COX-2 with niflumic acid, suggesting that the mediators of these proinflammatory enzymes act downstream to B1R. In the second article, STZ rats were treated with SSR240612 (10 mg/kg/d, per os) from day 4 to day 7. This B1R antagonist blocked the infiltration of the pancreas by macrophages andTCD4+ lymphocytes which express B1R. The antagonist also prevented the increased expression of iNOS, TNF-α, B1R and TRPV1 in the pancreas of STZ-diabetic rats. The treatment with the B1R antagonist limited the loss of Langerhans β cells, which improved plasma insulin and normalized hyperglycemia. These studies highlight a primary role for B1R in lethality associated with septic shock, thrombosis and insulitis. Therefore, kinin B1R is a promising therapeutic target in the treatment of diabetes and its complications.

Les décès attribués à un choc septique à la suite d’une infection sévère augmentent chez les diabétiques et surviennent assez fréquemment dans les unités de soins intensifs. Le diabète sucré et le choc septique augmentent la production d’espèces réactives oxygénées et de cytokines pro-inflammatoires, lesquelles activent le facteur de transcription nucléaire Kappa B conduisant à l’induction du récepteur B1 (RB1) des kinines. Le diabète induit par la streptozotocine (STZ) augmente l’expression du RB1 dans divers tissus périphériques, le cerveau et la moelle épinière. Les lipopolysaccharides bactériens (LPS), souvent utilisés pour induire le choc septique, induisent aussi le RB1. L’objectif de ce travail vise à démontrer la contribution du RB1 des kinines dans l’exacerbation du choc septique pendant le diabète. Des rats Sprague-Dawley (225-250 gr) traités à la STZ (65 mg/kg, i.p.) ou le véhicule ont reçu quatre jours plus tard les LPS (2 mg/kg, i.v.) ou le véhicule en présence ou pas d’un antagoniste du RB1 (SSR240612, 10 mg/kg) administré par gavage. La température corporelle a été mesurée pendant 24h après le traitement. Le SSR240612 a aussi été administré à 9h AM et 9h PM et les rats sacrifiés à 9h AM le jour suivant après un jeûne de 16 h. Les effets de ces traitements ont été mesurés sur les taux plasmatiques d’insuline et de glucose, l’œdème et la perméabilité vasculaire (dans divers tissus avec la technique du Bleu d’Evans) ainsi que sur l’expression du RB1 (PCR en temps réel) dans le cœur et le rein. L’augmentation de la température corporelle après traitement au LPS chez les rats traités ou pas à la STZ a été bloquée par le SSR240612. L’antagoniste a normalisé l’hyperglycémie et amélioré la déficience en insuline chez les rats STZ. Le SSR240612 a inhibé l’œdème et réduit la perméabilité vasculaire dans les tissus des rats diabétiques traités ou pas avec les LPS. La surexpression du RB1 chez les rats traités au STZ et/ou LPS était renversée par le SSR240612. Cet antagoniste a prévenu la mortalité causée par les LPS et LPS plus STZ. Les effets anti-pyrétique, anti-inflammatoire et anti-diabétique du SSR240612 suggèrent que le RB1 puisse représenter une cible thérapeutique valable pour le traitement de la co-morbidité associée au choc septique dans le diabète. / Death attributed to septic shock following severe infection increases in diabetic patients and occurs quite frequently in intensive care units. Diabetes mellitus and septic shock increase the production of reactive oxygen species and pro-inflammatory cytokines leading to higher kinin B1 receptor (RB1) expression that is mediated by the activation of the transcriptional nuclear factor Kappa B. Streptozotocin (STZ)-induced diabetes increased the expression of RB1 in rat peripheral tissues, brain and spinal cord. Bacterial lipopolysaccharides (LPS) commonly used to induce septic shock in animal models, also induce RB1. Our objective is to study the contribution of kinin RB1 in the increased morbidity and mortality associated with the combination of these two diseases. Sprague-Dawley rats (225-250g) treated with STZ (65 mg/kg, ip) or vehicle received four days later LPS (2 mg/kg, iv) or vehicle in the presence or absence of the RB1 antagonist, SSR240612 (10 mg/kg), administered by gavage. Body temperature was monitored for 24h after treatment. In addition, SSR240612 was administered twice (9h AM and 9h PM) and rats were sacrificed the following morning at 9h AM after 16 h of fasting to measure the impact on plasma insulin and glucose, oedema and vascular permeability in various tissues (with the technique of Evans Blue) and on the expression of RB1 (real-time PCR) in heart and kidney. The increase in body temperature caused by treatment with LPS both in STZ-diabetic and non-diabetic rats was blocked by SSR240612. The antagonist normalized hyperglycaemia and improved insulin deficiency in STZ rats. SSR240612 inhibited oedema and reduced vascular permeability in all tissues from diabetic rats treated or not with LPS. The overexpression of RB1 induced by LPS and STZ was blocked by SSR240612. Pharmacological blockade of B1R with SSR240612 prevented the mortality induced by LPS and STZ plus LPS. Thus the anti-pyretic, anti-inflammatory and anti-diabetic effects of SSR240612 suggest that kinin RB1 is a promising therapeutic target for the treatment of co-morbidity associated with septic shock in diabetes.

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Le stress oxydatif est impliqué dans l’expression du récepteur B1 des kinines (RB1) dans différents modèles de diabète et d'hypertension. Puisque l'angiotensine II (Ang II) et l'endothéline-1 (ET-1) sont des peptides prooxydants impliqués dans les maladies cardiovasculaires, leur contribution dans l'augmentation de l'expression du RB1 a été étudiée dans des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV). Le QRT-PCR et l’immunobuvardage de type Western ont été utilisés pour mesurer l’expression du RB1 dans des CMLV dérivées de la lignée A10 et de l’aorte de rats Sprague-Dawley. Cette étude montre que l’Ang II augmente l’expression du RB1 (ARNm et protéine) en fonction de la concentration et du temps (maximum 1 μM entre 3-6 h). Cette augmentation implique le récepteur AT1, la PI3K et le NF-κB, mais non le récepteur AT2 et ERK1/2. Aussi, le récepteur ETA de l’ET-1 est impliqué dans la réponse à l’Ang II à 6-8 h et non à 1-4 h. Par contre, l’ET-1 augmente l’expression du RB1 (maximum 2-4 h) via la stimulation des récepteurs ETA et ETB. L’augmentation du RB1 causée par l’Ang II et l’ET-1 est bloquée par les antioxydants (N-acétyl-cystéine et diphénylèneiodonium). Ces résultats suggèrent que l’Ang II induit le RB1 dans les CMLV par le récepteur AT1 dans la première phase, et par la libération d’ET-1 (majoritairement par ETA) dans la phase tardive, via le stress oxydatif et l’activation de la PI3K et du NF-κB. Ces résultats précisent le mécanisme impliqué dans la surexpression du RB1 ayant des effets néfastes dans le diabète et l'hypertension. / Oxidative stress is involved in the overexpression of kinin B1 receptor (B1R) in various models of diabetes and hypertension. Since angiotensin II (Ang II) and endothelin-1 (ET-1) are pro-oxidative peptides involved in cardiovascular diseases, their contribution in increasing the expression of B1R was examined in vascular smooth muscle cells (VSMC). QRT-PCR and Western blot analysis were used to measure the expression of B1R in VSMC derived from A10 cell line and the aorta of Sprague-Dawley rats. This study shows that Ang II increases the expression of B1R (mRNA and protein) in a concentration- and time-dependent manner (maximum 1 μM between 3-6 h). This increase involves AT1 receptor, PI3K and NF-κB, but not AT2 receptor and ERK1/2. Moreover, ETA receptor is involved in the effect of Ang II at 6-8 h but not at 1-4 h. However, ET-1 increases expression of B1R (maximum 2-4 h) via stimulation of ETA and ETB receptors. Ang II and ET-1-induced increase expression of B1R is blocked by antioxidants (N-acetyl-L-cysteine and diphenyleneiodonium). These results suggest that Ang II induces B1R in VSMC by AT1 receptor in the first phase and by releasing ET-1 (predominantly by ETA receptor) in the late phase, via oxidative stress and activation of PI3K and NF-κB. These results clarify the mechanism involved in the overexpression of B1R which has adverse effects in diabetes and hypertension.

Le stress oxydatif est impliqué dans l’expression du récepteur B1 des kinines (RB1) dans différents modèles de diabète et d'hypertension. Puisque l'angiotensine II (Ang II) et l'endothéline-1 (ET-1) sont des peptides prooxydants impliqués dans les maladies cardiovasculaires, leur contribution dans l'augmentation de l'expression du RB1 a été étudiée dans des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV). Le QRT-PCR et l’immunobuvardage de type Western ont été utilisés pour mesurer l’expression du RB1 dans des CMLV dérivées de la lignée A10 et de l’aorte de rats Sprague-Dawley. Cette étude montre que l’Ang II augmente l’expression du RB1 (ARNm et protéine) en fonction de la concentration et du temps (maximum 1 μM entre 3-6 h). Cette augmentation implique le récepteur AT1, la PI3K et le NF-κB, mais non le récepteur AT2 et ERK1/2. Aussi, le récepteur ETA de l’ET-1 est impliqué dans la réponse à l’Ang II à 6-8 h et non à 1-4 h. Par contre, l’ET-1 augmente l’expression du RB1 (maximum 2-4 h) via la stimulation des récepteurs ETA et ETB. L’augmentation du RB1 causée par l’Ang II et l’ET-1 est bloquée par les antioxydants (N-acétyl-cystéine et diphénylèneiodonium). Ces résultats suggèrent que l’Ang II induit le RB1 dans les CMLV par le récepteur AT1 dans la première phase, et par la libération d’ET-1 (majoritairement par ETA) dans la phase tardive, via le stress oxydatif et l’activation de la PI3K et du NF-κB. Ces résultats précisent le mécanisme impliqué dans la surexpression du RB1 ayant des effets néfastes dans le diabète et l'hypertension. / Oxidative stress is involved in the overexpression of kinin B1 receptor (B1R) in various models of diabetes and hypertension. Since angiotensin II (Ang II) and endothelin-1 (ET-1) are pro-oxidative peptides involved in cardiovascular diseases, their contribution in increasing the expression of B1R was examined in vascular smooth muscle cells (VSMC). QRT-PCR and Western blot analysis were used to measure the expression of B1R in VSMC derived from A10 cell line and the aorta of Sprague-Dawley rats. This study shows that Ang II increases the expression of B1R (mRNA and protein) in a concentration- and time-dependent manner (maximum 1 μM between 3-6 h). This increase involves AT1 receptor, PI3K and NF-κB, but not AT2 receptor and ERK1/2. Moreover, ETA receptor is involved in the effect of Ang II at 6-8 h but not at 1-4 h. However, ET-1 increases expression of B1R (maximum 2-4 h) via stimulation of ETA and ETB receptors. Ang II and ET-1-induced increase expression of B1R is blocked by antioxidants (N-acetyl-L-cysteine and diphenyleneiodonium). These results suggest that Ang II induces B1R in VSMC by AT1 receptor in the first phase and by releasing ET-1 (predominantly by ETA receptor) in the late phase, via oxidative stress and activation of PI3K and NF-κB. These results clarify the mechanism involved in the overexpression of B1R which has adverse effects in diabetes and hypertension.