L’adénocarcinome pancréatique canalaire (PDAC) est un cancer de mauvais pronostic en partie en raison de la résistance aux traitements conventionnels de chimiothérapie ou de radiothérapie. Certaines substances bioactives issues de l’alimentation (BFCs), prooxydantes sont capables de potentialiser l’action cytotoxique des drogues conventionnelles dans le PDAC. Par ailleurs ces BFCs pourraient augmenter les cassures de l’ADN induites par les radiations ionisantes. Objectifs : évaluer l’action combinée de BFCs en association avec la chimiothérapie et la radiothérapie dans des modèles de PDAC et identifier les mécanismes impliqués dans la chimio/radiosensibilisation. Méthodes : La survie cellulaire a été évaluée in vitro en présence de BFCs en combinaison sur 4 lignées tumorales pancréatiques. La production d’espèces réactives de l'oxygène (ROS) a été mesurée par cytométrie en flux et par microscopie à fluorescence. Les mécanismes moléculaires ont été décryptés par western-blot (voies de signalisation) et cytométrie en flux (cycle cellulaire et apoptose). Enfin nous avons évalué l’association de BFCs en gavage avec la chimiothérapie par gemcitabine intrapéritonéale et avec la radiothérapie de 2 Gy par fraction in vivo, sur des greffes sous-cutanée de cellules CAPAN-2. Résultats : In vitro, le resvératrol (R), la capsaïcine (C) et le sulforaphane (S) étaient cytotoxiques avec effet inhibiteur significativement plus élevé en combinaison (R+C), (C+S) ou (R+C+S), sans effet sur les fibroblastes. Par ailleurs, les combinaisons potentialisaient l’action autrement limitée de la gemcitabine sur les cellules testées in vitro. In vivo, l’addition de R+C au traitement par gemcitabine à dose réduite a permis une régression tumorale équivalente à celle obtenue avec la gemcitabine à pleine dose. Par ailleurs, in vitro, l’ajout des BFCs seuls et combinés à la radiothérapie augmente de façon significative la toxicité cellulaire sur la lignée épithéliale CAPAN-2, comparé au traitement par radiothérapie seule comme aux traitements par BFCs seuls ou combinés. In vivo, la combinaison R+C associée à la radiothérapie a permis une diminution significative des volumes tumoraux comparée à la radiothérapie seule. L’étude des voies de signalisation a montré une augmentation de protéines pro-apoptotiques avec l’association R+C, en rapport avec une induction augmentée de ROS, mais aussi, de façon surprenante, une inhibition de la réparation de l’ADN par inhibition de la phosphorylation d’ATM. Ces deux effets combinés précipitaient la mort des cellules tumorales. Conclusions : Les combinaisons de R+C ont un effet chimiosensibilisant et radiosensibilisant dans un modèle préclinique de PDAC, avec des mécanismes moléculaires identifiés pertinents dans le contexte des thérapies testées. En associant les BFCs, à la chimioradiothérapie avec gemcitabine, on peut espérer une double potentialisation de la radiothérapie et de la chimiothérapie, en augmentant l’efficacité de la RT, et en diminuant la dose de gemcitabine associée pour une même efficacité et une meilleure tolérance du traitement.Mots clés : Cancer du pancréas, Substances bioactives issues de l’alimentation, radiothérapie, chimiothérapie, resvératrol, capsaïcine / Background: Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is of poor prognosis in part because of resistance to conventional treatments such as chemotherapy or radiotherapy. Some naturally occurring bioactive food components (BFCs), with pro-oxidant properties are able to potentiate the cytotoxic action of conventional drugs in the PDAC. In addition, these BFCs could increase the DNA breaks induced by ionizing radiation. Objectives: To evaluate the combined action of several BFCs in combination with chemotherapy and radiotherapy in PDAC models and to identify mechanisms involved in chemo / radiosensitization at the cellular and molecular levels. Methods: Cell survival was evaluated in vitro in the presence of BFCs in combination on 4 pancreatic tumor cell lines. The production of reactive oxygen species (ROS) was measured by flow cytometry and fluorescence microscopy. Molecular mechanisms have been decrypted by western blot (signaling pathways) and flow cytometry (cell cycle and apoptosis). Finally, we evaluated the association of BFCs in gavage with intraperitoneal gemcitabine chemotherapy and with radiotherapy (2 Gy/fraction) in vivo, on subcutaneous CAPAN-2 cell xenografts. Results: In vitro, resveratrol (R), capsaicin (C) and sulforaphane (S) were cytotoxic with significantly higher inhibitory effect in combination (R + C), (C + S) or (R + C + S), without effect on fibroblasts. In addition, the combinations potentiated the otherwise limited action of gemcitabine on cells tested in vitro. In vivo, the addition of R + C to treatment with gemcitabine at reduced dose allowed tumor inhibition equivalent to that obtained with gemcitabine at full dose. Furthermore, in vitro, the addition of BFCs alone and in combination with radiotherapy significantly increases cellular toxicity on the CAPAN-2 epithelial line, compared to radiotherapy alone and BFCs alone or combined. In vivo, the combination R + C associated with radiotherapy allowed a significant decrease in tumor volumes compared to radiotherapy alone. The study of signaling pathways showed an increase of proapoptotic proteins with the association R + C and radiotherapy, in relation with an increased induction of ROS, but also, surprisingly, an inhibition of the repair of the DNA by inhibition of ATM phosphorylation. These two combined effects precipitated the death of the tumor cells. Conclusions: Combinations of R + C have a chemosensitizing and radiosensitizing effect in a preclinical model of PDAC, with identified molecular mechanisms relevant in the context of the therapies tested. By combining BFCs with radiochemotherapy with gemcitabine, we can hope for a double potentiation of radiotherapy and chemotherapy, by increasing the effectiveness of RT, and by reducing the dose of gemcitabine associated for similar efficiency and better tolerance treatment.

Les kinines sont des peptides neuro- et vaso- actifs impliqués dans les processus hémodynamiques, inflammatoires et douloureux. Leurs effets biologiques sont produits par l’entremise de deux types de récepteurs couplés aux protéines G, soit B1 (B1R) et B2 (B2R). Le B1R est inductible, son expression est augmentée à la suite d’un dommage tissulaire ou de l’exposition à des endotoxines bactériennes (lipopolysaccharide bactérien (LPS)), à des cytokines pro-inflammatoires (interleukine-1β (IL-1β), facteur de nécrose tumorale-α (TNF-α)) ou à des espèces réactives oxygénées (ROS). Les travaux présentés dans cette thèse avaient pour objectif d’élucider et/ou de raffiner les connaissances sur 1) la localisation, 2) le mécanisme d’induction et 3) le rôle physiopathologique du B1R dans des modèles expérimentaux de douleur chez le rat. Nos données ont permis de démontrer pour la première fois que le B1R est augmenté de façon significative dans la moelle épinière du rat diabétique de type 1 où il est localisé sur les fibres sensorielles de type C, les astrocytes et les cellules de la microglie (1er article). Également, l’inhibition de l’activation des cellules de la microglie supprime les neuropathies diabétiques, l’expression de médiateurs pro-inflammatoires ainsi que l’activité pro-nociceptive du B1R (2e et 3e articles). Finalement, nous avons démontré que la stimulation systémique du TRPV1 par la capsaïcine induit une surexpression du B1R au niveau microgliale, via un mécanisme impliquant l’augmentation de la production de ROS et possiblement de cytokines (4e article). Ces données nous permettent de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’expression et l’activité du B1R. Aussi, elles nous permettent d’imaginer de nouvelles stratégies pour prévenir l’induction du B1R (inhibition du TRPV1) ou son activité délétère (inhibition de l’activation des cellules de la microglie) dans la douleur inflammatoire et neuropathique. / Kinins are vaso- and neuro-active peptides involved in hemodynamic, inflammatory and pain processes. Their biological effects are mediated by two G Protein Coupled Receptors (GPCR), termed B2R (constitutive) and B1R (inducible). B1R is expressed following tissue damage or exposure to bacterial endotoxin (LPS), pro-inflammatory cytokines (IL-1β, TNF-α) and increased reactive oxygen species (ROS) levels. The objectives of this doctoral thesis were to define 1) the localisation, 2) the mechanism of induction and 3) the pathophysiological role of B1R in experimental models of pain in rat. Our data showed that B1R is significantly upregulated on sensory C fibers, astrocytes and microglia in spinal cord of type 1 diabetic rat (paper #1). Moreover, pharmacological inhibition of microglia reversed diabetic pain neuropathy, reduced levels of pro-inflammatory mediators and prevented B1R pro-nociceptive activity (papers #2 and 3). Finally, our data showed that systemic stimulation of TRPV1 with capsaicin upregulated B1R expression, mainly on microglia, through the increase of ROS and possibly cytokines (paper #4). Altogether, these data increased our knowledge related to B1R mechanism of induction and B1R activity. Also, these data shed light on new strategies to prevent B1R expression (TRPV1 blockade) and B1R deleterious activity (inhibition of microglia activation) in inflammatory and neuropathic pain.

Les kinines sont des peptides neuro- et vaso- actifs impliqués dans les processus hémodynamiques, inflammatoires et douloureux. Leurs effets biologiques sont produits par l’entremise de deux types de récepteurs couplés aux protéines G, soit B1 (B1R) et B2 (B2R). Le B1R est inductible, son expression est augmentée à la suite d’un dommage tissulaire ou de l’exposition à des endotoxines bactériennes (lipopolysaccharide bactérien (LPS)), à des cytokines pro-inflammatoires (interleukine-1β (IL-1β), facteur de nécrose tumorale-α (TNF-α)) ou à des espèces réactives oxygénées (ROS). Les travaux présentés dans cette thèse avaient pour objectif d’élucider et/ou de raffiner les connaissances sur 1) la localisation, 2) le mécanisme d’induction et 3) le rôle physiopathologique du B1R dans des modèles expérimentaux de douleur chez le rat. Nos données ont permis de démontrer pour la première fois que le B1R est augmenté de façon significative dans la moelle épinière du rat diabétique de type 1 où il est localisé sur les fibres sensorielles de type C, les astrocytes et les cellules de la microglie (1er article). Également, l’inhibition de l’activation des cellules de la microglie supprime les neuropathies diabétiques, l’expression de médiateurs pro-inflammatoires ainsi que l’activité pro-nociceptive du B1R (2e et 3e articles). Finalement, nous avons démontré que la stimulation systémique du TRPV1 par la capsaïcine induit une surexpression du B1R au niveau microgliale, via un mécanisme impliquant l’augmentation de la production de ROS et possiblement de cytokines (4e article). Ces données nous permettent de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’expression et l’activité du B1R. Aussi, elles nous permettent d’imaginer de nouvelles stratégies pour prévenir l’induction du B1R (inhibition du TRPV1) ou son activité délétère (inhibition de l’activation des cellules de la microglie) dans la douleur inflammatoire et neuropathique. / Kinins are vaso- and neuro-active peptides involved in hemodynamic, inflammatory and pain processes. Their biological effects are mediated by two G Protein Coupled Receptors (GPCR), termed B2R (constitutive) and B1R (inducible). B1R is expressed following tissue damage or exposure to bacterial endotoxin (LPS), pro-inflammatory cytokines (IL-1β, TNF-α) and increased reactive oxygen species (ROS) levels. The objectives of this doctoral thesis were to define 1) the localisation, 2) the mechanism of induction and 3) the pathophysiological role of B1R in experimental models of pain in rat. Our data showed that B1R is significantly upregulated on sensory C fibers, astrocytes and microglia in spinal cord of type 1 diabetic rat (paper #1). Moreover, pharmacological inhibition of microglia reversed diabetic pain neuropathy, reduced levels of pro-inflammatory mediators and prevented B1R pro-nociceptive activity (papers #2 and 3). Finally, our data showed that systemic stimulation of TRPV1 with capsaicin upregulated B1R expression, mainly on microglia, through the increase of ROS and possibly cytokines (paper #4). Altogether, these data increased our knowledge related to B1R mechanism of induction and B1R activity. Also, these data shed light on new strategies to prevent B1R expression (TRPV1 blockade) and B1R deleterious activity (inhibition of microglia activation) in inflammatory and neuropathic pain.

La majorité des douleurs est d’origine nociceptive. En pharmacologie, le développement de stratégies pour évaluer et soulager de la douleur est au cœur du développement de plusieurs médicaments. Les vanilloïdes sont des ligands aux récepteurs TRPV1 des mammifères, récepteur ciblé pour le développement de nouvelles stratégies de prise en charge de la douleur. Nous avons utilisé Caenorhabditis elegans (C. elegans) du fait qu’il exprime des récepteurs orthologues au TRPV1 (OCR-2 et OSM-9) dont les mécanismes d’activation sont apparentés, sa simplicité structurale et le tier de ses cellules sont des cellules nerveuses. Les questions générales suscitées étaient : « Est-ce que C. elegans peut être utilisé comme organisme modèle afin de tester les effets antinociceptifs de ligands aux récepteurs vanilloïdes? » et « quels sont les cibles et mécanismes d’action des vanilloïdes? » Les objectifs étaient : 1) étudier les effets antinociceptifs de plusieurs vanilloïdes avec des caractéristiques chimiques distinctes ; 2) identifier leurs cibles moléculaires et ; 3) identifier les mécanismes moléculaires à l’aide de méthodes d’analyse protéomique et bioinformatique. Au cours de l’expérimentation, les nématodes traités à différentes concentrations de solution de vanilloïdes pendant 60 minutes sont exposés à la chaleur nocive (33˚C). Pour la première fois, nous avons démontré que les vanilloïdes ont un effet antinociceptif significatif et aucun effet rémanent chez C. elegans. Le phénotypage de mutants spécifiques aux récepteurs vanilloïdes nous a permis de déterminer que OCR-2 était la cible principale de la capsaicine; par contre, les résultats n’ont pas été concluants avec l’eugénol. En utilisant la technique du profilage thermique du protéome, une méthode plus raffinée, nous avons démontré qu’OCR-2 était la cible principale de la capsaicine et de l’eugénol. Nous avons exposé les nématodes à la chaleur nocive (33˚C), la capsaïcine (25 µM) et à l’eugénol (25 µM), des analyses protéomiques par HPLC-MS/MS à haute résolution ont été réalisé sur chaque extrait de protéome. La protéomique ascendante (bottom-up) a permis d’identifier, caractériser et quantifier plusieurs protéines différentiellement exprimées en fonction de chacun des traitements. Nos analyses bio-informatiques ont mis en évidence les processus biologiques significativement modulés entre les différentes conditions. Les analyses faites à partir de la base de données de REACTOME, laquelle a été réalisée à l’aide de l’interface Metascape en utilisant les protéines différentiellement exprimées (DEP), ont permis de mettre en évidence plusieurs processus importants en lien avec les effets antinociceptifs des vanilloïdes chez C. elegans. Ces résultats nous ont permis d’identifier que les voies de signalisation inflammatoires sont déclenchées par les effets agonistes de la capsaïcine et de l'eugénol sur les récepteurs vanilloïdes de C. elegans importants dans la réponse antinociceptive. Les voies de transduction du signal et d'initiation de la traduction sont intimement liées aux mécanismes de protection et de survie cellulaire. / Pain is a complex phenomenon with mostly nociceptive. In pharmacology, the development of strategies to assess and relieve pain is one of the central challenges of development of certain drugs. Vanilloids are ligands to the mammalian TRPV1 receptors, a targeted receptor for the development of new pain management strategies. We used Caenorhabditis elegans (C. elegans) because it expresses receptors orthologous to TRPV1 (OCR-2 and OSM-9) whose activation mechanisms are related, its structural simplicity and the third of its cells are nerve cells. In this study, the research questions addressed were: « Can C. elegans be used as a model organism to evaluate the antinociceptive effects of ligands targeting vanilloid receptors? » and « what are the targets and action mechanisms of vanilloids? » To study these questions, we setted the following objectives: 1) Investigate the antinociceptive effects of various vanilloids with chemical characteristics; 2) Identify the molecular targets of these vanilloids; and 3) Characterize their molecular mechanisms using proteomic and bioinformatics analysis methods. During the experiment, the nematodes treated with different concentrations of vanilloid solution for 60 min are exposed to harmful heat (33˚C). For the first time, we demonstrated that vanilloids have a significant antinociceptive effect and no residual effect in C. elegans. The present study yielded several significant findings. First, it demonstrated a substantial antinociceptive effect of vanilloids in C. elegans. Remarkably, this effect was observed without any residual effects. Moreover, we were able to identify OCR-2 as the primary target of capsaicin, a vanilloid compound. However, results for eugenol, another vanilloid, were inconclusive. To gain a more comprehensive understanding of the molecular mechanisms involved, we employed the thermal proteome profiling technique. This approach confirmed OCR-2 as the primary target for both capsaicin and eugenol. Proteomic analysis, conducted via high-resolution HPLC-MS/MS, allowed to identify, characterize, and quantify a range of proteins that were differentially expressed based on the treatment conditions. Bioinformatics were used to identify enriched biological processes and pathways. Using the REACTOME database and the Metascape interface, differentially expressed proteins (DEPs) were analyzed. This process revealed several vital processes significantly enriched in the context of the antinociceptive effects of vanilloids in C. elegans. These results allowed to shed light and identified that inflammatory signaling pathways are triggered by the agonist effects of capsaicin and eugenol are important in the antinociceptive response on C. elegans vanilloid receptors. Additionally, the signal transduction and translation initiation pathways appear to be closely linked to mechanisms of cell protection and survival.