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Strategien zur Gewebsreparatur durch Zelltransplantate erfordern die Verfügbarkeit einer ausreichenden Menge von Zellen, die Schaffung konduktiver Mikrokulturbedingungen für die Integration und die Entwicklung des Implantats und die Entwicklung reproduzierbarer chirurgischer Technik für die klinische Anwendung des kultivierten Transplantats. In der vorliegenden Arbeit wurden mehrere Techniken der Zelltransplantation entwickelt und tierexperimentell erprobt. Unter Verwendung von Alginat wurde eine neue sequentielle Zellkulturtechnik für Knorpeltransplantate entwickelt. Der optimale Kompromiß zwischen der Matrixstabilisierung und einer ausreichenden Diffusionskapazität für die Zellfunktion wurde bei einer Mischung aus 0,6 % Alginat und 4,5 % Fibrin gefunden. Weitere untersuchte Matrixstrukturen zur Transplantation von Chondrozyten, wie die bioresorbierbaren Polymere, das Kollagen-Fibrin-Gel besitzen gegenüber der gegenwärtig kommerziell genutzten Methode hinsichtlich des chirurgischen Prozederes bei vergleichbaren histologischen Ergebnissen Vorteile. Die histomorphologischen Veränderungen und die Entwicklung des Transplantats in vivo werden durch die spezifischen Bedingungen der Transplantatumgebung beeinflußt. Dabei ist ein vollständiges zonales und sequentielles Remodeling von Knorpel-Knochendefekten nur bei nicht ausdifferenzierten Zellen (embryonale Chondrozyten, periostale Zellen) zu erkennen, da diese Zellen ein exzellentes chondrogenes und osteogenes Potential besitzen. Transplantate unter Verwendung von Chondrozyten zeigen dagegen nur eine sehr geringe Rekonstruktion des subchondralen Knochens. Periostale Zellen sind in vitro ohne Verlust des Phänotyps amplifizierbar und stellen daher eine optimale Zellquelle für das Tissue Engineering dar. Für das Bone Engineering ist die Kombination der osteokonduktiven Eigenschaften unterschiedlicher Trägermaterialien mit Zellen, die ein osteogenes Potential besitzen ein neuer Weg zur Optimierung des Prozesses der knöchernen Rekonstruktion, wie in Versuchen zur Rekonstruktion segementaler Ulnadefekte bei Kaninchen gezeigt werden konnte. Die Herstellung eines präossären stabilen aber formbaren Transplantats mit vielfältigen klinischen Einsatzmöglichkeiten ist unter Verwendung von biodegradierbaren Polymeren und von Fibrinbeads realisierbar. Der Einsatz von Wachstumsfaktoren, wie TGF-?1 und die zunehmenden Erkenntnisse zu den Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen ermöglichen die verbesserte Generation ortsständigen Gewebes durch multipotente Zellen. Die immer komplexere und umfassendere Wiederholung der sich in der Ontogenese abspielenden Vorgänge durch die Techniken des Tissue Engineering, ermöglicht die Schaffung therapeutischer Optionen zur Behandlung von Knochen- und Knorpeldefekten, wo bisher keine existierten oder nur unzulänglich vorhanden waren. / Strategies for tissue repair by cell transplants require the availability of a sufficient amount of cells, the creation of conductive microculture conditions for the integration and development of the implant and the development of reproducible surgical techniques for the clinical application of the cultivated transplant. Within the frame of the present work, several techniques of cell transplantation were developed and tested by way of experiment. By using alginate, a new sequential cell culture technique was developed for cartilage transplants. The optimum compromise between the matrix stabilization and a sufficient diffusion capacity for the cell function was found with a mixture of 0.6 % of alginate and 4.5 % of fibrin. Further investigated matrix structures for the transplantation of chondrocytes, such as the bio-absorbable polymers, the collagen fibrin jelly show advantages compared with the method commercially applied at present regarding the surgical procedure with the gained histological results being comparable. The histomorphological changes and the development of the transplant within the living body are influenced by the specific conditions of the transplant environment. In this connection, a complete zonal and sequential remodeling of osteochondrodefects can only be detected for non-outdifferentiated cells (embryonic chondrocytes, periosteal cells) as these cells have an excellent chondrogenic and osteogenic potential. When using chondrocytes for transplants, however, the transplant only shows a very little restoration of the subchondral bone. Periosteal cells can be amplified in the living body without losing the phenotype, thus constituting an optimum cell source for tissue engineering. For the bone engineering, the combination of the osteoconductive properties of different carrier materials with cells having an osteogenic potential is a new way for optimizing the process of bone restoration as it was demonstrated in tests for the restoration of segmental ulnar defects occurring with rabbits. The generation of a preosteal stable, but mouldable transplant with manifold clinical possibilities of utilization can be realized by using biodegradable polymers and fibrin beads. The use of growth factors, such as TGF-?1, and the increasing knowledge of cell-cell and cell-matrix interactions enable the improved generation of stationary tissue by multipotent cells. The more and more complex and comprehensive repetition of processes going on in the ontogenesis by way of tissue engineering enables the creation of therapeutic options for the treatment of osteochondrodefects where hitherto none existed or just in a too small number.

Einleitung
 Defekte des hyalinen artikulären Knorpels führen häufig zur Ausbildung einer Arthrose, weshalb deren Therapie überaus wichtig ist. Ein vielversprechender Ansatz dafür ist das Tissue Engineering (T.E.) eines zonal aufgebauten Knorpelkonstrukts. Für die Verbindung eines solchen Konstrukts mit dem subchondralen Knochen des nativen Gewebes ist eine untere mineralisierte Knorpelzone von besonderer Bedeutung. Bisher ist es nicht gelungen die Mineralisation in vivo ohne Bildung von Knochengewebe und ohne längere In-vitro-Vorkultivierung auf die untere Zone zu beschränken. Um eine ausreichende Produktion von Extrazellularmatrix (EZM) bis zur Defektfüllung gewährleisten zu können ist die Formstabilität eines solchen Konstrukts ebenfalls wichtig. Ziele der Untersuchung
 Ziel dieser Studie war es, ein formstabiles bizonales Knorpelersatzgewebe mit einer oberen hyalinartigen Zone und einer unteren hypertrophen Knorpelzone zu generieren, bei dem sich die Mineralisation in vitro und in vivo auf die untere Zone beschränkt und die Bildung von Knochengewebe verhindert wird. Außerdem sollte die zonale Entwicklung so weit wie möglich in vivo ohne längere vorherige In-vitro-Kultivierung von statten gehen. Tiere, Material und Methoden
 Für die Herstellung von Knorpel-T.E.-Konstrukten wurde das Bioprinting von porzinen artikulären Chondrozyten (pACs) und porzinen Mesenchymalen Stromazellen (pMSC) etabliert (pAC: n=3, pMSC: n=4). Anschließend wurden nicht-zonale und zonale gedruckte Konstrukte mit gegossenen Konstrukten verglichen. Als Trägermaterial wurde starPEG/Heparin- (7,5x106 Zellen/ml, 50 % abbaubar, gedruckt: 19 μl, gegossen: 30μl) bzw. Fibrin-Hydrogel (7,5x106 Zellen/ml, gegossen: 30 μl) verwendet (nicht-zonal: n=2, zonal: n=3 bzw. 6). Als Alternative zum Einsatz eines Hydrogels für die untere Zone wurde die Herstellung Hydrogel-freier selbstkondensierter pMSC-Knorpelscheiben in der Transwellkultur (TWK) etabliert und ihr Potential zur hypertrophen Differenzierung untersucht. Anschließend wurde die In-vitro-Mineralisationskapazität der Knorpelscheiben (0,5x106 pMSC) mittels 5 verschiedenen Mineralisationsmedien über 4, 6 und 8 Wochen hinsichtlich der Mineralablagerung und des Erhalts der knorpeligen EZM getestet (n=6). Das Medium mit den besten Ergebnissen wurde für die In-vitro-Kultivierung der unteren Zone der zonalen Konstrukte verwendet. Zur Etablierung der In-vitro-Herstellung der oberen Zone wurden pAC-haltigen starPEG-Heparin- und Fibrin-Hydrogele in konventioneller und TW-Kultur über 6 Wochen chondrogen kultiviert (n=8/9). Zusammenfassung Zonale Konstrukte, bestehend aus einer unteren Knorpelscheibe (0,5x106 pMSC) und einem oberen pAC-haltigen Hydrogel (45μl, 20x106 pACs) aus gegossenem starPEG/Heparin (100 % abbaubar) bzw. Fibrin reiften anschließend über 6 Wochen sowohl unter In-vitro-Bedingungen in der TWK als auch nach subkutaner Implantation in 9 Mäusen (CB17/Icr-Prkdcscid/IcrIcoCrl) aus (n=9). Dabei wurde die Formstabilität, die Ablagerung von Kollagen Typ II, die Hypertrophie, der Mineralisationsgrad sowie die Beschränkung der Mineralisation auf die untere Zone mittels Vermessungen der Form, histologischen Färbungen und μCT-Scans untersucht. Die statistische Auswertung erfolgte mittels Mann-Whitney-U Test mit anschließender Bonferroni-Korrektur (SPSS 22.0.0.0). Als statistisch signifikant wurden dabei Signifikanzniveaus von p ≤ 0,05 angesehen. Ergebnisse
 Mittels Bioprinting von pMSC und pACs in starPEG/Heparin konnten stabile Hydrogele hergestellt werden. Das Bioprinting von starPEG/Heparin-Hydrogel zeigte allerdings keinen Vorteil gegenüber dem Gießen. Sowohl die gedruckten als auch gegossenen zonalen und nicht-zonalen Konstrukte zeigten eine mangelhafte Kollagen Typ II-Ablagerung der pMSC in starPEG/Heparin-Hydrogel. Fibrin-Hydrogel förderte die Kollagen Typ II-Ablagerung der pMSC, zeigte allerdings eine Kontraktion während der Kultivierung. Für die Herstellung von selbstkondensierten Knorpelscheiben aus pMSC als Alternative für die untere Zone hat sich das Waschen der Zellen in Phosphat- gepufferter Salzlösung (PBS) nach Monolayerkultur, die Verwendung von 0,5x106Zellen pro Transwell-Insert gelöst in PBS, die Kultivierung in 0,5 ml chondrogenem Medium (CHO) ohne TGF- β1 über die ersten 3 Tage im unteren Kompartiment und anschließender Kultivierung in 2 ml CHO mit 10 ng/ml TGF-β1 für weitere 18 Tage als optimal erwiesen. Mittels Kultivierung der Knorpelscheibe in Hypertrophen Medium konnte ein hoher Proteoglykangehalt und eine homogene Kollagen Typ X-Verteilung innerhalb der Knorpelscheiben erreicht werden. Für die in-vitro- Kultivierung der pAC-haltigen starPEG/Heparin- und Fibrin-Hydrogele wurde in der TWK eine bessere Formstabilität erreicht als in der konventionellen Kultur. Innerhalb der zonalen Konstrukte erreicht das Fibrin-Hydrogel eine bessere Formstabilität sowie eine höhere Mineralisationsstärke der unteren Zone unter In-vitro-Bedingungen als das starPEG/Heparin. Unter In-vivo-Bedingungen blieb die Mineralisation nur bei den starPEG/Heparin-Konstrukten auf die untere Zone beschränk. Die obere Zone der Fibrin-Hydrogele wurde unter In-vivo-Bedingungen vor der Explantation zu einem Großteil abgebaut. Die Mineralisation der unteren Zone sowie die Matrixablagerung in der oberen Zone eines bizonalen Knorpelersatzgewebes ist ohne vorherige In-vitro-Vorkultur unter der Verwendung des starPEG/Heparin-Hydrogels in dieser Arbeit gelungen. Schlussfolgerung
 Die Herstellung eines relativ formstabilen bizonalen Knorpelersatzgewebes mit einer oberen hyalinartigen nicht-mineralisierten und einer unteren mineralisierten Zone ohne Ausbildung von Knochengewebe konnte in dieser Studie erreicht werden. Dabei eignet sich die aus pMSC generierte Knorpelscheibe als untere Zone. Für die obere Zone ist ein pAC-haltiges starPEG/Heparin-Hydrogel aufgrund seiner Eigenschaft, die eine Mineralisation unterbindet, besonders vielversprechend. Fibrin-Hydrogel erwies sich, aufgrund des zu schellen Abbaus in vivo, als ungeeignet für die obere Zone zonaler Konstrukte. Da die Mineralisation der unteren Zone und die Matrixablagerung der oberen Zone nachweislich komplett in vivo stattfinden kann, ist eine vorherige In-vitro-Kultur der zonalen Konstrukte nicht notwendig.:1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Knorpelgewebe 2.1.1 Histogenese von Knorpelgewebe 2.1.2 Aufbau des Knorpelgewebes 2.1.3 Arten von Knorpelgewebe 2.2 Knorpeldefekte im Gelenk 2.2.1 Ursache, Einteilung und Auswirkung von Knorpeldefekten 2.2.2 Therapie von Knorpeldefekten 2.3 Knorpel-Tissue Engineering 2.3.1 Zellen im Knorpel-Tissue-Engineering 2.3.2 Trägermaterialien 2.3.3 Wachstumsfaktoren 2.3.4 Bioprinting 2.3.5 Zonales Knorpel-Tissue-Engineering 2.4 Tiermodell Maus 2.5 Problemstellung und Zielsetzung 2.5.1 Problemstellung 2.5.2 Zielsetzung 3 Tiere, Material und Methoden 3.1 Tiere 3.1.1 Versuchstiere und Tierhaltung 3.1.2 Ektope Konstruktimplantation 3.2 Material 3.3 Methoden 3.3.1 Zellbiologische Methoden 3.3.2 Bestimmung des Mineralisierungsgrades der Konstrukte (Micro-CT) 3.3.3 Bestimmung von Durchmesser und Dicke der Konstrukte 3.3.4 Histologische Untersuchungen 3.3.5 Statistische Auswertung 4 Ergebnisse 4.1 Differenzierungspotential porziner mesenchymaler Vorläuferzellen (pMSC) 4.2 Etablierung des Bioprinting von starPEG/Heparin-Hydrogelen mit porzinen Zellen 4.3 Matrixablagerung von pACs in gedruckten und gegossenen starPEG/Heparin- und gegossenen Fibrin-Hydrogelen 4.4 Chondrogenes Differenzierungspotential von pMSC in gedruckten und gegossenen starPEG/Heparin- und gegossenen Fibrin-Hydrogelen unter verschiedenen Medien- Supplementierungen 4.5 Vergleich gedruckter und gegossener zonaler starPEG/Heparin-Hydrogele mit gegossenen zonalen starPEG/Heparin-Fibrin-Hydrogelen 4.6 Etablierung der Herstellung der unteren Knorpelzone aus pMSC durch Selbstkondensation in Transwellkultur 4.7 In-vitro-Mineralisation von pMSC-haltigen Knorpelscheiben in verschiedenen Mineralisationsmedien 4.8 Etablierung der Herstellung der oberen Knorpelzone: EZM-Ablagerung und Formstabilität 4.9 Charakterisierung von in vitro generierten zonalen Knorpelkonstrukten 4.10 Charakterisierung zonaler starPEG/Heparin- und Fibrin-Konstrukte nach In-vivo-Reifung 5 Diskussion 5.1 Bioprinting nicht-zonaler und zonaler starPEG/Heparin-Hydrogelen mit porzinen Zellen 5.2 Etablierung der Herstellung selbstkondensierender formstabiler Knorpelscheiben aus pMSC 5.3 Effekte verschiedener Mineralisationsmedien auf die Matrixablagerung von pMSC in Knorpelscheiben 5.4 Etablierung der Herstellung und In-vitro-Kultivierung der oberen Knorpelzone: EZM- Ablagerung und Formstabilität 5.5 In-vitro-Vergleich von starPEG/Heparin- und Fibrin-Hydrogel zur Herstellung bizonaler Knorpelkonstrukte 5.6 In-vivo-Vergleich von starPEG/Heparin- und Fibrin-Hydrogel zur Herstellung bizonaler Knorpelkonstrukte 5.7 Fazit und Ausblick 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Literaturverzeichnis 9 Anhang 9.1 Methoden Bioprinting (zusätzliche Informationen) 9.2 Übersicht der Teilversuche zur Etablierung von Knorpelscheiben aus pMSC 9.3 Materialien 10 Danksagung

Artikulärer Knorpel weist ein geringes Selbstheilungspotential auf und aktuelle Methoden zur Therapie von Knorpeldefekten resultieren meist im Aufbau fibrösen, mechanisch inferioren Regenerationsgewebes. Deshalb wird stetig versucht neue Therapiemethoden zu entwickeln, die häufig auf Tissue Engineering basieren. Ein Ansatz sind biogedruckte Tissue Engineering Konstrukte, die es ermöglichen durch das „Eindrucken“ vitaler Zellen die komplexen zellulären Strukturen des Knorpelgewebes nachzubilden. Trotz vielsprechender Ergebnisse in vitro, scheitert die langfristige Regeneration von Knorpeldefekten mittels Tissue Engineering jedoch häufig an der mangelnden Fixierung und Integration der Konstrukte in das umliegende Gewebe. Besonders um biogedruckte Hydrogelkonstrukte, für die viele gängigen Fixierungsoptionen ungeeignet sind, für das Knorpel Tissue Engineering nutzbar zu machen, müssen daher neue Fixierungs- und Integrationsmethoden entwickelt werden. Als Ansatz zur Verbesserung der osteochondralen Integration von Knorpelersatzmaterialien wurde im Rahmen dieser Arbeit ein GDF-5 beladener Gewebekleber getestet. GDF-5, ein Knorpelmorphogenetisches Protein, kann die chondrogene Differenzierung sowie die Hypertrophie von Vorläuferzellen fördern. Durch den Einsatz eines GDF-5 beladenen Gewebeklebers sollen in den Defekt einwandernde, wirtseigene Progenitorzellen zur chondrogenen Differenzierung und Mineralisierung angeregt werden, mit dem Ziel eine mineralisierte Knorpelgewebsschicht zwischen der subchondralen Knochen-platte und dem implantierten Tissue Engineering Konstrukt zu generieren und so dessen Integration zu verbessern.