Le modèle cellulaire de magnétostimulation (MTS) développé dans l'équipe a permis d'obtenir des résultats préliminaires sur les essais de perméabilité endothéliale ainsi que sur les reconstructions et modélisation des fibres d'actine. Les premiers résultats en Magnétocytométrie (MTC) montrent une augmentation de rigidité cellulaire suite à une stimulation mécanique du tapis cellulaire. Les images confocales ont permis de mettre en évidence une restructuration des filaments d'actine dans les cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires (HPMEC) soumises au stress mécanique, ainsi qu'une relocalisation des VE-Cadhérines nécessaires aux jonctions intercellulaires. Ces deux résultats concordent avec l'apparition de 'gaps' ou trous inter cellulaires qui permettent d'expliquer l'augmentation de perméabilité mesurée entre les cellules soumises au stress mécanique et la situation contrôle. Des difficultés techniques retardent le travail et l'obtention de résultats en nombre important. Par exemple l'emploi de certaines techniques de marquages difficilement compatibles avec certains supports de culture. Cela empêche dans certains cas la confirmation visuelle de résultats obtenus par MTC. La viabilité cellulaire lors des expérimentation ne permet pas d’allonger les temps d’étude d’une même population cellulaire, ce qui limite certains résultats. Les premiers résultats sont à compéter par une étude plus approfondie des niveaux d'expression de facteurs pro-inflammatoires ainsi que des voies de signalisation et de régulation des VE-Cadhérines et des intégrines AlphaV-Beta3. L’effet de différentes molécules utilisées en clinique devrait être étudié sur le modèle de stress mécanique. / The cellular model of magnétostimulation ( MTS) developed in the team allowed to obtain preliminary results(profits) on the tries(essays) of endothéliale permeability as well as on the reconstructions and the modelling of the fibers of actine. The first results(profits) in Magnétocytométrie ( MTC) show an increase of cellular rigidity further to a mechanical stimulation of the cellular carpet(mat). The confocal images allowed to highlight a restructuring of the strands of actine in cells(units) microvascular lung endothéliales ( HPMEC) subjected(submitted) to the mechanical stress, as well as a relocation of the VE-Cadhérines necessary for the intercellular junctions. These two results(profits) suit to the appearance of ' gaps ' or holes inter cellular which allow to explain the increase.

Nonobstant d’immenses progrès accomplis depuis des décennies dans la prise en charge des patients soumis à la ventilation mécanique, les pneumonies acquises sous ventilation mécanique continuent de compliquer le séjour en réanimation de près de 28% des patients recevant une assistance respiratoire invasive prolongée. Parmi les malades des unités de soins intensifs, le risque de développer une pneumonie est de 3 à 10 fois supérieur chez les intubés sous ventilation. Elle reste cependant bien souvent le seul moyen de venir en aide aux patients souffrant de graves détresses respiratoires. Il a maintenant été clairement démontré que la ventilation mécanique, en particulier lorsqu’elle est mise en place selon des stratégies dites agressives, active les cellules pulmonaires conduisant alors à une réponse pro-inflammatoire même en l’absence de pathogène. Ce phénomène est connu sous le terme de biotrauma, et serait responsable en partie des lésions induites sur le poumon par la ventilation mécanique. En quelques sortes, la ventilation mécanique prépare les cellules épithéliales pulmonaires à répondre massivement à une seconde agression pro-inflammatoire par la libération de grandes quantités de cytokines (comme l’IL-8 notamment), accentuant alors les lésions du tissu pulmonaire essentiellement par le recrutement de polynucléaires neutrophiles attirés par la sécrétion massive d’IL-8. L’immunité innée joue donc un rôle très important dans le développement du VILI. L’implication des Toll Like Récepteurs a été suggérée par plusieurs études expérimentales. Par ailleurs, la ventilation en décubitus ventral a été décrite pour avoir des effets bénéfiques sur les patients ventilés souffrant de graves lésions pulmonaires particulièrement chez ceux souffrant du syndrome de détresse respiratoire aiguë. Notre équipe s’est particulièrement intéressée au TLR2, qui reconnait les bactéries à Gram-positif, car elle a montré dans des études précédentes in vitro que l’étirement cyclique de cellules pulmonaires humaines augmentait principalement l’expression de TLR2 ainsi que la réactivité de cellules pulmonaires à des composants de la paroi de bactéries à Gram positif. Ces données ont par la suite été confirmées dans un modèle in vivo de lapins ventilés dont la réponse immune innée était stimulée par du Pam3CSK4.Dans un premier projet, nous avons évalué l’impact d’une ventilation mécanique en décubitus ventral chez des lapins avec pneumonie unilatérale à Enterobacter aerogenes soumis à la ventilation mécanique. Nos résultats montrent que le décubitus ventral peut être protecteur si l’hôte est soumis à la ventilation mécanique dans le contexte d’une pneumonie bactérienne unilatérale.Pour vérifier la pertinence de nos hypothèses sur le TLR2 dans notre modèle animal de pneumonie acquise sous ventilation mécanique, nous avons mené des expériences avec des bactéries vivantes reconnues par le TLR2 (une souche de Staphylococcus aureus résistante à la methicilline SARM). Notre étude met en évidence qu’une ventilation mécanique modérément agressive impacte sur la clairance bactérienne pulmonaire en la diminuant, aggrave les lésions sur le tissu pulmonaire et favorise une réponse inflammatoire systémique. La surexpression du TLR2 tant au niveau pulmonaire que systémique pourrait expliquer ces résultats.Le troisième projet s’est attaché à évaluer l’impact d’une thérapie aux statines dans le contexte d’une pneumonie acquise sous ventilation mécanique à SARM, conjointement traitée par le linezolide, dans notre modèle animal de lapins ventilés. Nos résultats suggèrent qu’une pré-­‐exposition aux statines pourrait avoir un effet anti-inflammatoire au niveau pulmonaire et systémique dans ce modèle, qui pourrait passer par une régulation négative de l’expression de TLR2, contre-balançant les effets de l’étirement cyclique. / Despite major advances since decades in the management of ventilated patients, ventilator-associated pneumonia (VAP) continues to complicate the course of approximately 28% of the patients receiving mechanical ventilation (MV). Among patients hospitalized in intensive care units, the risk of pneumonia is 3- to 10- fold increased in MV patients. However, MV is often the only way to care for critically ill patients with respiratory failure. It has now been clearly demonstrated that MV, in particular adverse ventilatory strategies could activate lung cells, thus leading to a proinflammatory response, even in the absence of pathogen. This is the biotrauma paradigm, which accounts, at least in part, for the ventilator induced lung injury (VILI). In one way, MV primes airway cells to respond massively to a second proinflammatory insult, through the subsequent release of large amounts of cytokines (as interleukin (IL)‐ 8), thus leading to additional lung injury, particularly through the recruitment of neutrophils attracted by the massive release of IL-8. Accordingly, innate immunity plays an important role in the developement of VILI. The involvement of Toll-like receptors has been suggested by several experimental studies. Ventilation in the prone position (PP) has been described to have beneficial effects on patients under MV, especially in those with lobar involvement. Our team focused particularly on the TLR2, which interacts with Gram-positive bacteria, and we have previously demonstrated in vitro that cyclic stretch of human pulmonary cells resulted in TLR2 overexpression and enhanced TLR2 reactivity to Gram-positive cell wall components. We confirmed these datas in an in vivo model of ventilated rabbits which immune response had been stimulated with Pam3CSK4. In a first project, we assessed the impact of the PP on unilateral pneumonia to Enterobacter aerogenes in rabbits subjected to MV. Our results shows that the prone position could be protective if the host is subjected to MV and unilateral bacterial pneumonia. To ensure the relevance of our hypothesis on TLR2 in our animal model of VAP, we conducted experiments using live bacteria specifically recognized by TLR2 (Methicilin resist. aureus). We demonstrate that mild-­‐stretch MV impaired lung bacterial clearance, hastened tissue injury and promoted a systemic inflammatory response. Both pulmonary and peripheral blood TLR2 overexpression could account for such an impact. The third project assessed the impact of a statins therapy in the context of MRSA VAP, treated with linezolid, in our model of ventilated rabbits. Our results suggest that statin exposure prior to pneumonia provides an anti-­‐inflammatory effect within the lung and the systemic compartment of rabbits with MRSA VAP. Although LNZ enhances pulmonary bacterial clearance, dampening the host systemic inflammatory response with statin could impede defense against MRSA in this compartment. It could be subsequent to enhanced antibacterial defences and improvements in lung mechanics, thereby blunting overwhelming inflammation. In the last project, in collaboration with the University of Geneva, we assessed whether mitochondrial alarmins are released during VILI and can generate lung inflammation. Our results confirmed the hypothesis made and showed indeed that alarmins are released during during cyclic stretch of human epithelial cells, as well as in BAL fluids from rabbits ventilated with an injurious ventilatory regimen. These alarmins stimulate lung cells to produce bioactive IL-­‐1, and are likely to represent the proximal endogenous mediators of VILI and ARDS, released by injured pulmonary cells.

Dans le contexte actuel d’attentats et autres conflits armées, le risque lésionnel thoracique par explosion est exacerbé sans que pour autant l’on sache l’efficacité réelle des moyens actuels de protection thoracique individuelle face à une telle menace. Ce travail de thèse, combinant expérimentations et simulations numériques, a traité de front l’ensemble de la chaine physique entre la détonation d’une charge explosive et l’apparition de lésions pulmonaires. Un des premiers objectifs a été de comprendre les différents phénomènes physiques mis en jeu lors de la propagation de l’onde de choc en champ libre. Le large éventail de données expérimentales acquis a permis de développer des outils simples permettant la détermination des caractéristiques de la menace ainsi qu’une approche numérique robuste sous LS-DYNA. L’objectif suivant a été d’étudier l’interaction d’ondes de choc avec des cibles de géométries simples et de compositions différentes. L’analyse des données expérimentales acquises a permis, en plus de la validation numérique de l’interaction fluide-structure et des MEF des structures, de déterminer de possibles candidats pour la définition d’un critère de lésions thoraciques. Enfin, des essais sur réacteurs biologiques post-mortem ont été réalisés, permettant d’obtenir la réponse cinématique du thorax du modèle porcin sous blast. Tout ceci a permis d’aboutir à des voies d’amélioration et à des outils prometteurs pour permettre l’évaluation et l’évolution des systèmes de protection thoracique dans un futur assez proche afin de limiter les risques face à cette menace qui a gagné en importance ces dernières années. / With the increasing number of bombing attacks and armed conflicts, the risk of thoracic injuries caused by the blast threat is worsen, without knowing the efficiency of the current individual chest protection systems impacted by such a threat. This research, combining experiments and numerical simulations, dealt with the physics at play from the detonation of an explosive charge and the injury outcomes. One of the first objectives was to understand the different physical phenomena involved in the propagation of the shock wave in the open field. The huge set of data acquired allowed the development of simple tools for the determination of the blast characteristics as well as a robust numerical approach under LS-DYNA. The next objective was to study the interaction of shock waves with targets of simple geometries and different compositions. In addition to the numerical validation of the fluid-structure interaction and of the FEM of the structures, the analysis of the experimental data acquired allowed to determine possible candidates for the definition of a thoracic injury criterion. Finally, tests on biological post-mortem reactors have been carried out, which enabled to obtain the kinematic response of the swine’s thorax under blast. All this work has led to improvements and promising tools for the evaluation and the improvement of chest protection systems in the near future. The proposed tools should be used to limit the risks to this threat which has gained in importance in recent years.

L’ATP est bien connue pour son rôle de transporteur d'énergie à l’intérieur des cellules, mais en dehors de la cellule, elle agit en tant que molécule de signalisation extracellulaire. En se liant aux récepteurs purinergiques, l’ATP extracellulaire amorce la signalisation purinergique afin de réguler certains processus physiologiques et pathophysiologiques. Dans les poumons, l’ATP stimule la sécrétion de surfactant et promeut la clairance mucociliaire. Compte tenu du rôle critique de l’ATP extracellulaire dans les poumons, il est important de comprendre le mécanisme du relargage d’ATP cellulaire — la première étape de la signalisation purinergique. Parce que les forces mécaniques constituent le déclencheur principal du relargage d’ATP, cette thèse a pour but d’investiguer le(s) mécanisme(s) physiologique(s) et les sources cellulaires d’un tel relargage d’ATP mécanosensible. Cet ouvrage est divisé en trois parties : 1) Pour étudier les caractéristiques spatiales et temporelles du relargage d’ATP, j’ai développé une technique d’imagerie hautement sensible basée sur la bioluminescence de la luciférine-luciférase couplée avec un système de lentilles à grand champ de vision (WFOV, wide field of view) optimisant l’apport de lumière. Pour évaluer notre approche d’imagerie, j’ai soumis des cellules A549, dérivées d’un adénocarcinome pulmonaire humain, à un étirement ou un choc hypotonique de 50% pour déclencher un relargage d’ATP. J’ai démontré que notre technique nous permet de quantifier précisément la quantité et le taux (ou l’efflux) d’ATP s’échappant des cellules. Le WFOV constitue un outil essentiel utilisé dans les études décrites dans cette thèse pour déterminer le mécanisme et la source cellulaire du relargage d’ATP dans l’alvéole. 2) Afin d’examiner le mécanisme physiologique du relargage d’ATP induit par l’étirement dans les cellulaires alvéolaires primaires, j’ai déterminé les contributions individuelles des cellules alvéolaires de type 1 (AT1) en comparaison des cellules alvéolaires de type 2 (AT2). Pour ce faire, des cellules AT2 fraîchement isolées de poumons de rats ont été ensemencées sur une chambre flexible en silicone et cultivées jusqu’à sept jours, ce qui permettait aux cellules AT2 de se transdifférencier progressivement en cellules semblables aux cellules AT1. Le ratio des cellules alvéolaires (AT2:AT1), étant de 4:1 au jour 3, est devenu 1:4 au jour 7. La quantité d'ATP libérée diminuait avec le nombre décroissant de cellules AT2, les impliquant en tant que principale source pour le relargage d’ATP en réponse à un étirement. Alors que les modulateurs pharmacologiques des canaux d’ATP, carbenoxolone et probénécide, ne diminuaient pas la quantité d’ATP libérée, le BAPTA, un chélateur de calcium intracellulaire ([Ca2+]i), l’a significativement réduite. De même, ces trois modulateurs exercent des effets similaires sur les réponses calciques intracellulaires mesurées par le Fura-2, suggérant une connexion entre le relargage d’ATP et les niveaux de [Ca2+]i. 3) Pour explorer le rôle qu’ont les propriétés viscoélastiques de la membrane dans le relargage d’ATP mécanosensible, j’ai démontré qu’une déformation de 30% induisait un relargage d’ATP transitoire qui était accompagné d’une absorption d’iodure de propidium (PI, propidium iodide) chez des cellules AT2. Ceci est cohérent avec une rupture membranaire transitoire induite par une déformation, assez large pour le passage d’ATP et de PI. L’efflux d’ATP augmente aussi selon le taux de déformation, et la durée de déformation prolonge la demi-vie du relargage d’ATP. Donc, ces résultats fournissent des indices sur la manière dont l’étirement de la membrane viscoélastique peut mener au relargage d’ATP par un mécanisme alternatif impliquant une mécanoporation de la membrane cellulaire. Dans l’ensemble, ces résultats démontrent que le relargage d’ATP ne se produit pas à travers les canaux conduisant l’ATP mais plutôt par une mécanoporation transitoire de la membrane. D’autres études sur les dommages membranaires sont nécessaires pour mieux comprendre sa contribution dans le relargage d’ATP mécanosensible et les signaux de [Ca2+]i. De telles études élucideront la signalisation purinergique dans les organes qui sont constamment exposés à des contraintes physiques. Ceci pourrait suggérer des cibles/approches thérapeutiques pour moduler les impacts négatifs d’un relargage d’ATP excessif observés lors de certaines conditions pathologiques, telles que les lésions pulmonaires induites par la ventilation mécanique. / ATP is widely known to be an energy carrier within cells, but outside of the cell, it acts as an extracellular signaling molecule. Upon binding to purinergic receptors, extracellular ATP initiates the purinergic signaling to regulate certain physiological and pathophysiological processes. In the lungs, ATP stimulates surfactant secretion and promotes mucociliary clearance. Given the critical role of extracellular ATP in the lungs, it is important to understand the mechanism of cellular ATP release — the first step of purinergic signaling. Because mechanical forces constitute the primary trigger of ATP release, this thesis aims to investigate the physiological mechanism(s) and cellular sources of such mechanosensitive ATP release. This work is divided into three parts: 1) To study the spatial and temporal characteristics of ATP release, I developed a highly sensitive imaging technique based on luciferin-luciferase bioluminescence coupled with a custom-designed lens system, which combined a wide field of view (WFOV) and high light-gathering power. To evaluate our imaging approach, I subjected A549 cells, derived from human lung adenocarcinoma, to stretch or 50% hypotonic shock to trigger ATP release. I demonstrated that our technique allows us to precisely quantify the amount and the rate (or efflux) of ATP escaping from cells. The WFOV constitutes an essential tool used in the studies described in this thesis to determine the mechanism and cellular source of ATP release in the alveolus. 2) To examine the physiological mechanism of stretch-induced ATP release in primary alveolar cells, I determined the individual contributions of alveolar type 1 (AT1) in comparison with alveolar type 2 (AT2) cells. To this end, freshly isolated AT2 cells from rat lungs were seeded on a flexible silicone chamber and were cultured for up to seven days, which allowed AT2 cells to progressively transdifferentiate into AT1-like cells. The ratio of alveolar cells (AT2:AT1), being 4:1 on day 3, became 1:4 on day 7. The quantity of released ATP decreased with the decreasing numbers of AT2 cells, implicating them as the main source of ATP release in response to stretch. While pharmacological ATP channel modulators, carbenoxolone and probenecid, did not diminish the amount of ATP release, BAPTA, an intracellular calcium ([Ca2+]i) chelator, significantly reduced it. Likewise, these three modulators had similar effects on intracellular calcium responses measured by Fura-2, suggesting a connection between ATP release and [Ca2+]i levels. 3) To explore the role of membrane viscoelastic properties in mechanosensitive ATP release, I demonstrated that a 30% strain induced transient ATP release that was accompanied by uptake of propidium iodide (PI) in AT2 cells. This is consistent with a strain-induced transient membrane rupture, big enough for the passage of ATP and PI. ATP efflux also increases with strain rate, and hold time prolongs the half-life of ATP release. Thus, these results provide clues on how stretching of the viscoelastic membrane may lead to ATP release via an alternate mechanism involving transient mechanoporation of the cell membrane. Overall, these findings demonstrate that stretch-induced ATP release does not occur through ATP-conducting channels but rather a transient membrane mechanoporation. Further studies on membrane injury induced by strain are needed to better understand its contribution to mechanosensitive ATP release and [Ca2+]i signaling. Such studies will elucidate purinergic signaling in organs that are constantly exposed to physical stresses. This could suggest novel therapeutic targets/approach to modulate the negative impacts of excessive ATP release observed under certain pathological conditions, such as ventilator-induced lung injury.