O presente trabalho apresenta a determinacao da estrutura tridimensional da L-aminoacido oxidase do veneno de Bothrops atrox (BatroxLAAO) e sua avaliacao como potencial agente biotecnologico. Quanto a caracterizacao estrutural, a enzima BatroxLAAO (6 mg/mL) foi submetida a varios screenings e, por meio destas variacoes, obtivemos um resultado ideal para o crescimento dos monocristais sob a condicao de 0,05 M de sulfato heptahidratado de zinco, 15% (v/v) de Polietilenoglicol monometil eter 550, controle de pH 5 com 0,1M de cacodilato de sodio. A utilizacao de parafina e silicone resultou na melhora dos cristais, revelando cristais unicos e de coloracao amarela, o que permitiu o melhor crescimento e difracao desses cristais, a 2,3 .. Estes dados permitiram a determinacao de estrutura terciaria de BatroxLAAO e, portanto, melhor entendimento dos mecanismos de atuacao da mesma. A proteina foi obtida, atraves de passos cromatograficos, com rendimento medio de 1,54% do veneno bruto. Esta apresentou acentuada inibicao da proliferacao celular de celulas tumorais HL-60, JURKAT, PC12 e B16F10, principalmente nas maiores concentracoes (50 e 100 Êg/mL). Ainda, o tratamento de celulas PBMC com BatroxLAAO, demonstrou baixa citotoxicidade em relacao ao tratamento das celulas tumorais. A viabilidade celular da Leishmania sp. foi analisada apos o tratamento com BatroxLAAO. A adicao de BatroxLAAO diretamente as formas promastigotas de diferentes especies de Leishmania resultou em morte dos parasitas de forma dose-dependente. As especies L. major e L. donovani foram as mais susceptiveis ao efeito toxico de BatroxLAAO. O efeito toxico apresentado pela BatroxLAAO foi quase completamente abolido pela adicao de catalase, sugerindo que a liberacao de H2O2 esta diretamente envolvida com o efeito da enzima. A atividade bactericida foi avaliada pela inibicao do crescimento das cepas de E. coli e S. aureus apos tratamento com a BatroxLAAO. A proteina (37,5 Êg/mL) apresentou alta atividade fungicida contra Candida albicans, com 100% da inibicao do crescimento das cepas. Foi avaliada a atividade tripanomicida, onde BatroxLAAO mostrou-se potencialmente ativa sobre T. cruzi. Foram realizados experimentos para a producao de anticorpo monoclonal (anti-BatroxLAAO). O anticorpo produzido apresentou reatividade ate diluicao 1:60000. No entanto, apos a realizacao do teste de ELISA com o anticorpo produzido e outras L-aminoacidos oxidases de diferentes venenos de serpentes, averiguamos que o anti-BatroxLAAO nao tem especificidade unica, ocorrendo reatividade para todos os venenos e proteinas testadas. Foram realizados ensaios in vivo para a deteccao da expressao dos genes FAS, BAX e BCL2. Os dados obtidos sugerem que BatroxLAAO apresenta potencial biotecnologico bastante evidente nas acoes leishmanicida e fungicida, bem como na atividade antitumoral, in vitro, mostrando-se um composto com potencial agente terapeutico. / This work presents the determination of three-dimensional structure of L-amino acid oxidase from Bothrops atrox (BatroxLAAO) and its evaluation as a potential biotechnology agent. Regarding the structural characterization, BatroxLAAO (6 mg / mL) underwent multiple screenings, and through these variations, we got an ideal result for the single crystals growth under condition of 0.05 M zinc sulfate heptahydrate, 15 % (v / v) polyethylene glycol monomethyl ether 550, pH control: 5.0 with 0.1 M sodium cacodylate. The use of paraffin and silicone resulted in the improvement of the crystals, revealing single and yellow crystals, which allowed better growth and diffraction of these crystals, to 2.3 . These data allowed the determination of tertiary structure BatroxLAAO and therefore better understanding of action mechanisms of this protein. The protein was obtained using three chromatographic steps, with an average yield of 1.54% from crude venom. This showed marked inhibition of cell proliferation on tumor cells as HL-60, Jurkat, PC12 and B16F10, especially at higher concentrations (50 and 100 g / mL). Also, treatment of PBMC cells with BatroxLAAO showed low cytotoxicity in comparison to the treatment on tumor cells. Cell viability of Leishmania sp. was analyzed after treatment with BatroxLAAO. The addition of BatroxLAAO directly to promastigotes forms of different species of Leishmania resulted in a dose-dependent death. The species L. major and L. donovani were more susceptible to the toxic effect of BatroxLAAO. The toxic effect presented by BatroxLAAO was almost completely abolished by the addition of catalase, suggesting that the release of H2O2 is directly involved with the effect of this enzyme. The bactericidal activity was evaluated by inhibiting the strains growth of E. coli and S.aureus after treatment with BatroxLAAO. The protein (37.5 g / mL) showed high fungicidal activity against Candida albicans with 100% growth inhibition of strains. We evaluated the trypanocidal activity, where BatroxLAAO proved to be potentially active against the T. cruzi parasite. Experiments were carried out for production of monoclonal antibody (anti-BatroxLAAO). The antibody showed reactivity produced by dilution until 1:60000. However, after performing the ELISA assay with the antibody produced and other L-amino acidoxidases from different snake venoms, we found that anti-BatroxLAAO did not present unique specificity, BatroxLAAO reacted with all poisons and proteins tested. Experiments, in vivo, were performed to detect the gene expression of FAS, BAX and BCL2. These data suggest that BatroxLAAO presented quite evident biotechnologic potential as leishmanicidal, fungicidal and antitumoral, in vitro, agent. Further studies are needed to confirm the potential therapeutic use of this protein.

O presente trabalho apresenta a determinacao da estrutura tridimensional da L-aminoacido oxidase do veneno de Bothrops atrox (BatroxLAAO) e sua avaliacao como potencial agente biotecnologico. Quanto a caracterizacao estrutural, a enzima BatroxLAAO (6 mg/mL) foi submetida a varios screenings e, por meio destas variacoes, obtivemos um resultado ideal para o crescimento dos monocristais sob a condicao de 0,05 M de sulfato heptahidratado de zinco, 15% (v/v) de Polietilenoglicol monometil eter 550, controle de pH 5 com 0,1M de cacodilato de sodio. A utilizacao de parafina e silicone resultou na melhora dos cristais, revelando cristais unicos e de coloracao amarela, o que permitiu o melhor crescimento e difracao desses cristais, a 2,3 .. Estes dados permitiram a determinacao de estrutura terciaria de BatroxLAAO e, portanto, melhor entendimento dos mecanismos de atuacao da mesma. A proteina foi obtida, atraves de passos cromatograficos, com rendimento medio de 1,54% do veneno bruto. Esta apresentou acentuada inibicao da proliferacao celular de celulas tumorais HL-60, JURKAT, PC12 e B16F10, principalmente nas maiores concentracoes (50 e 100 Êg/mL). Ainda, o tratamento de celulas PBMC com BatroxLAAO, demonstrou baixa citotoxicidade em relacao ao tratamento das celulas tumorais. A viabilidade celular da Leishmania sp. foi analisada apos o tratamento com BatroxLAAO. A adicao de BatroxLAAO diretamente as formas promastigotas de diferentes especies de Leishmania resultou em morte dos parasitas de forma dose-dependente. As especies L. major e L. donovani foram as mais susceptiveis ao efeito toxico de BatroxLAAO. O efeito toxico apresentado pela BatroxLAAO foi quase completamente abolido pela adicao de catalase, sugerindo que a liberacao de H2O2 esta diretamente envolvida com o efeito da enzima. A atividade bactericida foi avaliada pela inibicao do crescimento das cepas de E. coli e S. aureus apos tratamento com a BatroxLAAO. A proteina (37,5 Êg/mL) apresentou alta atividade fungicida contra Candida albicans, com 100% da inibicao do crescimento das cepas. Foi avaliada a atividade tripanomicida, onde BatroxLAAO mostrou-se potencialmente ativa sobre T. cruzi. Foram realizados experimentos para a producao de anticorpo monoclonal (anti-BatroxLAAO). O anticorpo produzido apresentou reatividade ate diluicao 1:60000. No entanto, apos a realizacao do teste de ELISA com o anticorpo produzido e outras L-aminoacidos oxidases de diferentes venenos de serpentes, averiguamos que o anti-BatroxLAAO nao tem especificidade unica, ocorrendo reatividade para todos os venenos e proteinas testadas. Foram realizados ensaios in vivo para a deteccao da expressao dos genes FAS, BAX e BCL2. Os dados obtidos sugerem que BatroxLAAO apresenta potencial biotecnologico bastante evidente nas acoes leishmanicida e fungicida, bem como na atividade antitumoral, in vitro, mostrando-se um composto com potencial agente terapeutico. / This work presents the determination of three-dimensional structure of L-amino acid oxidase from Bothrops atrox (BatroxLAAO) and its evaluation as a potential biotechnology agent. Regarding the structural characterization, BatroxLAAO (6 mg / mL) underwent multiple screenings, and through these variations, we got an ideal result for the single crystals growth under condition of 0.05 M zinc sulfate heptahydrate, 15 % (v / v) polyethylene glycol monomethyl ether 550, pH control: 5.0 with 0.1 M sodium cacodylate. The use of paraffin and silicone resulted in the improvement of the crystals, revealing single and yellow crystals, which allowed better growth and diffraction of these crystals, to 2.3 . These data allowed the determination of tertiary structure BatroxLAAO and therefore better understanding of action mechanisms of this protein. The protein was obtained using three chromatographic steps, with an average yield of 1.54% from crude venom. This showed marked inhibition of cell proliferation on tumor cells as HL-60, Jurkat, PC12 and B16F10, especially at higher concentrations (50 and 100 g / mL). Also, treatment of PBMC cells with BatroxLAAO showed low cytotoxicity in comparison to the treatment on tumor cells. Cell viability of Leishmania sp. was analyzed after treatment with BatroxLAAO. The addition of BatroxLAAO directly to promastigotes forms of different species of Leishmania resulted in a dose-dependent death. The species L. major and L. donovani were more susceptible to the toxic effect of BatroxLAAO. The toxic effect presented by BatroxLAAO was almost completely abolished by the addition of catalase, suggesting that the release of H2O2 is directly involved with the effect of this enzyme. The bactericidal activity was evaluated by inhibiting the strains growth of E. coli and S.aureus after treatment with BatroxLAAO. The protein (37.5 g / mL) showed high fungicidal activity against Candida albicans with 100% growth inhibition of strains. We evaluated the trypanocidal activity, where BatroxLAAO proved to be potentially active against the T. cruzi parasite. Experiments were carried out for production of monoclonal antibody (anti-BatroxLAAO). The antibody showed reactivity produced by dilution until 1:60000. However, after performing the ELISA assay with the antibody produced and other L-amino acidoxidases from different snake venoms, we found that anti-BatroxLAAO did not present unique specificity, BatroxLAAO reacted with all poisons and proteins tested. Experiments, in vivo, were performed to detect the gene expression of FAS, BAX and BCL2. These data suggest that BatroxLAAO presented quite evident biotechnologic potential as leishmanicidal, fungicidal and antitumoral, in vitro, agent. Further studies are needed to confirm the potential therapeutic use of this protein.

Acidentes causados por animais peçonhentos representam um grave problema de saúde pública, principalmente em áreas de difícil acesso da população ao serviço de saúde. No Brasil, o gênero Crotalus é o gênero de serpente cuja peçonha apresenta o maior índice de letalidade. As L-aminoácido oxidases (LAAOs) estão presentes na peçonha crotálica e são flavoenzimas que catalisam a oxidação de L-aminoácidos, produzindo, concomitantemente, peróxido de hidrogênio e amônia. LAAOs têm demonstrado atividade citotóxica, antimicrobiana, antitumoral, antiparasitária e na agregação plaquetária. Os objetivos desse estudo incluíram o isolamento e a caracterização bioquímica da LAAO de C. d. terrificus, assim como a avaliação de seu potencial leishmanicida e da ativação de fibroblastos. Foram desenvolvidos dois protocolos para isolamento da LAAO. O primeiro consistiu em cromatografias de troca catiônica, filtração molecular e de interação hidrofóbica. O segundo protocolo diferiou do primeiro na terceira etapa (cromatografia de afinidade). Cromatografia de fase reversa da LAAO isolada demonstrou um alto grau de pureza e a separação do cofator FAD. A massa molecular da LAAO foi determinada por espectrometria de massas MALDITOF (58.702,196 Da). A caracterização estrutural dessa LAAO também incluiu a dedução da sua sequência primária e a localização do sítio de glicosilação e das ligações dissulfeto através de espectrometria de massas em equipamentos LC-MS/MS com diferentes tipos de fragmentação (HCD, ETD e EThcD). A sequência primária (498 resíduos) foi obtida após digestão da LAAO com diferentes proteases e o sítio de glicosilação foi localizado na Asn361. Análise por SDS-PAGE da LAAO em condições reduzida e reduzida/deglicosilada mostrou que cerca de 5% da massa da proteína é relativa à presença de açúcar. As ligações dissulfeto (Cys10-Cys171 e Cys331-Cys412) foram localizadas após digestão da enzima em pH ácido e análise por LC-MS/MS. A avaliação qualitativa da especificidade de substratos mostrou preferência por L-aminoácidos hidrofóbicos e, a ordem de especificidade (L-Phe>LLeu> L-Met>L-Trp>L-Ile) foi determinada através da cinética enzimática. A estabilidade da LAAO foi avaliada em diferentes temperaturas, tempos e condições de armazenamento. A enzima mostrou grande perda de atividade ao longo do tempo, sendo que a liofilização e o congelamento a -20 °C inibiram sua atividade completamente. A estabilidade térmica, avaliada pela técnica do Termofluor, mostrou que a LAAO é mais estável na presença de pH ácido, diferentes concentrações de substratos e ausência de NaCl. Promastigotas de Leishmania amazonensis foram estimulados com a LAAO (55 mUAE) e cerca de 30% dos parasitas foram mortos. Fibroblastos L929 também foram estimulados com a LAAO e em baixa concentração da enzima (1,83 mUAE) a viabilidade celular foi próxima de zero. Nas concentrações sem morte celular significativa, a ativação dos fibroblastos foi avaliada através da dosagem de óxido nítrico e citocinas, mas, em nenhum dos casos, houve ativação das células e maior produção desses compostos. Portanto, no presente estudo, foi isolada e caracterizada uma LAAO de C. d. terrificus que apresentou ação contra promastigotas de L. amazonensis e alta citotoxicidade para fibroblastos, sem causar a ativação dessas células / Acidents caused by venomous animals represent a serious publich health problem, mainly in remote areas where the acess to the health service is difficult. In Brazil, the genus Crotalus is the most lethal genus among the Brazilian snakes. The L-amino acid oxidases (LAAOs) are present in the venom from this genus and they are flavoenzymes that catalyze the oxidation of L-amino acids, producing hydrogen peroxide and ammonia concomitantly. LAAOs have been demonstrating many activities, including cytotoxic, antimicrobial, antitumor, antiparasitic and action on platelet aggregation. The main objectives of this study included the isolation and biochemical characterization of a LAAO from C. d. terrificus, and the evaluation of its leishmanicide potential and the fibroblasts activation. Two protocols were developed to the LAAO isolation from C. d. terrificus venom. First one consists in ionic exchange, gel filtration and hydrophobic interaction chromatographies. The second protocol has a modification in the third step which is affinity chromatography. Reverse-phase chromatography of the isolated LAAO showed high purity degree and the separation of FAD from the enzyme. The LAAO molecular mass was determined by MALDI-TOF mass spectrometry (58,702.196 Da). The structural characterization also included the deduction of primary sequence and the glycosylation site and disulfide bonds determinations through LCMS/ MS with different fragmentation modes (HCD, ETD, EThcD). The primary sequence (498 amino acid residues) was obtained after the LAAO digestion using different proteases. The glycosylation site was located in the Asn361. A SDS-PAGE analysis of reduced LAAO and reduced/deglycosylated LAAO showed that about 5% of the LAAO mass is due to the sugar presence. The disulfide bonds were determined after LAAO digestion at low pH and LC-MS/MS analysis. It showed bonds between Cys10-Cys171 and Cys331-Cys412. The qualitative evaluation of substrate specificity revealed preference for hydrophobic L-amino acids. The specificity order, determined through the kinetics evaluation, is L-Phe>L-Leu>LMet> L-Trp>L-Ile. The LAAO stability was evaluated at different temperatures, timecourse and storage conditions. The enzyme lost its activity over time, and lyophilization and freezing at -20 °C completely inhibited its activity. The thermal stability, evaluated by the Termofluor method, demonstrated that the best LAAO structural stability is achieved at acid pH, different substrate concentrations and at absence of NaCl. Leishmania amazonensis promastigotes were stimulated with LAAO (55 mEAU) and the parasites death was about 30%. The fibroblasts cell line L929 was also stimulated with LAAO, and at low concentration (1.83 mEAU) the cellular viability was close to zero. At lower concentrations, without significative cellular death, the fibroblast activation was evaluated through the nitric oxide e cytokines production, but none of the compounds were released. Therefore, in this study, a LAAO from C. d. terrificus venom was isolated and characterized. Moreover, this enzyme presented leishmanicide against L. amazonensis promastigotes and high cytotoxicity to fibroblasts, without the activation of these cells.

Nos moluscos sem concha ou naqueles em que a mesma estÃÂ presente na forma vestigial, como cefalÃÂpedes e gastrÃÂpodes opistobrÃÂnquios, a falta dessa proteÃÂÃÂo externa conduziu ÃÂ evoluÃÂÃÂo de mecanismos de defesa dominados pela secreÃÂÃÂo ou incorporaÃÂÃÂo de substÃÂncias quÃÂmicas bioativas. ProteÃÂnas sintetizadas de novo sÃÂo bons exemplos dessas molÃÂculas, tendo sido encontradas nas tintas de vÃÂrias espÃÂcies de lesmas do mar, particularmente do gÃÂnero Aplysia. Muitas jÃÂ revelaram pertencer a famÃÂlias de proteÃÂnas com atividade oxidÃÂstica de L-aminoÃÂcidos (LAAOs), grupo do qual fazem parte tambÃÂm proteÃÂnas bioativas encontradas nos venenos de serpentes. A caracterizaÃÂÃÂo, portanto, das atividades biolÃÂgicas e do perfil bioquÃÂmico dessas proteÃÂnas ÃÂ muito ÃÂtil para que possamos entender como se dÃÂo os mecanismos defensivos desses animais e quÃÂo difundidos esses sÃÂo, alÃÂm de proporcionar subsÃÂdios para sua aplicaÃÂÃÂo biomedicinal. Esse estudo visou a elucidaÃÂÃÂo dos mecanismos de aÃÂÃÂo da dactilomelina-P, proteÃÂna antibacteriana purificada da tinta de Aplysia dactylomela, e a comparaÃÂÃÂo da composiÃÂÃÂo protÃÂica e das atividades antimicrobianas das tintas liberadas por dois gastrÃÂpodes, A. dactylomela e Bursatella leachii, e por um cefalÃÂpode, Octopus sp.. O estudo revelou que a dactilomelina-P ÃÂ uma L-aminoÃÂcido oxidase capaz de oxidar L-lisina e L-arginina, com maior afinidade por L- arginina, com Km de 0,22 +- 0,16 mM/L para a L-lys e de 0,015 +- 0,01 Mm/L para a L-arg. Demonstrou tambÃÂm que sua atividade antibacteriana ÃÂ medida por esta propriedade, tendo o perÃÂxido de hidrogÃÂnio, gerado na oxidaÃÂÃÂo enzimÃÂticca, grande aprtipaÃÂÃÂo na inibiÃÂÃÂo bacteriana. A proteÃÂna se comporta de maneira bacteriostÃÂtica quando em meio nÃÂo suplementado com L-lisina e L-angilina, sendo bactericida na presenÃÂa destes. AlÃÂm disso, a atividade antibacteriana mostrou ser dependente da concentraÃÂÃÂo de aminoÃÂcidos disponibilizados para oxidaÃÂÃÂo pela proteÃÂna. A atividade Staphylococcus aureus deve ocorrer por meio de mecanismos que nÃÂo induzam danoso na morfologia celular, uma vez que nÃÂo foi observada qualquer alteraÃÂÃÂo morfolÃÂgica por microscopia de forÃÂa atÃÂmica. JÃÂ a anÃÂlise das trÃÂs tintas pro PAGE-SDS revelou a presenÃÂa, em todas elas, de bandas protÃÂicas de cerca de 60 kDa, alÃÂm de bandas de peso moleculares mais baixos. Por Western blot pode-se observar a existÃÂncia de identidade imunolÃÂgica entre proteinas das trÃÂs tintas, visto que anticorpos policlonais produzidos contra a dactilomelina-P reconheceram proteÃÂna(s) de cerca de 60 kDa na tinta de B. leachii e de cerca de 30 kDa na tinta de Octopus sp. Dentre as trÃÂs tintas, somente a tinta de A. dactylomela apresentou atividades antibacterianas e antifÃÂngica / In shelled molluscs or those in which it is present as vestigial as cephalopods and gastropods opistobrÃÂnquios, the lack of external protection led to the evolution of defense mechanisms dominated by the secretion or incorporation of bioactive chemicals. Proteins synthesized again are good examples of these molecules, were found in paints of various species of sea slugs, particularly the genus Aplysia. Many have already revealed belong to protein families with oxidÃÂstica activity of L-amino acids (LAAOs), a group which comprises also bioactive proteins found in snake venoms. The characterization therefore biological activities and biochemical profile of these proteins is very useful for us to understand how to give the defense mechanisms of animals and how widespread they are, in addition to providing subsidies to its application biomedicinal. This study aimed to elucidate the mechanisms of action of P-dactilomelina, antibacterial protein purified from Aplysia ink dactylomela, and comparison of protein composition and antimicrobial activities of paint released by two gastropods, A. dactylomela and Bursatella leachii, and a cephalopod, Octopus sp .. The study revealed that dactilomelina-P is an L-amino acid oxidase capable of oxidizing L-lysine and L-arginine, with a higher affinity for L-arginine, with a Km of 0.22 + - 0.16 mM / L for L -lys and 0.015 + - 0.01 mM / L L-arg. It also demonstrated that its antibacterial activity is measured by this property, with the hydrogen peroxide generated in the oxidation enzimÃÂticca, great aprtipaÃÂÃÂo in bacterial inhibition. The protein behaves in a non-bacteriostatic when supplemented with L-lysine and L-angilina, being in the presence of bactericidal. In addition, the antibacterial activity was shown to be dependent on the concentration of amino acids available for oxidation by the protein. Staphylococcus aureus activity must occur through mechanisms that do not induce damage to cell morphology, since we did not observe any morphological change by atomic force microscopy. The analysis of the three pro paint SDS-PAGE revealed the presence in them all, protein bands of about 60 kDa, and bands of lower molecular weight. For Western blot can observe the existence of immunologic identity between proteins of the three dyes, since polyclonal antibodies produced against P-dactilomelina recognized protein (s) of about 60 kDa in ink B. leachii and approximately 30 kDa in ink Octopus sp. Among the three dyes, only the ink of A. dactylomela showed antibacterial and antifungal activities

@font-face { font-family: "Arial"; }@font-face { font-family: "ＭＳ 明朝"; }@font-face { font-family: "Calibri"; }p.MsoNormal, li.MsoNormal, div.MsoNormal { margin: 0in 0in 0.0001pt; text-indent: 0.5in; line-height: 200%; font-size: 11pt; font-family: "Times New Roman"; }p.MsoBodyText, li.MsoBodyText, div.MsoBodyText { margin: 0in 0in 6pt; text-indent: 0.5in; line-height: 200%; font-size: 11pt; font-family: "Times New Roman"; }span.BodyTextChar { font-family: Calibri; }div.Section1 { page: Section1; } A 60 kDa monomeric protein isolated from the defensive purple ink secretion of the sea hare Aplysia californica has broad antimicrobial activity in tryptone peptone rich medium. This protein, which we call ‘escapin’, belongs to an L-amino acid oxidase family. The goals of my project were 1) to determine the products of escapin’s oxidation of its main substrate L-lysine, 2) to characterize the antimicrobial effects of escapin’s products, and 3) determine bactericidal mechanisms of action of these products. Escapin is a powerful bactericidal agent against several bacteria species including Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, and Vibrio harveyi. Escapin operates through a two-step process: 1) deamination of L-amino acids (especially L-lysine) by enzymatic activity to produce escapin intermediate products of L-lysine (EIP-K), hydrogen peroxide, and ammonia; and 2) EIP-K simultaneously reacts with hydrogen peroxide to generate escapin end products (EEP-K). EIP exists as an equilibrium mixture of the linear a-keto analogue of lysine and its cyclic forms, and the relative amount of the linear form increases with pH decreases. The powerful bactericidal effect of escapin requires the simultaneous presence of hydrogen peroxide and EIP-K in weak acidic conditions, which suggests that linear form of EIP-K with hydrogen peroxide is responsible for the bactericidal effect of escapin. Using E. coli MC4100 as a model, the mechanism of action of escapin was examined. Brief treatment with EIP-K + H2O2, but not EIP-K or H2O2 alone, causes irreversible DNA condensation with a time course similar to the bactericidal effect. A mutant strain resistant to EIP-K + H2O2 was isolated, and a single point mutation was found in the oxidative stress regulator gene (oxyR). Through a complementary assay, it was shown that wild type E. coli is conferred resistance to EIP-K + H2O2 by carrying mutated oxyR plasmid. Furthermore, in this bactericidal effect, heat or cold shock does not substitute for hydrogen peroxide induced oxidative stress. Thus, escapin’s powerful bactericidal effect may be through irreversible DNA condensation mediated through hydrogen peroxide generating an oxidative stress response, but the pathway mediating EIP-K’s synergistic effect is still unclear.