Les cellules iNKT et T CDS innées sont présumées contribuer à l'irnmunosurveillance (IS) des cancers et sont fonctionnellement déficientes dans la leucémie myéloïde chronique (LMC). Notre hypothèse était que ces défauts résultent de l'incapacité des cellules dendritiques myéloïdes (mDC) à les activer. Des analyses par cytométrie en flux et microscopie confocale ont révélé une baisse de l'expression membranaire de CD 1 d, qui présente les antigènes aux cellules iNKT, à la surface des mDC des patients LMC, par comparaison aux sujets sains. Ce défaut n'est associé ni à un défaut de maturation des mDC, comme le montre l'expression normale de HLA-DR et de CDS6, ni à une baisse d'expression intracellulaire de CDld ou de son transcrit. Ces résultats sont conciliables avec une rétention intracellulaire. Le traitement in vitro des mDC des patients LMC avec un inhibiteur de la protéine ROCK restaure partiellement l'expression de surface de CD 1 d et la présentation antigénique par CD Id, alors qu'il n'a eu aucun effet sur les mDC des sujets sains. Nous proposons que la protéine ROCK, qui est activée par le domaine DH-PH de BCR-ABL, interfere avec la réponse immunitaire dépendant des lymphocytes iNKT au cours de la LMC par régulation négative de l'expression membranaire de CDld des mDC. Le fait que les cellules iNKT et T CDS innées retrouvent des fonctions normales après rémission complète de la LMC est en faveur d'une génération de cellules T CD8 innées dépendante des cellules iNKT, comme décrit chez la souris. Notre travail suggère une implication des cellules iNKT et T CD8 innées dans l'IS de la LMC et révèle l'axe ROCK/mDC comme une nouvelle cible thérapeutique dans la maladie. / CDld-restricted iNKT cells and innate CD8 T cells are believed to play a key role in cancer immune surveillance and are functionally deficient in chronic myeloid leukemia (CML). Herein, we have hypothesized that this defect might originate from BCR-ABL-dependent dysfunctions in myeloid dendritic cells (mDC). Indeed, flow cytometry and confocal microscopy revealed that cell-surface expression of CDld was downregulated in CML mDC, relative to healthy donor (HD) controls. The decreased cell-surface display of CDld could not be ascribed to defective mDC differentiation, as attested by normal expression of HLA-DR and the CD86 maturation marker. On the other hand, reduced membrane expression was not associated with decreased intracytoplasmic levels of CDld or its mRNA transcripts, consistent with intracellular retention. ln vitro treatrnent of CML mDC with the Rho-associated protein Kinase (ROCK) inhibitor Y-27632 partially restored both cell-surface CDld expression and CDld-mediated antigen presentation, while it had no effect on HD mDC. We propose that ROCK, which is most likely activated by the DH-PH domain of BCR-ABL, mediates iNKT-cell immune subversion in CML patients by downregulating CDld expression on CML mDC. Remarkably, both iNKT cells and innate CD8 T cells retumed to nonnal after complete CML remission, a finding consistent with a iN KT cell-dependent generation of innate CD8 T cells, similarly to the observations in mice. Ali in ali, our study supports the possible contribution of iNKT/innate CD8 T cells to tumor surveillance in CML, and reveals the ROCK/mDC axis as a new potential target to restore immune surveillance in CML.

L’existance de cellules souches leucémiques (CSL) dans la Leucémie Myéloïde Chronique (LMC) prédit que que seule la destruction des CSL conduirait à une guérison. Une proportion importante de patients atteints de LMC développe une résistance aux drogues, environ ~ 30% des cas, Les mécanismes de résistance aux inhibiteurs de tyrosine kinase (TKI) dans la leucémie myéloïde chronique (LMC) restent souvent obscures. Les cellules souches leucémiques de la LMC pourraient rester viables et en repos, malgré la présence de facteurs de croissance ou de médicaments qui semblent les protéger de l'apoptose. Nous avons montré dans la première parti de cette étude que certains transporteurs telles ABCG2, hOCT-1 pourraient jouer un rôle avec le micro environnement dans la résistance des lignées LMC en adhésion au stoma médullaire. De plus, dans deuxième parti nous avons montré que le gène TWIST-1 (est un acteur clé de l'embryogenèse) est déréglementé dans les cellules de LMC innée des résistants à l'imatinib, et que la sur-expression de l’oncogène TWIST-1 pourrait représenter un nouveau facteur clé de pronostiques potentiellement utiles pour améliorer la guérison de LMC aux TKI. De plus, nous avons pu également montrer que le gène TP73 est impliqué dans la résistance des CSL de LMC. Ce gène pourrait être un facteur prédictif pour identifier une résistance potentielle des patients de LMC au moment du diagnostic. Nous avons montré également que ce gène est régulé par le micro-environnement. Nous avons montrés une sur-expression des isoformes tronquées dans les lignées LMC avec l’adhésion au stroma. Les résultats suggèrent que les molécules intrinsèques comme TWIST-1, les transporteurs et les isoformes de p73 sont dérégulées dans les CSL par des mécanismes extrinsèques qui interviennent avec le micro environnement leucémique par le mécanisme d’adhésion dans le phénomène de résistance aux traitements. Ce mécanisme spécial de résistance due à la conservation de ces CSL dans l’état immature en adhésion avec son micro environnement. / The existence of Leukemia stem cells (CSL) in chronic myelogenous leukemia (CML) predicts that only the destruction of CSL lead to a cure. A significant proportion of CML patients develop resistance to drugs, ~ 30% cases, mechanisms of resistance to tyrosine kinase inhibitors (TKI) in chronic myeloid leukemia (CML) often remain obscure. Leukemic stem cells of CML could remain viable and quiet, despite the presence of growth factors or drugs that seem to protect them from apoptosis. We have shown in the first part of this study that some carriers such as ABCG2, hOCT could to be play a role with the microenvironment in the resistance among CML adhesion of stoma Bone marrow. Furthermore, in the second part we showed that the gene TWIST-1 (is a key player of the embryogenesis) is deregulated in cells of CML innately resistant to imatinib, and that overexpression of the oncogene TWIST-1 could represent a new prognostic factor key potentially useful for improving the querison CML to TKI. In addition, we also could show that the TP73 gene is involved in the resistance of CSL CML. This gene could be a predictor to identify potential resistance of CML patients at diagnosis. We have also shown that this gene is regulated by the microenvironment. We have shown an overexpression of truncated isoforms in CML cell lines with the accession to the stroma. The results suggest that intrinsic molecules such as TWIST-1 carriers and p73 isoforms are deregulated in CSL by extrinsic mechanisms involved with the leukemia microenvironment by the mechanism for participation in the phenomenon of drug resistance. This mechanism with its microenvironment.

La leucémie myéloïde chronique (LMC) est une hémopathie maligne caractérisée par un syndrome myéloprolifératif. Elle est secondaire à la formation d’un gène chimérique BCR-ABL dont le produit de ce gène de fusion est une protéine possédant une activité tyrosine kinase dérégulée, nécessaire et suffisante à la leucémogénèse. Plusieurs arguments suggèrent l’implication des cellules du système immunitaire dans le contrôle de la LMC.Nous avons montré que les lymphocytes Natural Killer T invariant (iNKT), une population minoritaire de lymphocytes T non conventionnels impliqués dans l’immunosurveillance, sont anergiques chez les patients en phase chronique (LMC-PC). Ce défaut est corrigé chez les patients en rémission cytogénétique complète après traitement par Imatinib Mesylate (LMC-IM) ou IFN-α.Les lymphocytes iNKT sont impliqués chez la Souris dans la génération de cellules T CD8+ « innate-memory », une autre population de lymphocytes T innés découverte récemment chez la Souris. Nous avons mis en évidence chez l’Homme, l’existence d’une population de cellules T ayant un phénotype inné et mémoire, exprimant fortement le facteur de transcription Eomesodermine et capable de produire rapidement de l’IFN-γ en réponse à une stimulation innée par les interleukines (IL)-12 et IL-18.Cette population de cellules est déficiente sur le plan numérique et fonctionnel chez les patients LMC-PC. Ces défauts sont partiellement corrigés chez les patients LMC-IM.L’ensemble de ces résultats souligne le rôle des lymphocytes T innés dans l’immunité anti-leucémique et pourrait permettre le développement de stratégies d’immunothérapies ciblées contre la LMC. / Chronic myeloid leukemia (CML) is a myeloproliferative disorder that results from dysregulated tyrosine kinase activity of the fusion oncoprotein BCR-ABL, which is sufficient to induce malignant transformation. A critical role of the immune system in the control of CML is supported by several reports. Invariant Natural Killer T (iNKT) lymphocytes are a population of non-conventional T cells that are believed to play a key role in cancer immunosurveillance. Here, we showed that CML in chronic phase is associated with anergy of iNKT cells that is restored upon complete cytogenetic remission (CCyR) following Imatinib Mesylate (IM) or IFN-α therapy. In mouse, iNKT cells are involved in the generation of a recently characterized subset of innate CD8 T cells. Importantly, we provided definitive evidence of the existence of an equivalent of these innate CD8 T cells in humans, harboring innate and memory phenotype with high Eomesodermin expression. These cells also exhibited innate functions such as prompt IFN-γ expression in response to innate stimulation by interleukin (IL)-12 and IL-18 and cytolytic activity in a TCR independent manner.Size and functions of this innate-like CD8 T cell subset were severely impaired in CML patients at chronic phase. These defects were partially reversed in patients who achieved CCyR following IM treatment.Altogether, these results reveal a possible contribution of innate CD8 T lymphocytes in anti-leukemic immunity and should contribute to development of immunotherapeutic strategies against CML.

<p>This thesis describes the implementation of a real-time, full search, 16x16 bidirectional motion estimation at 24 frames per second with the record performance of 155 Gop/s (1538 ops/pixel) at a high clock rate of 125 MHz. The core of bidirectional motion estimation uses close to 100% FPGA resources with 7 Gbit/s bandwidth to external memory. The architecture allows extremely controlled, macro level floor-planning with parameterized block size, image size, placement coordinates and data words length. The FPGA chip is part of the board that was developed at the Institute of Computer & Communication Networking Engineering, Technical University Braunschweig Germany, in collaboration with Grass Valley Germany in the FlexFilm research project. The goal of the project was to develop hardware and programming methodologies for real-time digital film image processing. Motion estimation core uses FlexWAFE reconfigurable architecture where FPGAs are configured using macro components that consist of weakly programmable address generation units and data stream processing units. Bidirectional motion estimation uses two cores of motion estimation engine (MeEngine) forming main data processing unit for backward and forward motion vectors. The building block of the core of motion estimation is an RPM-macro which represents one processing element and performs 10-bit difference, a comparison, and 19-bit accumulation on the input pixel streams. In order to maximize the throughput between elements, the processing element is replicated and precisely placed side-by-side by using four hierarchal levels, where each level is a very compact entity with its own local control and placement methodology. The achieved speed was further improved by regularly inserting pipeline stages in the processing chain.</p>

This thesis describes the implementation of a real-time, full search, 16x16 bidirectional motion estimation at 24 frames per second with the record performance of 155 Gop/s (1538 ops/pixel) at a high clock rate of 125 MHz. The core of bidirectional motion estimation uses close to 100% FPGA resources with 7 Gbit/s bandwidth to external memory. The architecture allows extremely controlled, macro level floor-planning with parameterized block size, image size, placement coordinates and data words length. The FPGA chip is part of the board that was developed at the Institute of Computer &amp; Communication Networking Engineering, Technical University Braunschweig Germany, in collaboration with Grass Valley Germany in the FlexFilm research project. The goal of the project was to develop hardware and programming methodologies for real-time digital film image processing. Motion estimation core uses FlexWAFE reconfigurable architecture where FPGAs are configured using macro components that consist of weakly programmable address generation units and data stream processing units. Bidirectional motion estimation uses two cores of motion estimation engine (MeEngine) forming main data processing unit for backward and forward motion vectors. The building block of the core of motion estimation is an RPM-macro which represents one processing element and performs 10-bit difference, a comparison, and 19-bit accumulation on the input pixel streams. In order to maximize the throughput between elements, the processing element is replicated and precisely placed side-by-side by using four hierarchal levels, where each level is a very compact entity with its own local control and placement methodology. The achieved speed was further improved by regularly inserting pipeline stages in the processing chain.

Voltage-driven translocation, the core concept of nanopore sensing for biomolecules, has been extensively studied in silico and in vitro over the past two decades. However, the theories of analyte capture are still not complete due to the complex dynamics resulting from the coupling of multiple physical processes such as di usion, electrophoresis, and electroosmotic flow. In this thesis, I build and design translocation simulations for analytes ranging from point-like particles to rod-like molecules and long flexible polymers. The primary goal is to test, clarify and complete the existing capture theories. For example, we revisit and revise the existing definitions of the capture radius, clarify the concept of depletion zones, and investigate the impacts of the flat field near the pore. Earlier theories of translocation underestimate the importance of the electric field out- side the nanopore. In our work, we analyze the non-equilibrium dynamics during the cap- ture process originating from the converging field lines, i.e., rod orientation and polymer deformation. We characterize the rod orientation and quantify its impact on capture time both with and without Electrohydrodynamic interactions. We investigate the polymer chain deformation and calculate the translocation time by taking the electric field outside the nanopore into account as opposed to the conventional simulation approaches. Besides nanopore sensing, there are many undiscovered possibilities for nanopore trans- location technologies. We test two proof-of-concept ideas in which we suggest to use capture and translocation to separate molecules of di erent physical properties. For example, we show how one could selectively capture particles sharing the same mobility but di erent di usion coe cients using a pulsed field. Moreover, we demonstrate that it is possible to build a ratchet using pulsed fields and a nanopore to change the concentration ratios of a polymer mixture of different sized polyelectrolytes.

Les cellules dendritiques (CD) et l'interleukine-7 (IL-7) sont deux facteurs essentiels au développement et à l'homéostasie des lymphocytes T. Une anomalie de la production ou de la signalisation de l’IL-7 est associée à un défaut de la thymopoïèse en plus d’une profonde lymphopénie. Parallèlement, la déficience des CD, entraine une rupture de la tolérance au soi menant au développement de maladies auto-immunes et une altération de l’homéostasie des Lymphocyte T. Dans le cadre de cette thèse, nous nous sommes intéressés globalement à la contribution de l’IL-7 et des CD dans la reconstitution et l'homéostasie des lymphocytes dans deux contextes thérapeutiques différents. Premièrement, il a été démontré que le traitement avec l'imatinib (médicament utilisé pour traiter la leucémie myéloïde chronique (LMC)) induisait une diminution du nombre de lymphocytes T chez les patients atteints de LMC. À partir de notre étude in vitro sur des cellules mononuclées du sang périphérique (peripheral blood mononuclear cells) (PBMC) humaines cultivées en présence d’imatinib avant d’être stimuler par l’IL-7 à différentes concentrations, nous avons mis en évidence une perturbation de la signalisation de l’IL-7 dans les lymphocytes T suite à une interférence avec l’imatinib. À l’aide de notre modèle murin traité à l’imatinib, nous avons également montré in vivo, une altération de l’homéostasie des lymphocyte T. La modulation négative de l’homéostasie des LT par l’imatinib est également accompagnée d’une diminution dramatique de la proportion des CD, ce qui pourrait également faire décliner le pool des lymphocyte T. Deuxièmement, dans un contexte de greffe de moelle osseuse (MO) syngénique, nous avons analysé la contribution de l’IL-7 produite par les CD, dans la thymopoïèse et l’homéostasie des lymphocyte T. Pour évaluer la contribution de l’IL-7 produite par les cellules hématopoïétiques dans la reconstitution et l’homéostasie lymphocytaire T, nous avons généré des chimères de MO avec une production d’IL-7 exclusivement limitée aux cellules stromales, par greffe de MO IL-7-/- dans des souris Rag -/-. Les souris Rag -/- transplantées avec des cellules de MO IL-7 - /- développent une maladie auto-immune systémique létale à 4-5 semaines post greffe. Nos résultats suggèrent fortement une contribution cruciale de l’IL-7 produite par les CSH (Cellules Souches Hématopoïétiques) dans la reconstitution immunitaire après greffe de MO. L’ensemble de nos travaux contribue à élargir la compréhension de la biologie de l'axe IL-7/ IL-7Rα et des CD dans le développement et l’homéostasie des lymphocytes T. / Dendritic cells (DCs) and interleukin-7 (IL-7) are two factors essential for the development and homeostasis of T lymphocytes. An abnormality in the production or signaling of IL-7 is associated with a defective thymopoiesis and severe lymphopenia. DCs deficiency leads to a breakdown in self-tolerance leading to the development of autoimmune diseases and impaired T cells homeostasis. In this thesis, we have focused on the contribution of IL-7 and DCs in the reconstitution and homeostasis of lymphocytes in two different therapeutic contexts. Firstly, imatinib (drug used to treat chronic myeloid leukemia (CML)) has been shown to induce a decrease of T lymphocytes number in patients with CML. From our in vitro study on human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) cultured in the presence of imatinib before stimulation by IL-7 at different concentrations, we demonstrated a disruption of IL-7 signaling in T cells following interference with imatinib. Using our imatinib-treated mouse model, we also showed in vivo impaired T cells homeostasis. The negative modulation of T lymphocytes homeostasis by imatinib is also accompanied by a dramatic decrease in the proportion of DCs, which could also decline T cells pool. Secondly, we used murine syngeneic bone marrow transplantation (BMT) models to study the contribution of IL-7 produced by DCs in thymopoiesis and T cells homeostasis. To assess the role of IL-7 produced by DCs in T cell reconstitution and homeostasis, we generated BM chimeras with IL-7 production exclusively limited to stromal cells, by BMT of IL-7 - / - into Rag - / - mice. Rag - / - mice transplanted with IL-7 -/- BM cells develop a lethal systemic autoimmune disease post-transplant at 4-5 weeks post-BMT. Our results strongly suggest a major contribution of Hematopoietic stem cells (HSC)-produced IL-7 in immune reconstitution after BM transplantation. Our work contributes to expanding our understanding of the biology of the IL-7 / IL-7Rα axis and DCs in T cell development and homeostasis.