Des mutations acquises du gène TET2 ont été décrites dans les hémopathies malignes humaines. La fréquence de ces anomalies dans les hémopathies myéloïdes est de 10 à 20%, atteignant 50% dans les échantillons de leucémies myélo-monocytaires chroniques (LMMC). Les mutations observées sont inactivatrices, ce qui suggère que TET2 est un gène de type suppresseur de tumeur et que les mutations retrouvées conduisent à une perte de fonction de la protéine. Ce gène code pour une enzyme capable de modifier les cytosines méthylées. Il participerait ainsi au contrôle de la méthylation de l'ADN et donc à la régulation épigénétique de l’expression génique. Afin de mieux comprendre son rôle au cours de l’hématopoïèse, deux modèles murins d'inactivation du gène Tet2 ont été développés. Des expériences de greffe de cellules médullaires dans des souris syngéniques montrent que les cellules déficientes pour ce gène présentent un avantage compétitif par rapport aux cellules sauvages. L’analyse des souris invalidées pour ce gène montre une amplification des populations hématopoïétiques immatures, ainsi que des anomalies de la différenciation des lignages myéloïdes et également des lignages lymphoïdes. Une fraction des souris invalidées pour Tet2 âgées de plus de six mois développe des hémopathies malignes ressemblant à la LMMC humaine. Des anomalies équivalentes sont retrouvées dans les souris hémizygotes pour Tet2 et dans des souris portant un allèle hypomorphe du gène. L’ensemble de ces résultats montre qu’une dérégulation de l'activité de Tet2 conduit à des anomalies précoces de l'hématopoïèse, mais n'entraine pas directement la transformation des cellules progénitrices immatures. La latence du développement de ces tumeurs suggère la nécessité d'une coopération avec d'autres évènements oncogéniques, comme des anomalies d’autres acteurs épigénétiques / Acquired loss-of-function mutations of TET2 gene are frequently observed in patients with myeloid malignancies, including acute myeloblastic leukemia, myeloproliferative neoplasm, myelodysplastic syndrome, and chronic myelomonocytic leukemia (CMML). The Ten-Eleven-Translocation (TET) family proteins are 2-oxoglutarate/Fe(II)-dependent dioxygenases that catalyze the conversion of 5-methyl-cytosine into 5-hydroxymethyl-cytosine, which is proposed to constitute a first step toward cytosine demethylation. To study the function of Tet2 in murine hematopoiesis, we developed two mouse models in which the catalytic domain of the protein is disrupted. In both models, Tet2 deficiency leads to the progressive expansion of the immature hematopoietic compartment that includes stem cell and multipotent progenitors. In addition, both Tet2-deficient animals display abnormalities of erythroid, megakaryocytic, myelo-monocytic and lymphoid lineages, recapitulated in competitive transplantation assays. With age, Tet2-deficient mice develop bona fide myeloid tumors. All these properties were shown to be cell-autonomous by bone marrow cells transplantation and in vitro assays. Together these data suggest that TET2 activity is essential for normal homeostasis of the hematopoietic system. Its inactivation results in the development of hematologic disorders resembling human CMML myeloid disorders. TET2 deficiency endows the cells with a competitive advantage over wild type cells, induces hematopoietic differentiation abnormalities but is not responsible for full cellular transformation. The latency observed for CMML development in mouse models of Tet2 deficiency suggests a requirement for cooperating mutations, such other epigenetic regulator alterations.

La leucémie myélomonocytaire chronique (LMMC) est une hémopathie myéloïde rare attribuée à l’accumulation d’évènements génétiques et épigénétiques dans une cellule souche ou progénitrice hématopoïétique. Les altérations génétiques somatiques récurrentes qui caractérisent cette maladie ont été identifiées: elles associent des altérations cytogénétiques non spécifiques chez 30% des patients et des mutations des gènes de la régulation épigénétique, de l’épissage, de la signalisation et de la transcription. Si certaines mutations influencent le phénotype (les mutations de RUNX1 génèrent une thrombopénie, celles de la signalisation une maladie proliférative, celles de KIT une mastocytose), elles ne sauraient résumer à elles seules l’expression phénotypique de la maladie. D’ailleurs, les médicaments hypométhylants restaurent une hématopoïèse équilibrée en modifiant le contexte épigénétique des cellules malades sans les éliminer. Il n’existe pas de lignée cellulaire de LMMC et les modèles murins n’en récapitulent que très partiellement les caractéristiques. L’objectif de mon travail de thèse a été de générer des cellules modélisant la maladie. J’ai transformé les cellules CD34+ de 2 patients en clones de cellules souches induites reprogrammées. Les clones obtenus à partir de l’un des patients ont été écartés du fait d’altérations génétiques supplémentaires acquises lors de la reprogrammation. Nous avons focalisé nos travaux sur 5 clones établis à partir des cellules CD34+ de l’autre patient et de 5 clones établis à partir de cellules CD34+ de deux sujets sains. Nous avons capturé 2 étapes de l’évolution moléculaire du clone, sans puis avec mutation KRASV12G. La différenciation hématopoïétique de ces clones en milieu semi-solide ou liquide récapitule les principales caractéristiques phénotypiques de la maladie. Par édition de gènes, nous avons ajouté dans certains clones la mutation SRSF2P95H observée dans les cellules de 50% des patients atteints de LMMC mais absente des cellules de la patiente étudiée. Nous montrons que l’hétérogénéité fonctionnelle et épigénétique des clones obtenus dépasse la seule hétérogénéité génétique et que la decitabine, un agent hypométhylant, a un effet cytotoxique faible mais améliorer l’équilibre de la production des cellules hématopoïétiques matures par des cellules génétiquement altérées. / Chronic myelomonocytic leukemia (CMML) is a rare hematological malignancy that has been related to the accumulation of genetic and epigenetic alterations in a hematopoietic stem or progenitor cell. Somatic recurrent mutations of coding DNA sequences have been in CMML cells, combining non-specific cytogenetic aberrations in 30% of the patients and mutations in epigenetic regulator, signal transduction, spliceosome and transcription factor genes. While some of these mutations directly affect disease phenotype (mutations in RUNX1 and thrombocytopeny, mutations in signaling pathways and proliferative disease, mutations in KIT and mastocytosis), they do not sum up the complex disease phenotype of this pathology on their own. Accordingly, hypomethylating agents restore a balanced hematopoiesis without eliminating clonal cells. There is no CMML cell line and murine models only partially recapitulate the disease. The objective of my thesis work was to reprogram hematopoietic stem/progenitor cells in order to model the disease heterogeneous expression. The clones established from one patient cells were discarded as their genetic background had been altered by reprogramming and cell culture. We analyzed in more details the behavior of 5 induced pluripotent stem cell lines established from a second patient and 5 other clones established from 2 healthy donor cells. We had captured 2 distinct genetic backgrounds of the patient clone, without or with KRASG12D mutation. Hematopoietic differentiation of these clones in semi-solid and liquid medium recapitulated the main characteristics of disease phenotype. With a gene editing tool, we introduced in some clones the SRSF2P95H mutation, observed in 50% of patient with CMML but missing in the studied patient. We noticed that functional and epigenetic heterogeneity of the clones exceeded their genetic heterogeneity and that the demethylating agent decitabine had limited cytotoxic effect but restored a more balanced production of hematopoietic cells by genetically abnormal cells.

Mon travail de thèse s'est intéressé au rôle des protéines Dok-1 et Dok-2 dans l'hématopoïèse physiologique chez la CSH et dans l'hématopoïèse pathologique dans le cas de la leucémie myélomonocytaire chronique (LMMC). Ce sont des régulateurs négatifs de la voie de signalisation RAS/MAPK, activée en réponse à des facteurs activant les récepteurs tyrosine kinase. La double inactivation des gènes Dok1 et Dok2 (Dok DKO) cause un syndrome myéloprolifératif assimilé à la forme myéloproliférative (MP) de la LMMC. Les anomalies génétiques de la LMMC identifiées sont nombreuses et souvent non spécifiques. Le gène RAS est cependant retrouvé muté dans 30% des cas de LMMC MP. Nous avons identifié des variants nucléotidiques de DOK1 et DOK2. La mutation DOK2 L238P a fait l'objet d'études fonctionnelles démontrant qu'il s'agit d'un mutant perte de fonction haplo-insuffisant, induisant une augmentation de la prolifération cellulaire, corrélée avec la LMMC MP.J'ai également étudié l'hématopoïèse précoce du modèle murin Dok DKO, me permettant de démontrer que ces protéines sont des régulateurs de la quiescence des CSH et du cycle cellulaire des progéniteurs myéloïdes engagés dans la différenciation.Les protéines Dok-1 et Dok-2 jouent un rôle dans la régulation de la quiescence et la prolifération des CSH et des progéniteurs hématopoïétiques. Leur dérégulation pourrait jouer un rôle dans la pathogenèse de la LMMC, attestant leur fonction de suppresseur de tumeur. Il serait intéressant de lier leur fonction chez la CSH à la LMMC en elle-même et de mieux définir les mécanismes par lesquels les protéines Dok-1 et Dok-2 interviennent dans la leucémogenèse. / My work focused on the roles of Dok-1 and Dok-2 proteins in physiological hematopoiesis in the CSH and pathological hematopoiesis in the case of chronic myelomonocytic leukemia (CMML). They are negative regulators of the RAS/MAPK signaling pathway, activated upon receptor tyrosine kinase (RTK) triggering. Moreover, Dok1 and Dok2 gene ablation (Dok DKO) in mice induces a myeloproliferative syndrome illustrating myeloproliferative (MP) form of CMML. This MP-CMML subtype is primarily characterized by alterations of genes encoding for proteins involved in RAS pathway, found in 30% of MP-CMML cases.We have identified DOK1 and DOK2 nucleotide variants. The DOK2 L238P mutationhas been functionally studied, demonstrating that DOK2 L238P is an haploinsufficient loss of function mutant, inducing increased cell proliferation, correlated to MP-CMML phenotype.I also studied early hematopoiesis in Dok1 / Dok2 double KO (Dok DKO) mice. This model allowed us to demonstrate that Dok-1 and Dok-2 proteins act as switch regulators of HSC between quiescence and cell cycle entry. Moreover, they negatively regulate cell cycle in myeloid committed progenitors.Thus, Dok-1 and Dok-2 proteins appear to play an important role in the regulation of HSC quiescence and proliferation, as well as hematopoietic progenitors. Their deregulation by haploinsufficient mutation may play a role in the pathogenesis of the CMML, attesting to their function as tumor supressors. Finally, it would be interesting to link their function in HSCs to CMML pathogenesis and to further define the mechanisms by which Dok-1 and Dok-2 proteins are involved in leukemogenesis.

L’hématopoïèse est un processus actif, ordonné, et hautement régulé faisant intervenir des étapes de prolifération, de différenciation et d’apoptose et permettant la production de toutes les cellules sanguines matures à partir d’un nombre restreint de cellules souches hématopoïétiques. La dérégulation des mécanismes intervenant dans l’hématopoïèse induit le développement d’hémopathies, notamment de leucémies. De nombreux facteurs de transcription et microARN (miARN) ont été identifiés en tant que des régulateurs essentiels à l’établissement des différents lignages hématopoïétiques. Mon travail de thèse a porté sur l’étude du rôle des miARN dans la régulation de la différenciation macrophagique humaine. Nous avons reproduit le processus de différenciation macrophagique in vitro à partir de monocytes issus du sang périphérique traités avec du CSF-1 (colony stimulating factor-1). Suite à l’analyse du profil d’expression des miARN au cours du processus de différenciation, notre projet s’est orienté sur l’étude de miR-142-3p dont le taux d’expression diminue le plus fortement au cours de cette différenciation. Nous avons montré que miR-142-3p forme une boucle d’auto-régulation négative avec EGR2 (early growth response 2), un facteur de transcription connu pour réguler positivement la différenciation macrophagique. Cette boucle est essentielle au bon déroulement de la différenciation. Par ailleurs, nous avons observé une altération de cette boucle de régulation dans les monocytes de patients atteints d’une LMMC (leucémie myélomonocytaire chronique) suggérant que ce mécanisme puisse être impliqué dans la leucémogenèse. Au cours de ce projet, nous avons également initié une étude in vivo via l’utilisation du modèle que représente le Poisson-Zèbre. L’hématopoïèse du Poisson-Zèbre est très similaire à celle des mammifères que ce soit au niveau des populations hématopoïétiques ou des mécanismes de régulation impliqués. L’inhibition de l’expression du miR-142a-3p, homologue du miR-142-3p humain, se traduit par une absence de monocytes et de macrophages au niveau de l’ICM (intermediate cell mass), organe primaire de l’hématopoïèse, ainsi que par une diminution de l’expression de la myéloperoxydase, marqueur des granulocytes chez le Poisson-Zèbre. Ainsi, miR-142-3p semble être un inducteur de la formation des granulocytes et monocytes. / Hematopoiesis is an active process, orderly and highly regulated, involving proliferation, differentiation and apoptosis steps, and allowing the production of mature blood cells from a restricted number of hematopoietic stem cells. Deregulation of mechanisms involved in hematopoiesis leads to the development of leukemias. Many transcription factors and microRNAs (miRNAs) have been identified as essential regulators in the establishment of different hematopoietic lineages. My thesis investigated the role of miRNAs in the regulation of human macrophage differentiation. We examined macrophage differentiation in vitro, from peripheral blood monocytes treated with CSF-1 (colony stimulating factor-1). After the analysis of miRNAs expression profile, our project has focused on the study of miR-142-3p whose expression levels decreased most strongly during macrophage differentiation. We showed that miR-142-3p involved in a negative feedback loop with EGR2 (early growth response 2), a transcription factor known to favor macrophage differentiation. This molecular circuitry is necessary for the normal processus of differentiation. Furthermore, we observed an alteration of this regulation circuitry in monocytes of CMML (chronic myelomonocytic leukemia) patients, suggesting that this mechanism may be involved in leukemogenesis. During this project, we also initiated a study in vivo through the use of the zebrafish model. Zebrafish hematopoiesis is very similar to that in mammals both at the level of hematopoietic populations or regulatory mechanisms involved. The inhibition of miR-142a-3p expression, homolog of the human miR-142-3p, gave rise to an absence of monocytes and macrophages in ICM (intermediate cell mass), the primary organ of hematopoiesis and a decreased expression of myeloperoxidase, a marker of granulocytes in the zebrafish. Thus, miR-142-3p appears to be an inducer of granulocytes and monocytes formation.

Des mutations acquises du gène TET2 ont été décrites dans les hémopathies malignes humaines. La fréquence de ces anomalies dans les hémopathies myéloïdes est de 10 à 20%, atteignant 50% dans les échantillons de leucémies myélo-monocytaires chroniques (LMMC). Les mutations observées sont inactivatrices, ce qui suggère que TET2 est un gène de type suppresseur de tumeur et que les mutations retrouvées conduisent à une perte de fonction de la protéine. Ce gène code pour une enzyme capable de modifier les cytosines méthylées. Il participerait ainsi au contrôle de la méthylation de l'ADN et donc à la régulation épigénétique de l'expression génique. Afin de mieux comprendre son rôle au cours de l'hématopoïèse, deux modèles murins d'inactivation du gène Tet2 ont été développés. Des expériences de greffe de cellules médullaires dans des souris syngéniques montrent que les cellules déficientes pour ce gène présentent un avantage compétitif par rapport aux cellules sauvages. L'analyse des souris invalidées pour ce gène montre une amplification des populations hématopoïétiques immatures, ainsi que des anomalies de la différenciation des lignages myéloïdes et également des lignages lymphoïdes. Une fraction des souris invalidées pour Tet2 âgées de plus de six mois développe des hémopathies malignes ressemblant à la LMMC humaine. Des anomalies équivalentes sont retrouvées dans les souris hémizygotes pour Tet2 et dans des souris portant un allèle hypomorphe du gène. L'ensemble de ces résultats montre qu'une dérégulation de l'activité de Tet2 conduit à des anomalies précoces de l'hématopoïèse, mais n'entraine pas directement la transformation des cellules progénitrices immatures. La latence du développement de ces tumeurs suggère la nécessité d'une coopération avec d'autres évènements oncogéniques, comme des anomalies d'autres acteurs épigénétiques

Mon travail de thèse consistait à caractériser le rôle de la protéine TIF1γ (transcriptional intermediary factor 1 gamma) dans l’hématopoïèse adulte. L’hématopoïèse est un processus actif, ordonné, et hautement régulé faisant intervenir des étapes de prolifération, de différenciation et d’apoptose et permettant la production de toutes les cellules sanguines matures à partir d’un nombre restreint de cellules souches hématopoïétiques. La dérégulation des mécanismes intervenant dans l’hématopoïèse induit le développement d’hémopathies, notamment de leucémies. Les souris nullizygotes pour Tif1γ meurent au cours de l’embryogenèse du fait de graves défauts du développement. Afin d’étudier le rôle de Tif1γ dans l’hématopoïèse murine, et plus particulièrement sa contribution au développement et à la différenciation des cellules souches et des progéniteurs hématopoïétiques, nous avons généré des souris déficientes pour Tif1γ uniquement dans les cellules hématopoïétiques. Nous avons observé que Tif1γ agit en tant que gène suppresseur de tumeur dans ces cellules. Nous avons aussi démontré que Tif1γ est un régulateur clef du devenir des cellules souches hématopoïétiques chez les mammifères. Nous avons mis en évidence que, chez les souris âgées, la délétion de Tif1γ provoque l’apparition d’un syndrome myéloprolifératif dysplasique, ressemblant fortement au phénotype de la leucémie myélomonocytaire chronique (LMMC) humaine. De façon intéressante, nous avons identifiéé que plus de 40% de patients atteints de cette pathologie présentent un faible taux de TIF1γ. La décitabine, molécule hypométhylante utilisée en thérapeutique, permet le rétablissememnt d’une expression normale de TIF1γ. Chez certains patients, nous avons corrélé la diminution de l’expression de TIF1 avec l’hyperméthylation de l’ADN et un patron spécifique de modifications d’histones (acétylations et méthylations) sur le promoteur du gène TIF1γ. Ces résultats suggèrent une signature épigénétique spécifique de la leucémie myélomonocytaire chronique sur le promoteur de TIF1γ. L’ensemble de nos données indiquent donc que TIF1γ est un gène suppresseur de tumeur régulé épigénétiquement dans les cellules hématopoïétiques. / My thesis deals with the characterization of the role of the protein TIF1γ (transcriptional intermediary factor 1 gamma) in adult hematopoiesis. Hematopoiesis is an active process, orderly and highly regulated, using proliferation, differentiation and apoptosis steps, and allowing the production of mature blood cells from a restricted number of hematopoietic stem cells. Deregulation of mechanisms involved in hematopooiesis leads to the development of leukemias. Tif1γ knockout mice die during embryogenesis with severe development defects. In order to study the role of Tif1γ in murine hematopoiesis, and more particularly its contribution to hematopoietic stem and progenitor cells development and differentiation, we generated hematopoietic Tif1γ deleted mice. We showed that Tif1γ functions as a tumor suppressor gene in hematopoietic cells. Moreover, we identified Tif1γ as a key player in the commitment of mammal hematopoietic stem cells. In ageing mice, we demonstrated that the Tif1γ deletion leads to a myeloproliferative and myelodysplastic syndrome, phenotypically very close to the human chronic myelomonocytic leukemia (CMML). We also identified a very low level of TIF1γexpression in the monocytes of 40% CMML patients. Decitabine, a hypomethylating molecule used in CMML therapy, allows the restoration of a normal TIF1γ expression. In some patients, we have highlighted the correlation between the low expression of TIF1γ, the DNA hypermethylation and a specific pattern of histone modifications (acetylation and methylation) on TIF1γ gene promoter. These results suggest a specific epigenetic signature of the disease on this promoter. Taking together, our data indicate that TIF1γ is a tumor suppressor gene, epigenetically regulated in hematopoietic cells.

As síndromes mielodisplásicas (SMD) se caracterizam por terem uma hematopoese displásica, citopenias e pelo risco de progressão para leucemia mielóide aguda. O diagnóstico baseia-se na clínica e nos achados citomorfológicos da medula óssea (MO) e citogenéticos. Na fase inicial ou quando a MO é hipocelular o diagnóstico é difícil e a citogenética frequentemente é normal. A imunofenotipagem (IMF) tem sido cada vez mais utilizada nos casos de SMD em adultos e pouco explorada na SMD pediátrica. Os nossos objetivos foram: estudar os casos de SMD e doenças correlatas (LMA relacionada à SMD: LMA-rMD; leucemia mielomonocítica crônica: LMMC e leucemia mielomonocítica juvenil: LMMJ) em adultos e crianças, associando os dados clínicos e laboratoriais aos obtidos pela IMF, que utilizou um painel de anticorpos monoclonais para as várias linhagens medulares. No período compreendido entre 2000 e 2010 foram estudados 87 pacientes (64 adultos e 23crianças) oriundos do HUPE/UERJ e IPPMG/UFRJ e 46 controles (23 adultos e 20 crianças). Todos os doentes realizaram mielograma, biópsia óssea, citogenética, citoquímica e estudo imunofenotípico. Segundo os critérios da OMS 50 adultos foram classificados como SMD, 11 como LMA-rMD e 3 LMMC. Entre as crianças 18 eram SMD, 2 LMA e 3 LMMJ. Os pacientes adultos com SMD foram divididos em alto risco (n = 9; AREB-1 e AREB-2) e baixo risco (n=41; CRDU, CRDM, CRDM-SA, SMD-N e SMD-5q-). As crianças com SMD em CR (n=16) e AREB (n = 2). Anormalidades clonais recorrentes foram encontradas em 22 pacientes adultos e em 7 crianças. Na análise da IMF foi utilizada a metodologia da curva ROC para a determinação dos valores de ponto de corte a fim de identificar os resultados anormais dos anticorpos monoclonais nos pacientes e nos controles, permitindo determinar a sensibilidade e especificidade desses em cada linhagem. A IMF foi adequada para a análise em todos os pacientes e 3 ou mais anormalidades foram encontradas. A associação da IMF aumentou a sensibilidade da análise morfológica na linhagem eritróide de 70 para 97% nos adultos e de 59 para 86% nas crianças; na linhagem granulocítica de 53 para 98% nos adultos e de 50 para 100% nas crianças. Nos monócitos, onde a morfologia não foi informativa, mostrou uma sensibilidade de 86% nos adultos e 91% nas crianças. Enquanto que na linhagem megacariocítica, não analisada pela IMF, a morfologia mostrou uma sensibilidade de 95% nos adultos e 91% nas crianças. Na população de blastos foi expressiva a ausência de precursores linfóide B (em 92% dos adultos e em 61% das crianças). Os resultados observados nas crianças com SMD foram semelhantes aos encontrados nos adultos. Em conclusão, nossos resultados mostraram que a IMF é um método complementar ao diagnóstico da SMD e doenças correlatas tanto em adultos quanto em crianças podendo contribuir para o reconhecimento rápido e precoce dessas enfermidades, devendo ser incorporado aos procedimentos de rotina diagnóstica. / As síndromes mielodisplásicas (SMD) se caracterizam por terem uma hematopoese displásica, citopenias e pelo risco de progressão para leucemia mielóide aguda. O diagnóstico baseia-se na clínica e nos achados citomorfológicos da medula óssea (MO) e citogenéticos. Na fase inicial ou quando a MO é hipocelular o diagnóstico é difícil e a citogenética frequentemente é normal. A imunofenotipagem (IMF) tem sido cada vez mais utilizada nos casos de SMD em adultos e pouco explorada na SMD pediátrica. Os nossos objetivos foram: estudar os casos de SMD e doenças correlatas (LMA relacionada à SMD: LMA-rMD; leucemia mielomonocítica crônica: LMMC e leucemia mielomonocítica juvenil: LMMJ) em adultos e crianças, associando os dados clínicos e laboratoriais aos obtidos pela IMF, que utilizou um painel de anticorpos monoclonais para as várias linhagens medulares. No período compreendido entre 2000 e 2010 foram estudados 87 pacientes (64 adultos e 23crianças) oriundos do HUPE/UERJ e IPPMG/UFRJ e 46 controles (23 adultos e 20 crianças). Todos os doentes realizaram mielograma, biópsia óssea, citogenética, citoquímica e estudo imunofenotípico. Segundo os critérios da OMS 50 adultos foram classificados como SMD, 11 como LMA-rMD e 3 LMMC. Entre as crianças 18 eram SMD, 2 LMA e 3 LMMJ. Os pacientes adultos com SMD foram divididos em alto risco (n = 9; AREB-1 e AREB-2) e baixo risco (n=41; CRDU, CRDM, CRDM-SA, SMD-N e SMD-5q-). As crianças com SMD em CR (n=16) e AREB (n = 2). Anormalidades clonais recorrentes foram encontradas em 22 pacientes adultos e em 7 crianças. Na análise da IMF foi utilizada a metodologia da curva ROC para a determinação dos valores de ponto de corte a fim de identificar os resultados anormais dos anticorpos monoclonais nos pacientes e nos controles, permitindo determinar a sensibilidade e especificidade desses em cada linhagem. A IMF foi adequada para a análise em todos os pacientes e 3 ou mais anormalidades foram encontradas. A associação da IMF aumentou a sensibilidade da análise morfológica na linhagem eritróide de 70 para 97% nos adultos e de 59 para 86% nas crianças; na linhagem granulocítica de 53 para 98% nos adultos e de 50 para 100% nas crianças. Nos monócitos, onde a morfologia não foi informativa, mostrou uma sensibilidade de 86% nos adultos e 91% nas crianças. Enquanto que na linhagem megacariocítica, não analisada pela IMF, a morfologia mostrou uma sensibilidade de 95% nos adultos e 91% nas crianças. Na população de blastos foi expressiva a ausência de precursores linfóide B (em 92% dos adultos e em 61% das crianças). Os resultados observados nas crianças com SMD foram semelhantes aos encontrados nos adultos. Em conclusão, nossos resultados mostraram que a IMF é um método complementar ao diagnóstico da SMD e doenças correlatas tanto em adultos quanto em crianças podendo contribuir para o reconhecimento rápido e precoce dessas enfermidades, devendo ser incorporado aos procedimentos de rotina diagnóstica.

As síndromes mielodisplásicas (SMD) se caracterizam por terem uma hematopoese displásica, citopenias e pelo risco de progressão para leucemia mielóide aguda. O diagnóstico baseia-se na clínica e nos achados citomorfológicos da medula óssea (MO) e citogenéticos. Na fase inicial ou quando a MO é hipocelular o diagnóstico é difícil e a citogenética frequentemente é normal. A imunofenotipagem (IMF) tem sido cada vez mais utilizada nos casos de SMD em adultos e pouco explorada na SMD pediátrica. Os nossos objetivos foram: estudar os casos de SMD e doenças correlatas (LMA relacionada à SMD: LMA-rMD; leucemia mielomonocítica crônica: LMMC e leucemia mielomonocítica juvenil: LMMJ) em adultos e crianças, associando os dados clínicos e laboratoriais aos obtidos pela IMF, que utilizou um painel de anticorpos monoclonais para as várias linhagens medulares. No período compreendido entre 2000 e 2010 foram estudados 87 pacientes (64 adultos e 23crianças) oriundos do HUPE/UERJ e IPPMG/UFRJ e 46 controles (23 adultos e 20 crianças). Todos os doentes realizaram mielograma, biópsia óssea, citogenética, citoquímica e estudo imunofenotípico. Segundo os critérios da OMS 50 adultos foram classificados como SMD, 11 como LMA-rMD e 3 LMMC. Entre as crianças 18 eram SMD, 2 LMA e 3 LMMJ. Os pacientes adultos com SMD foram divididos em alto risco (n = 9; AREB-1 e AREB-2) e baixo risco (n=41; CRDU, CRDM, CRDM-SA, SMD-N e SMD-5q-). As crianças com SMD em CR (n=16) e AREB (n = 2). Anormalidades clonais recorrentes foram encontradas em 22 pacientes adultos e em 7 crianças. Na análise da IMF foi utilizada a metodologia da curva ROC para a determinação dos valores de ponto de corte a fim de identificar os resultados anormais dos anticorpos monoclonais nos pacientes e nos controles, permitindo determinar a sensibilidade e especificidade desses em cada linhagem. A IMF foi adequada para a análise em todos os pacientes e 3 ou mais anormalidades foram encontradas. A associação da IMF aumentou a sensibilidade da análise morfológica na linhagem eritróide de 70 para 97% nos adultos e de 59 para 86% nas crianças; na linhagem granulocítica de 53 para 98% nos adultos e de 50 para 100% nas crianças. Nos monócitos, onde a morfologia não foi informativa, mostrou uma sensibilidade de 86% nos adultos e 91% nas crianças. Enquanto que na linhagem megacariocítica, não analisada pela IMF, a morfologia mostrou uma sensibilidade de 95% nos adultos e 91% nas crianças. Na população de blastos foi expressiva a ausência de precursores linfóide B (em 92% dos adultos e em 61% das crianças). Os resultados observados nas crianças com SMD foram semelhantes aos encontrados nos adultos. Em conclusão, nossos resultados mostraram que a IMF é um método complementar ao diagnóstico da SMD e doenças correlatas tanto em adultos quanto em crianças podendo contribuir para o reconhecimento rápido e precoce dessas enfermidades, devendo ser incorporado aos procedimentos de rotina diagnóstica. / As síndromes mielodisplásicas (SMD) se caracterizam por terem uma hematopoese displásica, citopenias e pelo risco de progressão para leucemia mielóide aguda. O diagnóstico baseia-se na clínica e nos achados citomorfológicos da medula óssea (MO) e citogenéticos. Na fase inicial ou quando a MO é hipocelular o diagnóstico é difícil e a citogenética frequentemente é normal. A imunofenotipagem (IMF) tem sido cada vez mais utilizada nos casos de SMD em adultos e pouco explorada na SMD pediátrica. Os nossos objetivos foram: estudar os casos de SMD e doenças correlatas (LMA relacionada à SMD: LMA-rMD; leucemia mielomonocítica crônica: LMMC e leucemia mielomonocítica juvenil: LMMJ) em adultos e crianças, associando os dados clínicos e laboratoriais aos obtidos pela IMF, que utilizou um painel de anticorpos monoclonais para as várias linhagens medulares. No período compreendido entre 2000 e 2010 foram estudados 87 pacientes (64 adultos e 23crianças) oriundos do HUPE/UERJ e IPPMG/UFRJ e 46 controles (23 adultos e 20 crianças). Todos os doentes realizaram mielograma, biópsia óssea, citogenética, citoquímica e estudo imunofenotípico. Segundo os critérios da OMS 50 adultos foram classificados como SMD, 11 como LMA-rMD e 3 LMMC. Entre as crianças 18 eram SMD, 2 LMA e 3 LMMJ. Os pacientes adultos com SMD foram divididos em alto risco (n = 9; AREB-1 e AREB-2) e baixo risco (n=41; CRDU, CRDM, CRDM-SA, SMD-N e SMD-5q-). As crianças com SMD em CR (n=16) e AREB (n = 2). Anormalidades clonais recorrentes foram encontradas em 22 pacientes adultos e em 7 crianças. Na análise da IMF foi utilizada a metodologia da curva ROC para a determinação dos valores de ponto de corte a fim de identificar os resultados anormais dos anticorpos monoclonais nos pacientes e nos controles, permitindo determinar a sensibilidade e especificidade desses em cada linhagem. A IMF foi adequada para a análise em todos os pacientes e 3 ou mais anormalidades foram encontradas. A associação da IMF aumentou a sensibilidade da análise morfológica na linhagem eritróide de 70 para 97% nos adultos e de 59 para 86% nas crianças; na linhagem granulocítica de 53 para 98% nos adultos e de 50 para 100% nas crianças. Nos monócitos, onde a morfologia não foi informativa, mostrou uma sensibilidade de 86% nos adultos e 91% nas crianças. Enquanto que na linhagem megacariocítica, não analisada pela IMF, a morfologia mostrou uma sensibilidade de 95% nos adultos e 91% nas crianças. Na população de blastos foi expressiva a ausência de precursores linfóide B (em 92% dos adultos e em 61% das crianças). Os resultados observados nas crianças com SMD foram semelhantes aos encontrados nos adultos. Em conclusão, nossos resultados mostraram que a IMF é um método complementar ao diagnóstico da SMD e doenças correlatas tanto em adultos quanto em crianças podendo contribuir para o reconhecimento rápido e precoce dessas enfermidades, devendo ser incorporado aos procedimentos de rotina diagnóstica.