付記する学位プログラム名: 京都大学卓越大学院プログラム「メディカルイノベーション大学院プログラム」 / 京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第24509号 / 医博第4951号 / 新制||医||1064(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 林 康紀, 教授 渡邉 大, 教授 高橋 淳 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Modification of the lipid A domain of lipopolysaccharide (LPS) is important for the pathogenesis and virulence of various Gram-negative bacteria. The major lipid A species of Helicobacter pylori is significantly different from that of Escherichia coli. H. pylori lipid A contains fewer acyl chains and phosphate groups with only one Kdo sugar attached to the disaccharide backbone. However, H. pylori produces a minor lipid A species that resembles E. coli lipid A, suggesting that the major lipid A species results from the action of specific modifying enzymes. This work describes two enzymes, a lipid A phosphatase and a phosphoethanolamine (pEtN) transferase, involved in modifying the 1-position of H. pylori lipid A. H. pylori lipid A contains a pEtN unit directly linked to the 1-position of the disaccharide backbone. This is in contrast to the pEtN units found in other pathogens, which are attached to the lipid A phosphate group to form a pyrophosphate linkage. Using in-vitro assay systems, we demonstrate that the modification of the 1-position of H. pylori lipid A is a two-step process involving the removal of the 1-phosphate group by LpxEHP followed by the addition of a pEtN residue catalyzed by EptAHP. As compared to wild-type H. pylori, lpxEHP mutants are extremely sensitive to the cationic peptide polymyxin, thus, demonstrating the importance of modifying the 1-position of lipid A. Furthermore, this work describes another enzyme, YeiU (renamed LpxT), which specifically utilizes the carrier lipid undecaprenyl pyrophsphate (C55-PP) to modify the 1-position of E. coli lipid A. Typically, E. coli lipid A is a hexa-acylated disaccharide of glucosamine in which monophosphate groups are attached at positions 1 and 4'; however, a small fraction contains a diphosphate moiety at the 1-position (lipid A 1-diphosphate). 32P-labeled lipid A obtained from lpxT deficient mutants produces only lipid A, and complementation with a plasmid expressing LpxT restores lipid A 1-diphosphate formation. Inhibition of lipid A 1-diphosphate synthesis was demonstrated by sequestering C55-PP with the cyclic polypeptide antibiotic bacitracin. In conclusion, this work describes two novel pathways for lipid A modification at the 1-position in Gram-negative bacteria.

Ceramides are sphingolipids that serve as important second messengers in an increasing number of stress-induced pathways. Ceramide has long been known to affect the mitochondria, altering both morphology and physiology. Lipopolysaccharide (LPS) is a prevalent circulating inflammatory agent in obesity, potentially mediating some of the pathologies associated with weight gain. Given previous findings of TLR4-mediated ceramide accrual and ceramide-mediated mitochondrial disruption, we questioned whether ceramide is necessary for LPS-induced mitochondrial disruption. We found that LPS treatment increased gene transcript levels of ceramide synthesis enzymes and mitochondrial fission proteins and increased ceramide content in cultured myotubes and in mouse tissue. Mitochondrial respiration from permeabilized red gastrocnemius was reduced from animals receiving LPS injections when compared with those receiving vehicle (PBS). However, respiration from mice receiving both LPS and myriocin, a ceramide inhibitor, (0.3 mg/kg) was similar to PBS-injected animals. We treated murine myotubes with similar LPS conditions. These cells demonstrated increased ceramide synthesis and increased levels of mitochondrial fission with LPS treatment; these effects were mitigated with the addition of myriocin. However, in contrast to the whole gastrocnemius response in animals receiving LPS, respiration from myotubes was increased with LPS alone, and even higher with both myriocin alone and myriocin with LPS. We also sought to assess the impact of ceramide on skeletal muscle mitochondrial structure and function. A primary observation was the rapid and dramatic division of mitochondria in ceramide-treated cells. This effect is likely a result of increased Drp1 action, as ceramide increased Drp1 expression and Drp1 inhibition prevented ceramide-induced mitochondrial fission. Further, we found that ceramide treatment reduced mitochondrial O2 consumption (i.e., respiration) in cultured myotubes and permeabilized red gastrocnemius muscle fiber bundles. Ceramide treatment also increased H2O2 levels and reduced Akt/PKB phosphorylation in myotubes. However, inhibition of mitochondrial fission via Drp1 knockdown completely protected the myotubes and fiber bundles from ceramide-induced metabolic disruption, including maintained mitochondrial respiration, reduced H2O2 levels, and unaffected insulin signaling. These data suggest that the forced and sustained mitochondrial fission that results from ceramide accrual may alter metabolic function in skeletal muscle, which is a prominent site not only of energy demand (via the mitochondria), but also of ceramide accrual with weight gain.

infection is a leading cause of gastric cancer, which is the second-most common cancer-related death in the world. The chronic inflammatory environment in the gastric mucosal epithelia during infection stimulates intracellular signaling pathways, namely inflammatory signals, which may lead to the promotion and progression of cancer cells. We herein report two important signal transduction pathways, the LPS-TLR4 and CagA-MET pathways. Upon stimulation, lipopolysaccharide (LPS) binds to toll-like receptor 4 (TLR4) mainly on macrophages and gastric epithelial cells. This induces an inflammatory response in the gastric epithelia to upregulate transcription factors, such as NF-κB, AP-1, and IRFs, all of which contribute to the initiation and progression of gastric cancer cells. Compared with other bacterial LPSs, LPS has a unique function of inhibiting the mononuclear cell (MNC)-based production of IL-12 and IFN-γ. While this mechanism reduces the degree of inflammatory reaction of immune cells, it also promotes the survival of gastric cancer cells. The HGF/SF-MET signaling plays a major role in promoting cellular proliferation, motility, migration, survival, and angiogenesis, all of which are essential factors for cancer progression. infection may facilitate MET downstream signaling in gastric cancer cells through its CagA protein via phosphorylation-dependent and/or phosphorylation-independent pathways. Other signaling pathways involved in infection include EGFR, FAK, and Wnt/β-Catenin. These pathways function in the inflammatory process of gastric epithelial mucosa, as well as the progression of gastric cancer cells. Thus, infection-mediated chronic inflammation plays an important role in the development and progression of gastric cancer.

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind von einer Lipiddoppelmembran umschlossen und können Proteine, Nukleinsäuren, sowie Kohlenhydrate enthalten. Die sehr heterogenen EVs werden von einer Vielzahl eu- und prokaryotischer Zellen freigesetzt und sind aus allen menschlichen Körperflüssigkeiten isolierbar. EVs können über mehrere Mechanismen Informationen zwischen Zellen übertragen und spielen damit eine wichtige, aber größtenteils unerforschte Rolle in der Zell-Zell-Kommunikation. So erlauben die Oberflächenproteine der EVs einerseits Interaktionen mit membranständigen Rezeptoren auf Zellen, während EVs andererseits endozytiert werden können und ihr Inhalt somit nach intrazellulär transportiert werden kann. Der enge Informationsaustausch in der Zusammenarbeit verschiedener Zellen ist charakteristisch für das Immunsystem, in dem Monozyten eine zentrale Stellung vor allem bei der Abwehr bakterieller Infektionen einnehmen. Allerdings ist die Funktion von monozytären extrazellulären Vesikeln, wie auch viele ihrer Charakteristika, weitgehend unbekannt. Mit dem Ziel, die monozytären extrazellulären Vesikel genauer zu charakterisieren, erfolgte die Separation primärer humaner Monozyten aus Leukozytenkonzentraten gesunder Blutspender mit Gegenstromelutriation oder Positivselektion über das Oberflächenmolekül CD14. Dabei zeigte sich, dass die Nutzung von Gegenstromelutriation zur Separation primärer humaner Monozyten vorteilhaft hinsichtlich höherer Ausbeute an Zellen und höherer Zellvitalität war, während die Positivselektion eine höhere Zellreinheit erlaubte. Nach Kultur der Monozyten in vesikelfreiem Medium wurden die EVs mittels differentieller Ultrazentrifugation aus den Zellkulturüberständen isoliert und charakterisiert. Die unspezifische Charakterisierung der EVs hinsichtlich der Größenverteilung und Quantität erfolgte mit nanoparticle tracking-Analyse und zeigte gut mit kleinen bis mittelgroßen EVs vereinbare Ergebnisse. In Einklang damit stellten sich die monozytären EVs als sphärische, nanoskalige Strukturen in der Raster-Heliumionenmikroskopie dar. Der Nachweis spezifischer Oberflächenmoleküle auf den EVs erfolgte mit einer bead-basierten durchflusszytometrischen Methode (MACSPlex). Die EVs positivselektierter Monozyten trugen MHC-II, CD63, CD81, CD24, CD44, sowie CD14, CD31 und CD11c auf ihrer Oberfläche. Dies belegte einerseits die Isolation extrazellulärer Vesikel und deutete gleichzeitig auf den monozytären Ursprung und mögliche Interaktionen der Vesikel hin. Die Sensitivität von CD14 als möglicher Marker für monozytäre EVs zeigte sich aufgrund geringer Signalintensität als wahrscheinlich ungenügend. Bei Charakterisierung der EVs von Monozyten, welche mit Gegenstromelutriation separiert wurden, zeigten sich regelmäßig zusätzlich Thrombozyten-spezifische Oberflächenmoleküle. Die Kontamination monozytärer EVs mit thrombozytären EVs konnte durchflusszytometrisch mit MACSPlex erkannt und durch Positivselektion der Monozyten vermieden werden. Das Tetraspanin CD9, welches allgemein einen wenig spezifischen Marker für EVs darstellt, zeigte sich bei Nachweis auf EVs primärer humaner Monozyten am ehesten als Ausdruck einer Kontamination mit thrombozytären EVs. Somit gelang der Nachweis mehrerer Oberflächenproteine auf monozytären EVs unter gleichzeitigem Ausschluss von Kontaminationen mit EVs anderer Blutzellen oder Thrombozyten. Eine Stimulation der positivselektierten, beziehungsweise mit Gegenstromelutriation separierten primären humanen Monozyten mit Lipopolysaccharid (LPS) führte zu einer im Mittel um 70 %, beziehungsweise um 86 % verstärkten Freisetzung extrazellulärer Vesikel in den Zellkulturüberstand. Dabei veränderte sich die Größenverteilung, die Oberflächenbeschaffenheit und die relative Expression der untersuchten Oberflächenproteine nicht signifikant. Extrazelluläre Vesikel, welche in Anwesenheit von LPS gewonnen wurden, wiesen auch nach dem Isolationsprozess eine relevante Endotoxinkonzentration auf, was wahrscheinlich einen erheblichen Einfluss auf andere LPS-sensible Zellen hätte. Daher wurden nur die ohne LPS gewonnenen monozytären EVs auf eine immunmodulatorische Funktion hin untersucht. Dafür wurden in-vitro differenzierte M1- beziehungsweise M2-Makrophagen nach Inkubation mit monozytären EVs einem LPS-Stimulus ausgesetzt. Die Zytokinantwort der Makrophagen wurde mit RT-PCR und ELISA für IL-1β, IL-10, IL-6, IL-8 und TNF-α analysiert. Extrazelluläre Vesikel primärer humaner Monozyten zeigten unter den gewählten experimentellen Bedingungen keinen statistisch signifikanten Einfluss auf die Zytokinantwort von in-vitro differenzierten M1- und M2-Makrophagen auf einen LPS-Stimulus. Dennoch nahm die Transkription der proinflammatorischen Zytokine in LPS-stimulierten M1-Makrophagen durch Vorinkubation mit monozytären EVs ab. Die gewonnenen Ergebnisse unterstreichen die Komplexität der Forschung an extrazellulären Vesikeln von Primärzellen und unterstützen die Notwendigkeit genauer und kritischer Charakterisierung von EVs, beispielsweise mit durchflusszytometrischen Multiplex-Methoden für die Bestimmung von Oberflächenmolekülen. Weitere Studien sind nötig, um die intravesikulären Charakteristika monozytärer EVs und die Art derer Interaktion mit verschiedenen Zellen zu untersuchen. Das Verständnis der Rolle von EVs im Ablauf inflammatorischer Reaktionen könnte perspektivisch zu deren Einsatz im Rahmen zielgerichteter Immunmodulation oder Diagnostik führen.

Macrophages (MF) are known to exhibit distinct responses to viral and bacterial infection, but how they react when exposed to the pathogens in succession is less well understood. Accordingly, we determined the effect of a rubella virus (RV)-induced infection followed by an LPS-induced challenge on cytokine production, signal transduction and metabolic pathways in human GM (M1-like)- and M (M2-like)-MF. We found that infection of both subsets with RV resulted in a low TNF-a and a high interferon (IFN, type I and type III) release whereby M-MF produced far more IFNs than GM-MF. Thus, TNF-a production in contrast to IFN production is not a dominant feature of RV infection in these cells. Upon addition of LPS to RV-infected MF compared to the addition of LPS to the uninfected cells the TNF-a response only slightly increased, whereas the IFN-response of both subtypes was greatly enhanced. The subset specific cytokine expression pattern remained unchanged under these assay conditions. The priming effect of RV was also observed when replacing RV by IFN-b one putative priming stimulus induced by RV. Small amounts of IFN-b were sufficient for phosphorylation of Stat1 and to induce IFN-production in response to LPS. Analysis of signal transduction pathways activated by successive exposure of MF to RV and LPS revealed an increased phosphorylation of NFkB (MMF), but different to uninfected MF a reduced phosphorylation of ERK1/2 (both subtypes). Furthermore, metabolic pathways were affected; the LPS-induced increase in glycolysis was dampened in both subtypes after RV infection. In conclusion, we show that RV infection and exogenously added IFN-b can prime MF to produce high amounts of IFNs in response to LPS and that changes in glycolysis and signal transduction are associated with the priming effect. These findings will help to understand to what extent MF defense to viral infection is modulated by a following exposure to a bacterial infection.

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