CRUZ, Wallace Teixeira da. Análise proteômica, purificação e caracterização de uma peptidase cisteínica oligomérica do látex de Thevetia peruviana (Pers.) Schum. 2015. 112 f. Dissertação (Mestrado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2015. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-09-02T11:47:46Z No. of bitstreams: 1 2015_dis_wtcruz.pdf: 3443910 bytes, checksum: 9220d32e8822f3355afef0df27cdbe24 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2016-09-05T20:28:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_dis_wtcruz.pdf: 3443910 bytes, checksum: 9220d32e8822f3355afef0df27cdbe24 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-05T20:28:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_dis_wtcruz.pdf: 3443910 bytes, checksum: 9220d32e8822f3355afef0df27cdbe24 (MD5) Previous issue date: 2015 / A great number of plant species produce latex, including Apocynacea, Sapotacea, Papaveracea and Euphorbiaceae. Thevetia peruviana (Pers.) Schum is a laticifer shrub belonging to Apocynaceae family popularly known as “chapéu-de-napoleão”. It is very limited the proteomic information about this specie. Thus, a proteomic analysis of protein fraction (TpLP) from T. peruviana latex was performed using two dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. A total of 33 proteins (86%) were identified, including storage proteins, peptidase inhibitor, cysteine peptidases, peroxidases and osmotins. This protein fraction showed strong proteolytic activity at pH 5.0 which was increased in the presence of low concentrations of the reducing agent DTT. The inhibition this activity in the presence of specific inhibitors E-64 and IAA and the high activity with BANA showed the predominance of cysteine peptidases in latex. A cysteine peptidase, termed peruvianin-I, was purified from the latex by a single chromatographic step involving gel filtration. The enzyme was inhibited by E-64 and iodoacetamide (IAA) and follows the Michaelis-Menten kinetics, showing high affinity for azocasein, with Km value of 17.6 uM, exhibiting an optimal pH and temperature of 5.0-6.0 and 25-37 °C, respectively. Two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry revealed that peruvianin-I (100 kDa) possesses a pI of 4.0 and five subunits (20 kDa). The N-terminal amino acid sequence of peruvianin-I (1ADPGPLQDFCLADLNSPLFINGYPCRNPALAISDDF36) was similar to that of germin or germin-like proteins. High-resolution images from atomic force microscopy indicated the possible hexameric structure of peruvianin-I, which is organized as a trimer of dimers that form a central channel. TpLP and peruvianin-I exhibited no oxalate oxidase and superoxide dismutase activity or antifungal effects on the spore germination of Fusarium solani. This study showed that T. peruviana latex are a rich source of pathogenesis-related proteins, including cysteine peptidases. Interestingly, these peptidases exhibit different structural and biochemical characteristics that may be related to their specific physiological functions. / Um grande número de espécies vegetais produzem látex, incluindo Apocynacea, Sapotacea, Papaveracea e Euphorbiaceae. Thevetia peruviana (Pers.) Schum é um arbusto laticífero pertencente à família Apocynaceae, popularmente conhecido como "chapéu-de-Napoleão". São bastante limitadas as informações proteômicas sobre esta espécie. Por tanto, uma análise proteômica da fração proteica (TpLP) do látex de T. peruviana foi realizada a partir de eletroforeses bidimensionais e espectrometria de massas. Um total de 33 proteínas (86%) foi identificado, incluindo proteínas de reserva, inibidor de peptidase, peptidases cisteínicas, peroxidases e osmotinas. As proteínas desta fração apresentaram uma forte atividade proteolítica no pH 5,0, a qual foi aumentada na presença de baixas concentrações do agente redutor DTT. A inibição desta atividade na presença dos inibidores específicos E-64 e IAA e a alta atividade com o substrato BANA evidenciou a predominância de peptidases cisteínicas no látex. Uma peptidase cisteínica denominada peruvianina-I, foi purificada a partir do látex através de um único passo cromatográfico envolvendo filtração em gel. A enzima foi inibida por E-64 e iodoacetamida (IAA) e seguiu a cinética de Michaelis-Menten, apresentando alta afinidade à azocaseína, com um valor de Km de 17,6 µM, exibindo pH e temperatura ótimos de 5,0-6,0 e 25-37 °C, respectivamente. A peruvianina-I não foi reconhecida por anticorpos anti-papaína. As Eletroforeses bidimensionais e a espectrometria de massas revelaram que a peruvianina-I (100 kDa) possui um pI de 4,0 e cinco subunidades (20 kDa). A sequência de aminoácidos N-terminal da peruvianina-I (1ADPGPLQDFCLADLNSPLFINGYPCRNPALAISDDF36) mostrou similaridade à germinas ou “germin-like proteins”. Imagens de alta resolução a partir da microscopia de força atômica indicaram uma possível estrutura hexamérica da peruvianina-I, que está organizada como um trímero de dímeros, formando um canal central. TpLP e Peruvianina-I não exibiram atividade de oxalato oxidase e superóxido dismutase ou efeitos antifúngicos sobre a germinação de esporos de Fusarium solani. Este estudo mostrou que o látex de T. peruviana é uma fonte rica em proteínas relacionadas à patogênese, incluindo peptidases cisteínicas. Curiosamente, estas peptidases apresentam características estruturais e bioquímicas diferentes, que podem estar relacionadas com as suas funções fisiológicas específicas.

Orientador: Silvia Rodrigues Machado / Resumo: Neste estudo buscamos avaliar diferentes aspectos da diferenciação de laticíferos. O crescimento intrusivo (capacidade de crescer penetrando a lamela média de células adjacentes) e a ação indutora dos laticíferos (capacidade de induzir uma célula vizinha a adquirir características de laticíferos) são mecanismos de crescimento interessantes que podem ocorrer nos laticíferos, mas que são mal compreendidos. O etileno e o ácido jasmônico são hormônios vegetais liberados durante a herbivoria e podem afetar a diferenciação de estruturas secretoras relacionadas à defesa, como laticíferos e ductos resiníferos. Utilizando métodos convencionais em microscopia eletrônica de transmissão, para caracterização da ultraestrutura celular, e imunocitoquímicos, para a detecção de componentes de parede celular, exploramos o desenvolvimento de laticíferos articulados anastomosados com crescimento intrusivo e a ação indutora dos laticíferos no embrião maduro e na planta de Tabernaemontana catharinensis A.DC. (Apocynaceae). Além disso, pulverizamos soluções de etileno 2%, ácido jasmônico 0,1% ou água deionizada em plantas (n = 33) de T. catharinensis cultivadas em condições controladas e avaliamos a influência destes reguladores vegetais sobre a diferenciação dos laticíferos nos tecidos primários e floema secundário. Ultraestruturalmente, verificamos que o processo de incorporação de células ao sistema laticífero é distinto no embrião e na planta. Entretanto, em ambos os casos, o protoplasto da cél... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In this study, we evaluated different aspects of the laticifer differentiation. The intrusive growth (the capacity of grow penetrating the middle lamella that cements adjacent cells) and the inducing action of laticifers (the capacity of induced an adjacent cell to acquirer laticifer features) are exciting growth mechanisms that may occur in laticifers, but they are poorly understood. Ethylene and jasmonic acid are plant hormones released during the herbivory and may affect the differentiation of secretory structures related with plant defense, as laticifers and resin ducts. Using transmission electron microcopy conventional methods (for characterization of the cell ultrastructure), and immunocytochemistry (for detection of the cell wall compounds), we explored the development of the articulated anastomosing laticifers with intrusive growth and the induction action of laticifer in the mature embryo and plant of Tabernaemontana catharinensis A.DC. (Apocynaceae). Additionally, we sprayed solutions of the 2% ethephon, 0.1% jasmonic acid and deonized water in plants of T. catharinensis (n = 33) growing under controlled conditions and evaluated the influence of these plant regulators on laticifer differentiation in the primary tissues and secondary phloem. In the ultrastructure, we verified that the process of cell incorporation within the laticifer system is distinct in the embryo and plant. However, in both the cases the protoplast of the incorporated cells acquires similar feat... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor