Les infections à Salmonella Enteritidis chez les humains sont associées à la consommation d’œufs ou d’ovoproduits contaminés. La vaccination est un outil utilisé pour diminuer les risques d’infection à SE chez la volaille, mais avec des résultats variables. Au Canada deux bactérines, MBL SE4C et Layermune, sont couramment utilisées pour lutter contre SE. Cependant, leur efficacité n’a pas été complètement déterminée chez les poules pondeuses plus âgées. Par ailleurs, la capacité de ces vaccins à prévenir la transmission verticale et horizontale n’a pas encore été étudiée. L’objectif principal de cette étude était d’évaluer l’effet des deux bactérines sur la réponse immunitaire chez les poules pondeuses, de vérifier la protection conférée par ces vaccins contre l’infection expérimentale à SE, et d’identifier des protéines immunogènes afin de développer un vaccin sous-unitaire. Les oiseaux ont été vaccinés avec deux protocoles d’immunisation en cours d’élevage (soit à 12 et 18, ou à 16 semaines d’âge). Le groupe contrôle a été injecté avec la solution saline. Les oiseaux ont été inoculés per os avec 2 x 109 CFU de la souche SE lysotype 4 à 55 ou à 65 semaines d’âge. Les anticorps (IgG et IgA) ont été mesurés à différents temps avec un ELISA maison en utilisant l’antigène entier de SE. La phagocytose, flambée oxydative, les populations des splénocytes B et T ont été analysées en utilisant la cytométrie en flux. Les signes cliniques, l’excrétion fécale, la contamination des jaunes d’œufs et l’invasion des salmonelles dans les organes ont été étudiés pour évaluer l’efficacité de protection. La transmission horizontale a aussi été étudiée en évaluant l’infection à SE chez les oiseaux mis en contact avec les oiseaux inoculés. Les protéines immunogènes ont été identifiées par SDS-PAGE et Western blot à l’aide d’antisérums prélevés suite à la vaccination et/ou à l’infection expérimentale/naturelle, puis caractérisées par la spectrométrie de masse. Le protocole de vaccination avec deux immunisations a généré un niveau élevé de séroconversion à partir de 3 jusqu’à 32-34 semaines post-vaccination par rapport à celui avec une seule immunisation (p < 0.02), mais il n’y avait plus de différence entre les groupes à 54 et 64 semaines d’âge. Il n’y a pas eu de corrélation entre les niveaux d’IgG et les taux d’isolement des salmonelles dans les organes et des jaunes d’œuf. La production des IgA n’a été observée que chez les oiseaux vaccinés avec 2 injections de MBL SE4C (p ≤ 0.04). Après l’infection expérimentale, la production des IgA a été significativement plus élevée aux jours 1 et 7 p.i dans l’oviducte des oiseaux vaccinés (sauf pour le groupe vacciné avec 2 injections de Layermune) par comparaison avec le groupe contrôle (p ≤ 0.03). Seule la bactérine MBL SE4C a eu un effet protecteur contre la contamination des jaunes d’œuf chez les oiseaux infectés. Ce vaccin réduit partiellement en utilisant deux immunisations, le taux d’excrétion fécale des salmonelles chez les oiseaux inoculés et les oiseaux horizontalement infectés (p ≤ 0.02). Cinq des protéines identifiées par la spectrométrie de masse sont considérées comme des protéines potentiellement candidates pour une étude plus approfondie de leur immonogénicité: Lipoamide dehydrogenase, Enolase (2-phosphoglycerate dehydratase) (2-phospho-D-glycerate hydro-lyase), Elongation factor Tu (EF-Tu), Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) et DNA protection during starvation protein. En général, les bactérines ont induit une immunité humorale (IgG et IgA) chez les poules pondeuses. Cette réponse immunitaire a protégé partiellement les oiseaux quant à l’élimination des salmonelles, la contamination des jaunes d’œuf, ainsi que la transmission horizontale. Dans cette étude, la bactérine MBL SE4C (avec deux immunisations) s’est montrée plus efficace pour protéger les oiseaux que la bactérine Layermune. Nos résultats apportent des informations objectives et complémentaires sur le potentiel de deux bactérines pour lutter contre SE chez les poules pondeuses. Étant donné la protection partielle obtenue en utilisant ces vaccins, l’identification des antigènes immunogènes a permis de sélectionner des protéines spécifiques pour l’élaboration éventuelle d’un vaccin plus efficace contre SE chez les volailles. / Contaminated eggs and egg products have been associated with outbreaks of human Salmonella Enteritidis (SE) infections. Killed bacteria (bacterins) have been used to control Salmonella infections in poultry but variation in the conferred protection has been observed. In Canada the bacterins MBL SE4C and Layermune are currently used to control SE. However, their efficacy in protecting older layers has not been fully determined. Furthermore, the capacity of these bacterins to prevent vertical and horizontal transmissions has not yet been investigated. The main objectives of this study were to evaluate the effect of two available commercial bacterins on the immune response of laying hens, to verify the protection conferred by these vaccines against SE challenge and to identify immunogenic proteins to develop an oral subunit vaccine. Laying hens were vaccinated with two immunization schedules prior to the lay cycle (either at 12 and 18, or 16 weeks of age). The control group was injected with a saline solution. Laying hens were later inoculated per os with 2 x 109 CFU of SE PT4 strain either at 55 or 65 weeks of age. Serum IgG and mucosal IgA antibodies were measured with an in-house SE whole cell antigen ELISA. The phagocytosis, oxidative burst, splenic T and B cells populations were analyzed using flow cytometry. Clinical signs, fecal shedding, egg yolks contamination and organ invasion by SE were assessed to evaluate vaccine protection. Potential horizontal transmission from inoculated laying hens to non-inoculated laying hens, housed in the same isolator unit, was also evaluated. Immunogenic proteins were identified by SDS-PAGE and Western blot with sampled antisera during vaccination and/or infection of poultry with SE and then subjected to mass spectrometry. The vaccination protocol with two immunizations showed a higher seroconversion level than the single vaccination at 3 until 32-34 weeks post vaccination (p < 0.02) but no difference before challenge (54 and 64 old weeks). There was no relationship between high IgG level and SE isolation rates in organs and egg yolks. Only the MBL SE4C vaccine elicited IgA antibody production at 3 weeks post vaccination in both immunization protocols (p ≤ 0.04). Significant higher mucosal IgA levels were observed at day 1 and 7 post challenge in oviduct of vaccinated birds (except for the twice vaccinated Layermune group) compared to the control group (p ≤ 0.03). Humoral efficacy to protect from SE contamination of egg yolk was only observed in MBL SE4C vaccinated group and only this bacterin administered twice reduced SE shedding rate in inoculated birds and their exposed cagemates (p ≤ 0.02). A set of 5 proteins were considered as putative protein candidates to further detailed study on their immunogenicity: Lipoamide dehydrogenase; Enolase (2-phosphoglycerate dehydratase) (2-phospho-D-glycerate hydro-lyase); Elongation factor Tu (EF-Tu); Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and DNA protection during starvation protein. Overall, the commercial bacterins induced humoral immunity (IgG and IgA antibodies) in laying hens. This immune response partially protected for SE clearance, egg yolks contamination as well as horizontal transmission. In this study, MBL SE4C bacterin appeared to be more efficient in comparison to Layermune for protection of hens with a vaccination protocol comprising two immunizations. Our results provide additional and objective information on the potential of these vaccines for the control of SE in laying hens. Considering the partial protection achieved with the use of these bacterins, the identification of immunogenic antigens could help in the selection of specific proteins to elaborate a more efficient vaccine against SE in poultry.

L’œuf est un aliment riche en divers composés dont de nombreuses molécules antimicrobiennes qui sont les effectrices de son système de défense moléculaire innée et complètent l’action des immunoglobulines (IgYs) afin de protéger l’embryon. La composition en IgYs de l’œuf est sous la dépendance notamment des stimulations microbiennes de la poule. L’objectif de notre travail a été d’évaluer l’influence de ces mêmes stimulations sur le système de défense moléculaire innée du blanc d’œuf. Nous avons exploré cette hypothèse en utilisant deux approches expérimentales. La première était basée sur la comparaison de l’activité antibactérienne des blancs d’œufs de poules axéniques, de poules exemptes d’organismes pathogènes spécifiques (EOPS), et de poules conventionnelles. La seconde approche a testé les effets de deux types d’inductions du système immunitaire chez la poule: injection d’un immunostimulant, le lipopolysaccharide bactérien (LPS) et administration oral de souches vaccinales atténuées (virale, bactérienne et parasitaire). Nos résultats montrent que l’activité antibactérienne du blanc d’œuf est augmentée en fonction de la charge microbienne du milieu de vie de la poule, après stimulation de celle-ci par voie intraveineuse avec du LPS ou suite à la vaccination avec des souches atténuées virale ou bactérienne. Néanmoins cette augmentation est modérée de par son amplitude et son spectre antibactérien. Ces résultats suggèrent que les poules peuvent renforcer modérément l’activité antimicrobienne du blanc d’œuf en réponse à des stimuli microbiens de leur milieu et anticiper ainsi les besoins de l’embryon en termes de protection. / The egg is a balanced source of different nutrients and contains a myriad of antibacterial peptides/proteins that ensure its chemical protection. These molecules are a part of its innate molecular defense and, in addition to the maternal immunoglobulins IgY, contribute to the protection of the forming embryo whose development occurs ex utero. It is well documented that yolk immunoglobulin deposition is induced by the environmental microbiome of the hen but no such evidence is available for antimicrobial peptides/proteins. Therefore the aim of this thesis was to assess whether the hen has the ability to stimulate the innate molecular immunity of the egg white when facing a higher environmental microbial load (commensal or pathogenic). To address these questions, we developed two main experimental approaches; the first assessed the impact of the hen environmental microbial load through the comparison of three groups of hens with different immune status:-Germ free, -Specific pathogen free (SPF), and -conventional. The second approach explored the effect of different types of immune stimulation in hens: non-infectious stimulation (systemic injection of bacterial lipopolysaccharide (LPS)); immune stimulation using attenuated live vaccines (Infectious bronchitis virus vaccine, Salmonella enterica Enteritidis vaccine and a complex of Eimeria vaccine). Our results show that the activity of egg white is increased in response to higher microbial environmental charge, after LPS systemic stimulation or after vaccinating hens with live attenuated viral and bacterial strains. However this response is moderate both in its amplitude and microbial spectrum. Altogether, it appears that hens when subjected to immune stimuli, have the ability to reinforce moderately the antibacterial activity of the egg white as an attempt to anticipate the need of protection of their embryos.

Les infections à Salmonella Enteritidis chez les humains sont associées à la consommation d’œufs ou d’ovoproduits contaminés. La vaccination est un outil utilisé pour diminuer les risques d’infection à SE chez la volaille, mais avec des résultats variables. Au Canada deux bactérines, MBL SE4C et Layermune, sont couramment utilisées pour lutter contre SE. Cependant, leur efficacité n’a pas été complètement déterminée chez les poules pondeuses plus âgées. Par ailleurs, la capacité de ces vaccins à prévenir la transmission verticale et horizontale n’a pas encore été étudiée. L’objectif principal de cette étude était d’évaluer l’effet des deux bactérines sur la réponse immunitaire chez les poules pondeuses, de vérifier la protection conférée par ces vaccins contre l’infection expérimentale à SE, et d’identifier des protéines immunogènes afin de développer un vaccin sous-unitaire. Les oiseaux ont été vaccinés avec deux protocoles d’immunisation en cours d’élevage (soit à 12 et 18, ou à 16 semaines d’âge). Le groupe contrôle a été injecté avec la solution saline. Les oiseaux ont été inoculés per os avec 2 x 109 CFU de la souche SE lysotype 4 à 55 ou à 65 semaines d’âge. Les anticorps (IgG et IgA) ont été mesurés à différents temps avec un ELISA maison en utilisant l’antigène entier de SE. La phagocytose, flambée oxydative, les populations des splénocytes B et T ont été analysées en utilisant la cytométrie en flux. Les signes cliniques, l’excrétion fécale, la contamination des jaunes d’œufs et l’invasion des salmonelles dans les organes ont été étudiés pour évaluer l’efficacité de protection. La transmission horizontale a aussi été étudiée en évaluant l’infection à SE chez les oiseaux mis en contact avec les oiseaux inoculés. Les protéines immunogènes ont été identifiées par SDS-PAGE et Western blot à l’aide d’antisérums prélevés suite à la vaccination et/ou à l’infection expérimentale/naturelle, puis caractérisées par la spectrométrie de masse. Le protocole de vaccination avec deux immunisations a généré un niveau élevé de séroconversion à partir de 3 jusqu’à 32-34 semaines post-vaccination par rapport à celui avec une seule immunisation (p < 0.02), mais il n’y avait plus de différence entre les groupes à 54 et 64 semaines d’âge. Il n’y a pas eu de corrélation entre les niveaux d’IgG et les taux d’isolement des salmonelles dans les organes et des jaunes d’œuf. La production des IgA n’a été observée que chez les oiseaux vaccinés avec 2 injections de MBL SE4C (p ≤ 0.04). Après l’infection expérimentale, la production des IgA a été significativement plus élevée aux jours 1 et 7 p.i dans l’oviducte des oiseaux vaccinés (sauf pour le groupe vacciné avec 2 injections de Layermune) par comparaison avec le groupe contrôle (p ≤ 0.03). Seule la bactérine MBL SE4C a eu un effet protecteur contre la contamination des jaunes d’œuf chez les oiseaux infectés. Ce vaccin réduit partiellement en utilisant deux immunisations, le taux d’excrétion fécale des salmonelles chez les oiseaux inoculés et les oiseaux horizontalement infectés (p ≤ 0.02). Cinq des protéines identifiées par la spectrométrie de masse sont considérées comme des protéines potentiellement candidates pour une étude plus approfondie de leur immonogénicité: Lipoamide dehydrogenase, Enolase (2-phosphoglycerate dehydratase) (2-phospho-D-glycerate hydro-lyase), Elongation factor Tu (EF-Tu), Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) et DNA protection during starvation protein. En général, les bactérines ont induit une immunité humorale (IgG et IgA) chez les poules pondeuses. Cette réponse immunitaire a protégé partiellement les oiseaux quant à l’élimination des salmonelles, la contamination des jaunes d’œuf, ainsi que la transmission horizontale. Dans cette étude, la bactérine MBL SE4C (avec deux immunisations) s’est montrée plus efficace pour protéger les oiseaux que la bactérine Layermune. Nos résultats apportent des informations objectives et complémentaires sur le potentiel de deux bactérines pour lutter contre SE chez les poules pondeuses. Étant donné la protection partielle obtenue en utilisant ces vaccins, l’identification des antigènes immunogènes a permis de sélectionner des protéines spécifiques pour l’élaboration éventuelle d’un vaccin plus efficace contre SE chez les volailles. / Contaminated eggs and egg products have been associated with outbreaks of human Salmonella Enteritidis (SE) infections. Killed bacteria (bacterins) have been used to control Salmonella infections in poultry but variation in the conferred protection has been observed. In Canada the bacterins MBL SE4C and Layermune are currently used to control SE. However, their efficacy in protecting older layers has not been fully determined. Furthermore, the capacity of these bacterins to prevent vertical and horizontal transmissions has not yet been investigated. The main objectives of this study were to evaluate the effect of two available commercial bacterins on the immune response of laying hens, to verify the protection conferred by these vaccines against SE challenge and to identify immunogenic proteins to develop an oral subunit vaccine. Laying hens were vaccinated with two immunization schedules prior to the lay cycle (either at 12 and 18, or 16 weeks of age). The control group was injected with a saline solution. Laying hens were later inoculated per os with 2 x 109 CFU of SE PT4 strain either at 55 or 65 weeks of age. Serum IgG and mucosal IgA antibodies were measured with an in-house SE whole cell antigen ELISA. The phagocytosis, oxidative burst, splenic T and B cells populations were analyzed using flow cytometry. Clinical signs, fecal shedding, egg yolks contamination and organ invasion by SE were assessed to evaluate vaccine protection. Potential horizontal transmission from inoculated laying hens to non-inoculated laying hens, housed in the same isolator unit, was also evaluated. Immunogenic proteins were identified by SDS-PAGE and Western blot with sampled antisera during vaccination and/or infection of poultry with SE and then subjected to mass spectrometry. The vaccination protocol with two immunizations showed a higher seroconversion level than the single vaccination at 3 until 32-34 weeks post vaccination (p < 0.02) but no difference before challenge (54 and 64 old weeks). There was no relationship between high IgG level and SE isolation rates in organs and egg yolks. Only the MBL SE4C vaccine elicited IgA antibody production at 3 weeks post vaccination in both immunization protocols (p ≤ 0.04). Significant higher mucosal IgA levels were observed at day 1 and 7 post challenge in oviduct of vaccinated birds (except for the twice vaccinated Layermune group) compared to the control group (p ≤ 0.03). Humoral efficacy to protect from SE contamination of egg yolk was only observed in MBL SE4C vaccinated group and only this bacterin administered twice reduced SE shedding rate in inoculated birds and their exposed cagemates (p ≤ 0.02). A set of 5 proteins were considered as putative protein candidates to further detailed study on their immunogenicity: Lipoamide dehydrogenase; Enolase (2-phosphoglycerate dehydratase) (2-phospho-D-glycerate hydro-lyase); Elongation factor Tu (EF-Tu); Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and DNA protection during starvation protein. Overall, the commercial bacterins induced humoral immunity (IgG and IgA antibodies) in laying hens. This immune response partially protected for SE clearance, egg yolks contamination as well as horizontal transmission. In this study, MBL SE4C bacterin appeared to be more efficient in comparison to Layermune for protection of hens with a vaccination protocol comprising two immunizations. Our results provide additional and objective information on the potential of these vaccines for the control of SE in laying hens. Considering the partial protection achieved with the use of these bacterins, the identification of immunogenic antigens could help in the selection of specific proteins to elaborate a more efficient vaccine against SE in poultry.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:07:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bruno Moreira dos Santos.pdf: 1247355 bytes, checksum: 0185960f0c501c39a8a1fe75c03cd92b (MD5) Previous issue date: 2010-03-01 / The development of Brazilian aviculture leads to increasingly higher rates of production and quality, with genetics and management studies. The growing and post-laying phases are decisive for the development and productivity of the adult hen and nutrition studies aim at finding the ideal relation among nutrient offer productivity, cost and sustainability. This study had as objective to determine the relationship between the level of crude protein and supplementation of synthetic amino acid L-lysine-HCl, ensuring perfect development of the pullet, production efficiency of the chicken and reduction of nitrogenous products excretion in the environment. The Dekalb White chicks were acquired at one day of age and subjected to growth phase in a commercial farm. The experiment comprised the period between the 11 th and 19 th weeks of age. The weights of the pullets were determined until the appearance of the first egg (19 weeks) and the data about the egg quality 32 weeks of age. Ration supply and egg production were weekly and daily calculated, respectively. The experimental design was completely randomized in a 2x4 factorial design with the following factors: crude protein levels (14% and 16%) and lysine levels (0.484, 0.584, 0.684 and 0.784 mg / kg diet); with eight treatments and four replications, with 10 birds per plot, totaling 320 birds. For the digestibility trial, 64 birds were housed in the same shed, and divided into four birds per treatment. The study showed interaction for feed intake in the 13 th, 15 th, 17 th, 19 th and 20 th weeks, feed conversion in the 11 th and 15 th weeks, weight gain in the 11 th, 15 th and 17 th weeks and for the relation protein-weight gain in the total period, effect of lysine levels on lysine intake in the 15 th, 16 th, 20 th weeks, total period and the relation between lysine intake and weight gain. There was interaction between the levels on feed intake and lysine intake for the 13th, 17 th and 19 th weeks of energy consumption and the 17 th and 19 th weeks. The study showed effects of lysine levels for weight of the oviduct (%), abdominal fat and intestine weight (g), and a significant interaction for oviduct weight (g), wattle weight, ovary weight, and liver weight. No significant effects for age at first egg, 50% of production and serum biochemical values. There was significant interaction in the 12 th week for produced excreta, ingestion, balance and digestibility of ether extract. In the 14 th week there was interaction for feed intake, dry matter ingestion, nitrogen balance and intake, and ether extract balance and digestibility. The experiment showed interaction protein and lysine in the metabolic trial in the 16 th week for nitrogen excreta, excreta produced, nitrogen balance (g e %) and dry matter digestibility (%) and ether extract digestibility. The different levels of crude protein and lysine affected the production variables but they did not affect the quality parameters of eggs, suggesting that the level of 14% of crude protein and 0.484 mg / kg feed of lysine. satisfactorily meet the requirements of the laying hen without compromising their development and production. / O desenvolvimento da avicultura brasileira leva as aves a índices de produção e qualidade cada vez mais eficientes, com estudos na área genética e manejo. A fase de recria e pré-postura é decisiva para o desenvolvimento e produtividade da galinha adulta e os estudos de nutrição buscam o ideal entre nutrientes fornecidos, produtividade, custo e sustentabilidade. Com o presente estudo, busca-se determinar a relação entre o nível de proteína bruta e a suplementação do aminoácido sintético L-lisina-HCl, garantindo o perfeito desenvolvimento da franga, a eficiência produtiva da galinha e a menor excreção de produtos nitrogenados na natureza. As aves, da linhagem Dekalb White, adquiridas com um dia de idade foram submetidas à fase de cria em granja comercial. A fase experimental compreendeu o período entre a 11ª e 19ª semanas de idade. Foram determinados os pesos das aves até o aparecimento do primeiro ovo (19 semanas) e os dados de qualidade de ovos até as 32 semanas de idade. O fornecimento de ração foi calculado semanalmente e a produção de ovos diariamente. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado em esquema fatorial 2x4 com os fatores: níveis de proteína bruta (14% e 16%) e níveis de lisina digestível (0,484, 0,584, 0,684 e 0,784 mg/kg de ração) com oito tratamentos e quatro repetições, 10 aves por parcela, totalizando 320 aves. Para o ensaio de digestibilidade 64 aves foram alojadas no mesmo galpão, e divididas em quatro aves por tratamento. Houve interação para consumo de ração na 13ª, 15ª, 17ª, 19ª e 20ª semanas, conversão alimentar as 11ª e 15ª semanas, ganho de peso as 11ª, 15ª e 17ª semanas e para relação proteína ganho de peso no período total, efeito dos níveis de lisina digestível para consumo lisina as 15, 16, 20 semanas, período total e relação entre consumo de lisina e ganho de peso. Houve interação entre os níveis para consumo de ração e consumo de lisina para as 13ª, 17ª e 19 semanas e consumo de energia as 17ª e 19ª semanas. Efeito dos níveis de lisina digestível para peso do oviduto (%), gordura abdominal e peso do intestino (g) e interação significativa para peso de oviduto (g), peso de barbela, peso de ovário, e peso de fígado. Não houve efeito significativo para idade ao primeiro ovo e 50% de produção e para os valores bioquímicos séricos. Houve interação significativa as 12 semanas para excreta produzida, ingestão, balanço e digestibilidade do extrato etéreo. As 14 semanas observou-se interação para consumo de ração, matéria seca ingerida, balanço e ingestão de nitrogênio,balanço e digestibiildade de extrato etéreo. Interação proteína e lisina digestível no ensaio metabólico às 16 semanas para nitrogênio da excreta, excretas produzida, balanço de nitrogênio (g e %) e digestibilidade da matéria seca (%) e do extrato etereo. Os diferentes níveis de proteína bruta e lisina digestível influenciaram as variáveis de produção porém não houve efeito dos mesmo quanto aos parametros de qualidade de ovos, sugerindo que o nível de 14% de proteína bruta e 0,484 mg/kg de ração de lisina digestível atendem satisfatoriamente as exigências da franga de postura sem comprometer seu desenvolvimento e produção.

No description available.