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Charles University Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biological and Medical Sciences Study program: Healthcare Bioanalytics Author: Bc. Dominika Polová Supervisor: RNDr. Klára Konečná, Ph.D. Title of thesis: Galleria mellonella in vivo model for the study of antimicrobial drug vs. pathogen interaction Background: This study focuses on establishment of the in vivo invertebrate mo- del Galleria mellonella primarily for the study of in vivo efficacy and toxicity of newly synthetized compounds with proved antiinfective potential. Major part of the study is devoted to optimization of conditions for laboratory insect rearing, determination of lethal infectious doses after infection of Galleria mellonella larvae by methicillin re- sistant Staphylococcus aureus, implementation of methodical approach for assessing the relative acute toxicity of candidate antiinfective compounds, and establishment of laboratory manuals for routine histopathological studies. Methods: In the study Galleria mellonella larvae were reared in stable laboratory con- ditions (37 ◦ C) and in the presence of rich nutrition. Sowing method was used in or- der to obtain infectious LD50. In the preliminary study we focused on acute toxicity of tested compounds and on methodology optimization leading to histopathological...

This research compares LC50 and LD50 of earthworms, Lumbricus terrestris and Eisenia foetida exposed to cadmium nitrate and chlordane using 48-h contact filter paper (FP) and 14-d artificial soil (AS) protocols. Both LC50 and LD50 showed that chlordane was more toxic than cadmium in both species regardless of the exposure. The reference toxicant 2-chloroacetamide using the standardized 48-h FP exposure was used to assess the general response of the earthworm prior to toxicity experiments. A glucose test was developed as an internal standard to assess homogeneity of mixtures among both replicates and dilutions. Accuracy of dilutions is assessed by the slope of a regression line relating nominal dilution to observed internal standard concentration. Precision of replicate preparation is assessed by among replicate variance.

The toxicological screening of the numerous chemicals that we are exposed to requires significant cost and the use of animals. Accordingly, more efficient methods for the evaluation of toxicity are required to reduce cost and the number of animals used. Computational strategies have the potential to reduce both the cost and the use of animal testing in toxicity screening. The ultimate goal of this thesis is to develop computational models for the prediction of toxicological endpoints that can serve as an alternative to animal testing. In Paper I, an attempt was made to construct a global quantitative structure-activity relationship (QSAR)model for the acute toxicity endpoint (LD50 values) using the Munro database that represents a broad chemical landscape. Such a model could be used for acute toxicity screening of chemicals of diverse structures. Paper II focuses on the use of acute toxicity data to support the prediction of chronic toxicity. The results of this study suggest that for related chemicals having acute toxicities within a similar range, their lowest observed effect levels (LOELs) can be used in read-across strategies to fill gaps in chronic toxicity data. In Paper III a k-nearest neighbor (k-NN) classification model was developed to predict human ether-a-go-go related gene (hERG)-derived toxicity. The results suggest that the model has potential for use in identifying compounds with hERG-liabilities, e.g. in drug development.

Submitted by Danielle Karla Martins Silva (danielle.martins@ufpe.br) on 2015-03-13T13:09:14Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO Douglas Lopes Bernardo.pdf: 1660700 bytes, checksum: bbe41d2998cebacbca523ea3d1b92b7c (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-13T13:09:14Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO Douglas Lopes Bernardo.pdf: 1660700 bytes, checksum: bbe41d2998cebacbca523ea3d1b92b7c (MD5) Previous issue date: 2014 / A avaliação do potencial carcinogênico de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPA) e seus metabólitos é realizada através de Análise de Componentes Principais (ACP) e da Relação Quantitativa da Estrutura-Atividade (QSAR) usando descritores hidrofóbico (LogP), estéreos (volume e área superficial) e eletrônicos (EAadia, μ e ΔEL-H). Os descritores eletrônicos foram obtidos com cálculos químico-quânticos do tipo AM1. O modelo de interação DNA-HPA usado é baseado na Teoria de Ressonância não sincronizada da ligação covalente (RVB) de L. Pauling, onde essa interação é descrita como uma transferência de elétron entre os orbitais de fronteira HOMO e LUMO. No estudo QSAR foram reproduzidos valores experimentais do LD50 (dose letal para matar 50% de uma população de ratos) com seis modelos matemáticos de regressão validados estatisticamente com 95% de confiança, com destaque para o modelo 4 que reproduziu com erro relativo < 1% o LD50 do antraceno, benzo[a]antraceno e benzo[a]pireno. A ACP foi refinada utilizando dados eletrônicos de metabólitos dos HPA, obtendo-se uma indicação de que são potencialmente carcinógenos, um resultado importante, uma vez que muitos dos HPA estudados estão no grupo 3 do IARC (International Agency for Research on Cancer), ou seja, não estão classificados quanto à sua carcinogenicidade, indicando que eles precisam urgentemente serem reavaliados.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:48:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A busca por agentes anticâncer, antiinflamatórios e analgésicos com poucos efeitos colaterais é um dos maiores desafios na pesquisa moderna, e cada vez mais está relacionada aos usos etnomédicos de plantas e outros produtos naturais. Caesalpinia ferrea é uma árvore largamente distribuída no Brasil e usada popularmente para muitos fins, inclusive na prevenção do câncer e no tratamento da inflamação e da dor. O objetivo deste trabalho foi avaliar as atividades citotóxica, antitumoral, antiinflamatória e analgésica do extrato bruto aquoso (CE) e de uma fração (F80) da vagem de C. ferrea, utilizando as linhagens celulares NCI-H292 e HEp-2 e, em camundongos, o tumor sólido Sarcoma-180, peritonite induzida por carragenina e contorções abdominais induzidas por ácido acético. Os resultados das atividades citotóxica e antitumoral revelaram que apenas F80 inibiu o crescimento das células NCI-H292 (25,6%; 14,3% e 7,8%, nas concentrações 50; 25; e 12,5 &#61549;g/mL, respectivamente); e que a redução no peso do tumor Sarcoma-180 promovida por F80 não foi significativa (8,68%, 100 mg/kg peso corporal). CE e F80 não reduziram o crescimento das células HEp-2. A LD50 para ambos os preparados ficou estabelecida em 2500 mg/kg peso corporal. Os dados obtidos da atividade antiinflamatória revelaram que CE e F80 (100 mg/kg) apresentam efeito antiinflamatório significativo, evidenciado pela redução (40,9% e 38,2%, respectivamente) do número de leucócitos no exsudato inflamatório. Ambos os preparados provocaram um decréscimo no conteúdo de nitrito; enquanto CE reduziu-o a um nível mínimo, abaixo dos obtidos com as drogas padrão piroxicam e dexametasona, F80 apresentou resultado similar a estas. Com relação à atividade analgésica, CE e F80 (100 mg/kg) reduziram em 56,60% e 72,72%, respectivamente, o número de contorções induzidas por ácido acético. Em conclusão, CE e F80 não apresentam atividades citotóxica e antitumoral significativas contra as células e o tumor testados; porém, a baixa toxicidade permite seu uso com certa segurança em outras situações. Contudo, possuem atividades antiinflamatória e analgésica, corroborando a base farmacológica do uso etnomédico de C. ferrea

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Made available in DSpace on 2016-06-02T18:55:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4432.pdf: 1388434 bytes, checksum: d65f99bf92f697e1cf8e1d2b5a5fc2f9 (MD5) Previous issue date: 2012-05-09 / Financiadora de Estudos e Projetos / Melipona scutellaris bee, known as "uruçu" belong to the tribe Meliponini, popularly called stingless bees. This bee is endemic in northeastern Brazil and is distinguished by its ease of domestication and management, significant honey production and potential for pollination in greenhouses and open field. The insecticide fipronil acts on the insect nervous system by blocking the chloride channels through of the receptors gamma-aminobutyric acid (GABA) and glutamate (GluCl). Widely used in Brazil and more than 70 countries is considered highly toxic to bees, which is why its use was banned in France in 2004. Toxicological studies of pesticides to bees use mostly as a model species A. mellifera bee, which sublethal doses of fipronil can cause behavioral changes related to core tasks for the colony, such as feeding and foraging. However, differences in susceptibility between species of bees to insecticides may expose native bees there is a greater risk. The aim of this study was to determine the topical LD50 and oral LC50 of insecticide fipronil for stingless bee M. scutellaris and evaluate the effects of fipronil sublethal doses and concentrations in the locomotor activity and in the Proboscis Extension Reflex (PER) these bees. Foragers were collected in the output of three different colonies, consisting of three repetitions with ten bees each and they were placed in plastic pots of 250 mL. Bees subjected to topical treatments were anesthetized with CO2 and received 1.0 &#956;L insecticide solution on pronotum with previously established doses (0.0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 and 5.0 ng of fipronil / &#956;L solution), applied with a repetitive automatic micropipette. Bees subjected to oral contamination received sucrose solution contaminated with concentrations of fipronil determined previously (0.0, 0.005, 0.01, 0.03, 0.05, and 0.5 ng a.i./ &#956;L sucrose solution) for 24 hours. The insecticide fipronil was considered highly toxic to these bees, both topically and orally. The topical intoxication resulted in a LD50 (48 hours) was 0.41 ng / bee (4.1 ng / g bee). The oral contamination resulted in a LC50 (48 hours) was 0.011 ng / &#956;L of sucrose solution or, considering the amount of food they forage M. scutellaris consume daily in an oral LD50 of 0.6 ng a.i. / bee. The topic sublethal dose 0.05 ng a.i./bee and oral sublethal concentration 0.0011 ng a.i./ &#956;L sucrose solution were cause significant changes for the locomotor activity these bees. The PER don't was a functional methodology for M. scutellaris bees. Results show that the bee M. scutellaris is more sensitive to fipronil than A. mellifera and that fipronil sublethal dose and concentrations affected the locomotor activity these bees. / A abelha Melipona scutellaris, conhecida como uruçu , pertencem à tribo Meliponini, popularmente chamadas de abelhas sem ferrão. Essa abelha é endêmica do nordeste brasileiro e se destaca por sua fácil domesticação e manejo, expressiva produção de mel e potencial para polinização em ambientes protegidos e campo aberto. O inseticida fipronil atua no sistema nervoso dos insetos bloqueando os canais de cloro através dos receptores ácido gama-aminobutírico (GABA) e glutamato (GluCl). Amplamente usado no Brasil e em mais de 70 países é considerado altamente tóxico para abelhas, motivo pelo qual seu uso foi proibido na França em 2004. Estudos toxicológicos de inseticidas para abelhas utilizam em sua grande maioria como espécie modelo a abelha A. mellifera, na qual doses subletais de fipronil causam alterações comportamentais relacionadas a tarefas fundamentais para a colônia, como alimentação e forrageamento. No entanto, diferenças quanto à suscetibilidade entre as espécies de abelhas aos inseticidas poderiam estar expondo as abelhas nativas a um maior risco. O objetivo desse trabalho foi determinar a DL50 tópica e a CL50 oral do inseticida fipronil para abelhas sem ferrão M. scutellaris e avaliar os efeitos das doses e concentrações subletais desse inseticida na atividade locomotora e no Reflexo de Extensão da Probóscide (REP) dessas abelhas. As forrageiras foram coletadas na saída de três colmeias diferentes, consistindo em três repetições formadas por dez abelhas cada e colocadas em potes plásticos de 250 mL. Abelhas submetidas aos tratamentos tópicos foram anestesiadas com CO2 e receberam 1.0 &#956;L de solução de inseticida no pronoto com doses previamente estabelecidas (0.0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 e 5.0 ng de fipronil/&#956;L de solução), aplicadas com uma micropipeta automática repetitiva. Abelhas submetidas aos tratamentos de contaminação oral receberam solução de sacarose com as concentrações de fipronil determinadas anteriormente (0.0, 0.005, 0.01, 0.03, 0.05, e 0.5) durante 24 horas. O inseticida fipronil foi considerado altamente tóxico para essas abelhas, tanto por via tópica como oral. A intoxicação tópica resultou em uma DL50 (48 horas) de 0.41 ng i.a./abelha (4.1 ng i.a./g de abelha). A contaminação oral resultou em uma CL50 (48 horas) de 0.011 ng i.a./&#956;L de solução de sacarose ou, considerando a quantidade de alimento que as forrageiras de M. scutellaris consomem por dia, em uma DL50 oral de 0.6 ng i.a./abelha. A dose subletal tópica de 0.05 ng i.a./abelha e a concentração subletal oral de 0.0011 ng i.a. /&#956;L de solução de sacarose causaram alterações significativas para a atividade locomotora dessas abelhas. O REP não foi uma metodologia funcional para abelhas M. scutellaris. Os resultados mostram que a abelha M. scutellaris é mais sensível ao fipronil que A. mellifera e que doses e concentrações subletais desse inseticida afetam a atividade locomotora dessas abelhas.

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2016-10-17T19:20:47Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Diogo Nery Maciel - 2016.pdf: 6569625 bytes, checksum: 88b08e397d1fe85ad26417e8b0f2a08c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2016-10-18T17:16:36Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Diogo Nery Maciel - 2016.pdf: 6569625 bytes, checksum: 88b08e397d1fe85ad26417e8b0f2a08c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-18T17:16:36Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Diogo Nery Maciel - 2016.pdf: 6569625 bytes, checksum: 88b08e397d1fe85ad26417e8b0f2a08c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-09-13 / The increase in insecticide application for control the rice stalk stink bug Tibraca limbativentris Stal (Hemiptera: Pentatomidae) in irrigated rice in Brazil, has been reported by producers as responsible for loss of effectiveness of some insecticides commonly used to manage this insect and this is the base of this investigation. The insecticides used in this study were: bifenthrin, carbosulfan, etophenprox, λ-cyhalothrin, and thiametoxam. Six populations of insects were collected in producing areas of the states of Tocantins, Goiás and Santa Catarina, Brazil. Insect adults of each population were submitted to discriminant concentrations (LC95s) previously determined for the population collected in natural habitat in Santo Antônio de Goiás, and used as standard susceptible population. The frequency of individuals resistant in the population of Formoso do Araguaia was 76% for carbosulfan, 86% for bifenthrin, 72% for etofenprox, 80% for L-cyalothrin, and 80% for thyamethoxam. Although the frequencies of resistant individuals can be considered low to moderate, it is first report of resistance of T. limbativentris to insecticides. These results indicate the resistance development to other insecticides with different mode of actions, with emphasis to the stink bug populations of Formoso do Araguaia-TO. These results also indicates a possible occurrence of crossed a resistance or multiple in that population. / O aumento no uso de inseticidas ​​para o controle do percevejo-do- colmo Tibraca limbativentris Stal 1860 (Hemiptera: Pentatomidae) em lavouras de arroz irrigado no Brasil, associado a relatos de produtores sobre perda de eficácia dos produtos comumente usados, embasaram a condução desta investigação sobre a possível ocorrência de resistência aos inseticidas: bifentrina, carbosulfan, etofenproxi, lambda-cialotrina e tiametoxan. As populações de insetos foram coletadas em seis áreas de produção de arroz irrigado nos estados de Tocantins, Goiás e Santa Catarina, Brasil. Insetos adultos destas populações foram estabelecidos em gaiolas teladas de criação em casa de vegetação e em laboratório foram submetidos a concentrações discriminantes (LC 95 s) estimadas para a população de Santo Antônio de Goiás, coletada em ambiente natural e usada como população-padrão de susceptibilidade. As frequências de mortalidade de indivíduos para a população de Formoso do Araguaia foi de 76% para o inseticida carbosulfan, 86% para bifentrina, 72% para etofenproxi, 80% para L-cialotrina e de 80% para o inseticida tiametoxan. Embora as frequências de indivíduos resistentes encontradas sejam consideradas de baixas a moderadas, trata-se do primeiro registro de T. limbativentris resistentes a inseticidas e, já se percebe a extensão do problema com relação ao desenvolvimento de resistência a produtos de diferentes grupos e modos de ação, principalmente na região produtora de Formoso do Araguaia- TO. Os resultados desta pesquisa indicam uma possível ocorrência de resistência cruzada ou múltipla nessa população.

Submitted by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2015-03-20T22:54:55Z No. of bitstreams: 2 Efeito da associação entre os probióticos Saccharomyces boulardii e Bacilus cereus var. Toyoi sobre a proteção contra desafio com Salmonella Typhimurium em camundongos.pdf: 950556 bytes, checksum: d9746b0e55dab14349d49ea0ff188774 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2015-03-20T23:36:20Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Efeito da associação entre os probióticos Saccharomyces boulardii e Bacilus cereus var. Toyoi sobre a proteção contra desafio com Salmonella Typhimurium em camundongos.pdf: 950556 bytes, checksum: d9746b0e55dab14349d49ea0ff188774 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2015-03-20T23:36:52Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Efeito da associação entre os probióticos Saccharomyces boulardii e Bacilus cereus var. Toyoi sobre a proteção contra desafio com Salmonella Typhimurium em camundongos.pdf: 950556 bytes, checksum: d9746b0e55dab14349d49ea0ff188774 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-20T23:36:52Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Efeito da associação entre os probióticos Saccharomyces boulardii e Bacilus cereus var. Toyoi sobre a proteção contra desafio com Salmonella Typhimurium em camundongos.pdf: 950556 bytes, checksum: d9746b0e55dab14349d49ea0ff188774 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2014-11-12 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Este trabalho teve por objetivo avaliar o efeito da associação entre os probióticos Saccharomyces boulardii e Bacillus cereus var. Toyoi sobre a proteção e a sobrevivência de camundongos contra a colonização intestinal, translocação e lesões intestinais após desafio com S. Typhimurium. Os animais foram alimentados 20 dias com rações contendo S. boulardii e B. Toyoi, administrados individualmente ou em associação, nas concentrações de 8 e 7 log UFC. g-1 de ração, respectivamente. Animais do grupo controle receberam ração comercial sem probióticos. No 10º dia após o início da administração dos probióticos, os animais foram desafiados por gavagem com 5,17 log UFC de S. Typhimurium (DL50). Proteção contra colonização de S. Typhimurium foi avaliada após eutanásia dos camundongos que sobreviverem após 10 dias, através de contagens de células viáveis do patógeno presentes nas fezes e intestino delgado. Para a avaliação da ocorrência de translocação, 2/3 dos órgãos (fígado e baço) foram macerados, ressuspensos em 1 mL de solução salina a 0,9% estéril e contagens de células viáveis do patógeno, em UFC.ml-1, foram realizadas em placas de XLD. Para a avaliação da ocorrência de lesão, 1/3 do intestino delgado foi avaliado através de histopatologia. O experimento foi repetido duas vezes. S. boulardii não protegeu os camundongos da morte induzida por S. Typhimurium e da ocorrência de lesões intestinais. Não houve sinergismo entre os dois micro-organismos avaliados. Entretanto, S. boulardii, assim como B. Toyoi reduziram a eliminação de S. Typhimurium pelas fezes e preveniram a translocação do patógeno para o fígado dos camundongos que sobreviveram ao desafio. B. Toyoi protegeu os animais da morte induzida pela infecção com S. Typhimurium e da ocorrência de lesões e o efeito obtido pela associação, ocorreu, provavelmente, devido somente ao efeito de B. Toyoi. Assim, novos estudos serão realizados para avaliar os efeitos da associação destes probióticos frente ao desafio com S. Typhimurium e para avaliar as causas do efeito antagônico apresentado entre eles sobre a persistência deste patógeno nas fezes dos animais e sobre a translocação para o fígado. / This study aimed to evaluate the effect of the association between the Saccharomyces boulardii and Bacillus cereus var. Toyoi probiotics on the survival and protection of mice against the occurrence of intestinal colonization, translocation and intestinal lesions after the challenge with S. Typhimurium. The animals were fed for 20 days with diet containing S. boulardii and B. Toyoi, administered individually or in association, in the food concentrations of 8 and7 log CFU. g-1, respectively. The control group animals were fed with commercial food without probiotics. On the 10th day after the start of administration of probiotics, the animals were challenged by the gavages with 5.17 log CFU of S. Typhimurium (LD50). Protection against colonization of S. Typhimurium was evaluated after euthanasia of the mice, which survived after 10 days, through the viable cell counts of the pathogen presented in the small intestine and stool. To evaluate the incidence of translocation, 2/3 of the organs (liver and spleen) were macerated, and resuspended in 1 ml of saline solution in 0.9% sterile, and viable cell counts of the pathogen were performed. To evaluate the occurrence of injury, 1/3 of the small intestine was evaluated through histopathology. The experiment was repeated twice. S. boulardii did not protect the mice from induced death by S. Typhimurium and the occurrence of intestinal lesions. For this reason, it was not possible to assess the occurrence of synergism between the two micro-organisms evaluated. However, S. boulardii as well as B. Toyoi reduced the elimination of S. Typhimurium through the stool and prevented the translocation of the pathogen to the liver of mice that survived the challenge. B. Toyoi protected animals from induced death through the infection with S. Typhimurium and through the occurrence of injuries, and the effect obtained by the association was, probably, due only by the effect of B. Toyoi. Thus, further studies will be conducted to evaluate the effects of the combination of these probiotics facing the challenge with S. Typhimurium and to assess the causes of the antagonistic effect presented among them on the persistence of this pathogen in the stool of animals and on the translocation to the liver.