Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2011-2012 / L'arthrite rhumatoïde (AR) est une maladie incurable affectant 1% de la population mondiale et ayant comme origine une auto-immunité systémique. Les mécanismes moléculaires derrière la pathogenèse de l'AR sont mal définis, mais il s'avère que plusieurs facteurs environnementaux et génétiques sont impliqués. Basé sur des évidences récentes que la lectine myéloïde inhibitrice MICL puisse être impliqué dans la pathogenèse de l'AR, nous avons réalisé une étude génétique suggérant que le gène codant pour MICL pourrait être associé avec l'AR. De plus, des analyses d'expression au niveau protéique de MICL ont permis d'observer son expression dans le synovium et dans le liquide synovial d'articulations atteintes d'AR. Finalement, nos résultats suggèrent que MICL se situe dans le même complexe protéique que la vimentine. Cette étude a le potentiel de mener à une meilleure compréhension de la pathogenèse de l'AR et au développement d'un nouveau biomarqueur pronostique ou thérapeutique pour la maladie.

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 provoque une infection définitive de l’organisme. Il entraine une déroute du système immunitaire depuis la primo-infection occasionnant ainsi, une déplétion massive des lymphocytes T CD4 (LTCD4). Le DCIR (Dendritic Cell Immuno Receptor) qui constitue le socle de notre travail, est une lectine de type C. Il est exprimé sur les cellules myéloïdes comme les cellules dendritiques mais aussi sur les cellules B, les LTCD4 infectés par le VIH-1 et apoptotiques ainsi que sur les LTCD4 polarisés en Th17. Il constitue un facteur d’attachement et d’internalisation du virus dans la cellule dendritique. Il permet son transfert aux LTCD4 dans les organes lymphoïdes secondaires, jouant ainsi un rôle dans la pathogenèse associée au VIH-1. En plus, le DCIR assure la régulation négative de la réponse cellulaire, favorisant ainsi la propagation et la réplication du virus au détriment de la réponse immunitaire contre le VIH-1. Le rôle que joue le DCIR est dépendant du sentier de signalisation induit à la suite de la phosphorylation des résidus tyrosine de son motif ITIM. Le blocage de DCIR par des inhibiteurs spécifiques pourrait empêcher cette phosphorylation et réduire l’attachement, l’internalisation et le transfert du virus. Nous avons montré que la stimulation des cellules dendritiques et des LTCD4 polarisés en Th17 avec un anticorps anti-DCIR générait un patron de phosphorylation des résidus tyrosine des protéines. De plus, les inhibiteurs de la portion extracellulaire du DCIR inhibent cette activation. Afin de développer une mesure plus directe de l’interaction de DCIR avec ces inhibiteurs, nous avons purifié le DCIR à partir des cellules Raji-CD4-DCIR. En conclusion, ce projet de maitrise montre que l’activation directe de DCIR peut être renversée par des inhibiteurs montrant ainsi leurs spécificités. De plus, le profil d’activation de DCIR est spécifique pour chaque type cellulaire. A long terme, l’inactivation de DCIR par des inhibiteurs efficaces pourrait être une stratégie thérapeutique capable d’inhiber l’infection et de préserver une réponse immunitaire efficace.

Les lectines de type-C (CLR) sont des protéines de liaison au glycane qui reconnaissent les sucres de manière dépendante du Ca2+. Ils ont des rôles divers dans l'organisme humain. Ils sont responsables des interactions et de l'internalisation d'agents pathogènes tels que Candida albicans, Mycobacterium tuberculosis, le VIH ou le virus Ebola. Ils sont également impliqués dans le développement ou la prévention du cancer par la reconnaissance de glycanes spécifiques exprimés à la surface des cellules tumorales.L'importance cruciale est de trouver des ligands pour les CLR qui induiront une réponse immunitaire ou des inhibiteurs pour les lectines impliquées dans la promotion des infections dans l'organisme. L'objectif du réseau IMMUNOSHAPE était d'examiner de près les rôles, les spécificités et les différences entre les CLR et d'essayer de trouver des molécules appropriées pour stimuler la réponse immunitaire. Au cours de cette thèse, les néoglycoprotéines (NGP) contenant des glycodendrons de différentes valences ont été synthétisées. Pour la synthèse ont été utilisés BSA et OVA comme porteurs de protéines sur lesquels sont couplés des composés monovalents et des dendrons avec αMan et Manα1-2Man de trois et neuf valences. Tous les NGP ont été synthétisés par la chimie click avec deux équivalents de glycodendron / BSA. De plus, des NGP avec des glycomimétiques sur la base de fucose et de Manα1-2Man ont été préparés.L'affinité des molécules synthétisées a été analysée avec GLYcoPROFILE, la plateforme technologique développée par GLYcoDiag dans le but de mieux étudier les interactions glycobiologiques. Il a été évalué que tous les composés testés présentaient un effet multivalent fort sur quatre lectines spécifiques du mannose, y compris deux CLR : DC-SIGN et Langerin. La néoglycoprotéine avec 11 dendrons Manaαl-2 Man nonavalés a obtenu la meilleure avidité pour toutes les lectines testées. Les IC50 obtenues pour la Langerine et le DC-SIGN sont respectivement de l’ordre du nanomolaire et picomolaire, c’est une des valeurs les plus faibles obtenues pour ces deux lectines.L'étude des interactions glycobiologiques a été élargie par l'analyse des différences entre les glycanes avec les liaisons O, C et S et leurs interactions avec les lectines. Il a été observé que les C-glycanes n'ont pas le même mode de liaison que les O-glycanes et, par la suite, ne présentent pas le même effet multivalent attendu, que les O-glycanes. Dans le contexte des glycosides, nous montrons que l’O-glucoside présente de meilleures interactions avec les lectines purifiées que le S-glucoside, tandis que le S-galactoside offre une inhibition significativement meilleure entre les kératinocytes humains normaux et les néoglycoprotéines correspondantes. En outre, une étude intéressante a porté sur les interactions entre les thio-sialosides et la sialidase NanA. Cette analyse a montré que la multivalence a un effet important non seulement sur la lectine, mais également sur la liaison de l’enzyme. Les NGP synthétiques thio-sialylés ont mis en évidence un inhibiteur multivalent efficace de l'enzyme NanA.Au final, cette thèse présente des résultats intéressants sur l'influence significative des composés multivalents sur les interactions glycobiologiques entre les glycanes et les lectines ainsi que sur les enzymes. Cette connaissance pourrait être utilisée dans la conception future des vaccins et de leurs adjuvants pour le traitement des infections,du cancer et, en général, pour la formation de la réponse immunitaire. / C-type lectins (CLRs) are glycan binding proteins which recognize sugars in Ca2+ dependent manner. They have diverse roles in human organism. They are responsible for interactions and internalization of pathogens like Candida albicans, Mycobacterium tuberculosis, HIV or Ebola virus. They are also involved in development or prevention of cancer through recognition of specific glycans expressed on surface of tumor cells.The crucial importance is to find ligands for CLRs which will induce immune response or inhibitors for lectins which are involved in promotion of infections in organism. The goal of IMMUNOSHAPE network was to closely examine roles, specificities and differences between CLRs and try to find appropriate molecules for driving immune response. During this thesis, neoglycoproteins (NGPs) containing glycodendrons with different valences were synthetized. For synthesis were used BSA and OVA as protein carriers on which are coupled monovalent compounds and dendrons with αMan and Manα1-2Man in three and nine valences. All NGPs were synthetized with click chemistry with two ratios of glycodendron/BSA. Additionally, NGPs with glycomimetics on the basis of fucose and Manα1-2Man were prepared.The affinity of synthetized molecules was analyzed with GLYcoPROFILE, technology platform developed in GLYcoDiag with the aim of better and more precise investigation of glycobiological interactions. It was evaluated that all tested compounds showed strong multivalent effect on four mannose specific lectins, including two CLRs: DC-SIGN and Langerin. Neoglycoprotein with 11 nonavalent Manα1-2Man dendrons achieved the best avidity for all tested lectins. Obtained IC50 for Langerin and DC-SIGN are of nanomolar and picomolar range respectively, which are one of the lowest values obtained for these two lectins.Studying glycobiological interactions was expanded by analysis of differences between glycans with O-, C- and S-linkage and their interactions with lectins. It was observed that C-glycans does not have the same mode of binding like O-glycans and subsequently, do not show the same expected multivalent effect such as O-glycans. In the context of glycosides, we show that even O-glucoside achieved slithly better interactions with purified lectins in comparison with S-glucoside, S-galactoside provide significantly better inhibition between normal human keratinocytes and corresponding neoglycoproteins in comparison with O-galactoside. Furthermore, interesting study was investigation of interactions between thio-sialosides and sialidase NanA. This analysis showed that multivalency has a strong effect not only on lectin, but also on enzyme binding. Synthetized thio-sialylated NGPs showed as efficient, multivalent inhibitor of NanA enzyme.Altogether, this thesis presents interesting results of significant influence of multivalent compounds on glycobiological interactions between glycans and lectins as well as enzymes. This knowledge could be used in future design of vaccines and their adjuvants for infection and cancer treatment and in general, for shaping immune response.

Les lectines de type C (CLRs) sont des récepteurs impliqués dans la reconnaissance d’oligosaccharides et principalement exprimés à la surface des cellules présentatrices d’antigène (APCs) et notamment des cellules dendritiques (DCs), véritable sentinelle de notre système immunitaire. Elles sont impliquées dans la reconnaissance de motifs spécifiques exprimés à la surface d’agents pathogènes et sont capables de stimuler le système immunitaire afin de déclencher une réponse adaptée. Ce rôle crucial joué par les CLRs dans l’équilibre de la réponse immunitaire confère aux interactions CLR/glycane des perspectives d’applications pharmaceutiques. L’objectif à long-terme du projet de recherche dans lequel cette thèse s’intègre consiste à utiliser ces CLRs pour modeler les réponses du système immunitaire. A cette fin, des néoglycoconjugués spécifiques de chaque CLR doivent être développés. Au cours de cette thèse, 9 CLRs ont été produits BDCA2, DC-SIGN, DC-SIGNR, dectin-1, dectin-2, langerin, LSECtin, MCL and Mincle. Différentes stratégies de production ont été testées en parallèle, incluant des techniques d’adressage au périplasme en vue d’obtenir des protéines solubles et fonctionnelles et de l’expression cytoplasmique, sous forme de corps d’inclusion suivie d’étapes de renaturation qui s’est révélé la plus efficace au final. Une stratégie permettant de construire des tétramères artificiels de CLRs, appelés TETRALEC, a été mise au point. Cet outil permettant le criblage et la caractérisation des lectines a été obtenu avec DC-SIGNR par un marquage spécifique de la lectine. Le complexe TETRALEC a été caractérisé au niveau structural et des tests fonctionnels ont été menés sur des puces à glycanes et des cellules pathogènes. La série de CLRs que nous avons produites a été utilisée pour cribler des puces à glycanes et à glycomimétiques. Ces études nous ont permis de mettre en évidence des interactions dépendantes de l’environnement du glycane et d’identifier de nouveaux glycanes ou glycomimétiques spécifiques de certains CLRs. En effet, de manière étonnante, plusieurs des CLRs testés sont capables, pour un glycane donné, de discriminer des isomères de position ouvrant ainsi de nouveaux questionnements sur la signification biologique de cette sélectivité. De plus des glycomimétiques reconnaissant préférentiellement dectin-2 par rapport à DC-SIGN, DCSIGNR et langerin ont été identifiés. Le choix des glycomimétiques et l’évaluation des étapes de leur optimisation ont été permis par diverses études biophysiques qui ont quantifié la force et la spécificité des interactions. Ceci a permis le développement d’un ligand optimisé sélectif de DC-SIGN. La co-cristallisation de la protéine avec ce ligand a révélé un intéressant mode de liaison qui amène également de nouvelles questions. Simultanément à l’optimisation de ligands monovalents, un premier pas a été réalisé vers la conception d’une molécule pour permettre une vaccination contre le cancer médiée par les CLRs. Les résultats de SPR ont identifié des candidats potentiellement intéressants et des tests biologiques préliminaires ont été réalisés. / C-type Lectin Receptors (CLRs) are carbohydrate-binding proteins mainly expressed on Antigen Presenting Cells (APCs), including dendritic Cells (DCs), the sentinel of the innate immune system. They recognize pathogens or damaged cells by interacting with glycan features and the encounter between the CLR and its ligand constitutes a necessary step for the activation of the adaptive immune system. This crucial role played by CLRs in the balance of immune responses offers to CLR-glycan interactions pharmaceutical applications. The long-term objective of the research project in which this PhD is included is to use these CLRs as modulators in order to tailor the immune system responses. To do so, neoglyco-conjugates selective to each individual CLR have to be developed.Nine different CLRs were produced in this work: BDCA2, DC-SIGN, DC-SIGNR, dectin-1, dectin-2, langerin, LSECtin, MCL and Mincle.Several approaches have been explored in parallel for CLR production, ranking from bacterial periplasmic targeting, aiming to express soluble and functional protein, to inclusion bodies production into the bacterial cytoplasm, with subsequent protein refolding. Our collection of CLRs were used to screen glycan and glycomimetic arrays, highlighting context-dependent binding and identifying natural ligands or glycomimetics selective to each CLRs. Thus, several CLRs were surprisingly able to differentiate between positional isomers of a given N-Glycan, which opens new questions regarding the biological significance. Moreover, glycomimetics with a selectivity towards dectin-2 over DC-SIGN, DC-SIGNR and langerin CLRs have been identified.To guide the choice of the glycomimetics and estimate their optimisation, diverse biophysical studies were performed to evaluate the strength and specificity of the interaction. This enabled the development of an ultimate ligand selective towards DC-SIGN. A co-crystallised structure of the protein with this ligand revealed an interesting binding mode that also opens new questions.Simultaneously to monovalent ligand optimization, a first step towards the design of a highly defined molecule for cancer vaccination by CLR targeting was made. SPR results revealed potential candidates to exploit and preliminary biological assays were performed. Finally, a strategy for tetrameric lectin engineering as been explored, termed TETRALEC. This tool for screening and lectin characterization, has been obtained with one the lectin of the study, DC-SIGNR, by a site-specific labelling of the lectin. The TETRALEC complex was structurally characterised and functional assays were performed on glycan array and pathogen cells.

Malgré 40 ans de recherche, il n'existe toujours pas de traitement pour éradiquer le virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1). Des traitements antirétroviraux (TAR) permettent de contrôler la charge virale des personnes vivants avec le VIH-1 (PVVIH). Ces traitements améliorent la longévité et la qualité de vie des PVVIH. Cependant, l'activation immunitaire et l'inflammation chronique persistent malgré les TAR. C'est pourquoi la recherche de nouvelle cible thérapeutique ayant une action immunomodulatrice pour compléter le traitement des PVVIH est toujours d'actualité. La cellule dendritique participe aux premières étapes de l'infection et à l'orchestration de la réponse immunitaire contre le VIH-1. La cellule dendritique peut lier le VIH-1 par des récepteurs de lectines de type C dont le *dendritic cell immunoreceptor* (DCIR). La présence du DCIR permet d'augmenter l'entrée, la réplication virale ainsi que la transmission du virus sur des cellules dendritiques dérivées de monocytes et sur des lymphocytes T CD4. On sait que la liaison du VIH-1 au DCIR cause la libération de vésicules extracellulaires (VE) enrichies en protéines apoptotiques qui favorise l'apoptose des lymphocytes T CD4. Les VE sont des nanoparticules qui participent à la communication entre les cellules dans des conditions physiologiques et pathologiques. Les trois types de VE principalement étudiés sont les vésicules apoptotiques, les microvésicules et les exosomes, qui ont tous des caractéristiques différentes. Ces observations ont mené à l'hypothèse suivante : L'interaction entre le VIH-1 et le DCIR modifie la composition des VE afin de favoriser la réplication du virus et d'inhiber la réponse immunitaire. Ce projet a permis de mettre en place les modèles d'études afin de répondre à cette hypothèse, notamment l'amélioration des conditions d'infection des cellules *in vitro*, la séparation et la caractérisation des VE ainsi que l'utilisation d'inhibiteurs pharmacologiques du DCIR et de lignées cellulaires portant un DCIR muté. / Despite 40 years of research, there is still no treatment able to eradicate the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). Antiretroviral treatments (ART) make it possible to control the viral load of people living with HIV-1 (PLWH). These treatments improve longevity as well as the quality of life of PLWH. However, immune activation and chronic inflammation persist despite ART. This is why the research of new therapeutic target having an immunomodulatory action to complete the treatment of PLWH is still relevant. The dendritic cell participates in the early stages of infection and in orchestrating the immune response against HIV-1. The dendritic cell can bind HIV-1 through C-type lectin receptors like dendritic cell immunoreceptor (DCIR). The presence of DCIR increase virus entry, viral replication and viral transmission on dendritic cells derived from monocytes and on CD4 T lymphocytes. It is known that binding of HIV-1 to the receptor causes the release of extracellular vesicles (EV) enriched in apoptotic proteins that promotes apoptosis of CD4 T lymphocytes. EVs are nanoparticles that participate in communication between cells in physiological and pathological conditions. The three types of EV mainly studied are the apoptotic vesicles, the microvesicles and the exosomes which all have different characteristics. These observations led to the following hypothesis: the interaction between HIV-1 and DCIR modifies the composition of EVs to promote virus replication and inhibit the immune response. This project made it possible to set up study models in order to respond to this hypothesis, in particular the improvement of the conditions of infection of cells *in vitro*, the separation and characterization of EVs as well as the use of pharmacological inhibitors of DCIR and cell lines carrying a mutated DCIR.

Très tôt après l'entrée initiale du VIH-1 dans l'organisme, le système immunitaire est déjoué, permettant ainsi au virus de se répliquer activement. Cette replication engendre une depletion massive des lymphocytes T CD4⁺ ainsi qu'un dysfonctionnement des lymphocytes B. Nous savons que les premières cellules liant le VIH-1 sont les cellules dendritiques. De plus, ces cellules ont la capacité de migrer avec le virus jusqu'aux organes lymphoïdes secondaires où elles peuvent alors transmettre efficacement le VIH-1 aux lymphocytes T CD4⁺. Afin d'approfondir nos connaissances sur la pathogenèse associée au VIH-1, il est essentiel d'étudier intensivement les intervenants et plus particulièrement les cellules dendritiques et les récepteurs retrouvés à leur surface susceptibles de lier le VIH-1 lors de la primo-infection. La gpl20 du VTH-1 peut se lier au récepteur CD4 et corécepteurs afin de mener à une infection productive des cellules dendritiques. Toutefois, d'autres récepteurs, comme les récepteurs lectines de type C tels que le DC-SIGN sont connus pour leurs rôles dans l'infection en trans et donc le transfert efficace du vims des cellules dendritiques vers les lymphocytes T CD4⁺. Les cellules dendritiques myéloïdes, résidentes des muqueuses, expriment plusieurs lectines de type C dont le DCIR (dendritic cell ùnmunorecptor) qui a fait l'objet de mes études doctorales. Au cours de ces études, nous avons montré que le DCIR favorisait l'infection en trans et en cis des cellules dendritiques et que le domaine neck et le motif ITTM du DCIR étaient responsables de ces effets. De plus, nous avons mis en évidence pour la première fois que le DCIR était exprimé sur les lymphocytes T CD4⁺ en apoptose à la suite de l'infection par le VIH-1. L'expression du DCIR sur les cellules apoptotiques pourrait favoriser la dissémination et le transfert du VIH-1. Nous avons aussi montré l'importance de la signalisation engendrée par le domaine ITIM du DCIR dans l'infection par le VIH-1. L'ensemble de ces études ont permis de caractériser le rôle du DCIR dans la pathogénèse associé à l'infection par le VIH-1, en plus d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques très pertinentes pour contrer cette épidémie. Enfin, ces études montrent aussi l'importance d'étudier les autres récepteurs lectines de type C afin de bien comprendre le rôle de chacune dans l'infection par le VIH-1.

Le DCIR, une lectine de type C, a été identifié comme un facteur facilitant le transfert des virus des cellules dendritiques vers les lymphocytes TCD4 lors de l’infection au VIH-1. Cinq isoformes différentes du DCIR existent. L’expression de certaines isoformes peut être modulée de façon indépendante dans certaines pathologies. L’hypothèse qui a été posée est que les isoformes du DCIR sont modulées au cours de l’infection au VIH-1 et qu’il est possible de générer des cellules déficientes en DCIR par la technique de CRISPR/Cas9. Les objectifs étaient de développer une PCR quantitative spécifique pour chaque isoforme du DCIR, de quantifier l’expression des isoformes du DCIR dans des cellules immunitaires de patients infectés par le VIH-1, de déterminer s’il existe des corrélations entre le patron d’expression de chaque isoforme et les données cliniques des patients VIH-1 et, finalement, de développer un outil CRISPR/Cas9 permettant le knock-out du gène du DCIR dans des cellules souches hématopoïétiques. Les résultats montrent que l’expression des isoformes 1 à 4 n’est pas modulée par l’infection au VIH-1. Cependant, une corrélation existe entre le ratio CD4/CD8 des patients traités et l’expression de l’isoforme 1 du DCIR dans les cellules polynucléées. De plus, dans les cellules mononucléées sanguines périphériques, les isoformes 1 et 3 du DCIR sont les plus exprimées et, dans les cellules sanguines polynucléées, l’isoforme 1 du DCIR est la plus exprimée. Finalement, un outil CRISPR/Cas9, permettant d’inactiver le gène du DCIR dans des cellules souches hématopoïétiques par infection lentivirale, a été développé. Ces données permettront de mieux caractériser les rôles des isoformes du DCIR, contribuant ainsi au développement de stratégies thérapeutiques ciblant cette lectine. / The C type lectin DCIR was identified as viral transfer factor from dendritic cells to CD4 T cells during HIV-1 infection. There are five known isoforms of the DCIR protein. The expression of some of these isoforms can be modulated independently in some pathologies. The hypothesis of this project is that DCIR isoforms can be modulated during HIV-1 infection and that it is possible to generate DCIR deficient cells with CRISPR/Cas9 technology. Our objectives were: to develop a specific quantitative PCR for each isoforms of DCIR; to quantify the expression of DCIR isoforms in immune cells of HIV-1 infected patients; to determine if there are correlations between the expression pattern of each isoform and the patients’ clinical data and; to develop a CRISPR/Cas9 tool allowing the knock out of the DCIR gene in hematopoietic stem cells. The results show that the expression of DCIR isoforms 1 to 4 is not modulated by HIV-1 infection. However, a positive correlation exists between the CD4/CD8 T cell ratio of treated HIV-1 patients and the expression of DCIR isoform 1 in polymorphonuclear cells. Furthermore, the DCIR isoforms 1 and 3 are the most expressed isoforms in the patients’ peripheral blood mononuclear cells, while the DCIR isoform 1 is the most expressed isoform in the patients’ polymorphonuclear cells. Finally, our CRISPR/Cas9 tool, allowing the inactivation of the DCIR gene in hematopoietic stem cells by lentiviral infection, has been developed. These results will allow us to better characterize the roles of DCIR isoforms, contributing so to the development of therapeutic strategies targeting this lectin.

Les composantes innée et acquise de l'immunité travaillent ensemble pour assurer une protection efficace de l'organisme. Les cellules dendritiques, cellules sentinelles de l’immunité capturent via des récepteurs de surface les agents pathogènes et les présentent aux lymphocytes T pour stimuler les réponses immunitaires adaptatives spécifiques. Une famille de ces récepteurs, nommée Récepteurs Lectines de type C (CLRs) ont un rôle important dans la reconnaissance de motifs oligosaccharides des pathogènes. Leurs fonctions sont parfois détournées par certains pathogènes à leur avantage et notamment le VIH. La reconnaissance du virus par DC-SIGN, une des CLRs, favorise la dissémination du virus. A l’inverse, la langerine, autre CLR, est considérée comme une barrière naturelle au VIH. Ainsi, DC-SIGN est devenue une cible thérapeutique prometteuse mais sa reconnaissance des ligands osidiques est largement partagée par la langerine.Ce travail vise à développer des antagonistes de DC-SIGN spécifiques et de hautes affinités permettant de rivaliser avec la présentation multivalente des glycosylations de gp120 du VIH avec DC-SIGN. Une approche rationnelle a été employée dans le développement de ligands glycomimétiques hautement sélectifs pour DC-SIGN à partir de l’étude du site de liaison des deux CLRs. Puis, des plates-formes de présentations de ces glycomimétiques, de valences et de géométries différentes, sont comparées par SPR. Les améliorations spectaculaires d'affinités parfois observées sont liées à différents mécanismes d’interactions multivalentes responsables d’un phénomène d’avidité.Sur une des architecture de présentation sélectionnée (RODs), un travail de caractérisation fine des mécanismes responsables de ce gain d’affinité et/ou d’avidité a été conduit par la combinaison de plusieurs techniques biophysiques (SPR, ITC, polarisation de fluorescence et AUC). L’influence de la topologie de cette structure sur les mécanismes d’interactions est ainsi mise en évidence. Par les travaux menés, plusieurs ligands multivalents ont montré des affinités sans précédent pour DC SIGN atteignant des affinités du nanomolaire et représentant les meilleurs inhibiteurs connus à ce jour.Associé au développement d’antagonistes multivalents, une CLR (DCIR) a été identifiée récemment comme impliquée dans la dissémination du VIH, comme DC¬SIGN. Dans une perspective future de développement de glycomimétique, des travaux ont été menés sur la caractérisation structurale et fonctionnelle de ce nouvel acteur dans la problématique VIH. / The innate and acquired immunity components work together to provide efficient protection of organisms. Dendritic cells, sentinel cells of the immunity, are able to capture pathogens through their receptors on the surface and they can present the antigens to lymphocytes T in order to stimulate specific adaptive immune responses. Among these receptors, there is a family named C-type lectin receptors (CLRs), which has an important role in the recognition of pathogenic oligosaccharide motifs. CLRs can be hijacked by many pathogens including HIV. DC-SIGN, one of the CLRs, interacts with the virus and promotes its dissemination. Unlike DC-SIGN, langerin, another CLR, has a protective role against the HIV infection. In this context, DC-SIGN became a promising therapeutic target but it shares ligand specificities with langerin.This work aims to develop highly specific antagonists against DC-SIGN in order to compete with the multivalent glycosylated gp120 protein of HIV. Using the study of the two lectins binding sites as starting point, a rational approach has been exploited to develop highly selective glycomimetics against DC SIGN. The SPR technique was used to investigate multivalent platforms with different valencies as well as ligand presentation in space. The amazing improvement of the affinity observed in some cases can be linked to different mechanisms of multivalent interactions, leading to an avidity phenomenon. On a selected scaffold (RODs), we characterized the different mechanisms responsible for the affinity and/or avidity gains, using a combination of different biophysical techniques (SPR, ITC, fluorescence polarization, AUC). In this work, we highlighted that the topology of this structure can influence the mechanisms of interactions. Overall, different multivalent ligands showed unique affinities for DC-SIGN, reaching the nanomolar affinity range, and they represent the best inhibitors to date.Finally, another CLR has been recently identified as one of the protein involved in the HIV infection as well as DC-SIGN. In a future perspective of glycomimetic development, structural and functional characterization has been done on this new actor involved in the HIV issue.

Les lymphocytes T CD8+ jouent un rôle prépondérant dans le contrôle de l’infection par le VIH suggérant ainsi qu’un vaccin efficace doit induire une réponse cellulaire T CD8+ robuste et durable.En fournissant une source antigénique importante qui fait défaut chez les patients répondeurs aux poly-chimiothérapies antirétrovirales, la vaccination thérapeutique pourrait favoriser ce type de réponse cellulaire, non restaurée par les seuls traitements antirétroviraux. Les cellules dendritiques (DC) autologues, qu’elles soient chargées en virus inactivé, en peptides viraux ou en ARN messagers (ARNm) sont capables d’induire des réponses robustes des cellules T CD8+ contre les antigènes du VIH, faisant de bons candidats vaccins thérapeutiques.Dans ce projet, nous avons étudié l’efficacité d’une vaccination thérapeutique basée sur l’injection de DC autologues transfectées ex vivo avec des ARNm codant les protéines du VIH (projet initié en collaboration avec Guido Vanham, Institute of Tropical Medicine, Anvers). La composante antigénique du vaccin est fournie par les séquences virales endogènes du patient; ainsi nous espérons adapter la spécificité de la réponse immunitaire aux virus autologues. Nous travaillons avec le Macaque cynomolgus comme modèle animal d’infection par les virus d’immunodéficience (SIV), modèle pertinent dans l’approfondissement des connaissances en pathogénèse et en développement vaccinal, notamment pour tester l’innocuité et l’efficacité des vaccins basés sur l’utilisation des DC. La mise au point un système de culture de DC basé sur la prolifération puis la différenciation des progéniteurs hématopoïétiques CD34+, qui nous a permis de générer in vitro des DC matures en nombre suffisant pour la vaccination (au moins 10.106).Nous avons caractérisé ces DC phénotypiquement, avec une attention particulière vis-à-vis de l’expression de lectines de type C et d’autres récepteurs DC-spécifiques. Nous avons mis en évidence que l’état d’activation des DC définit le niveau d’expression de ces molécules. Ces récepteurs membranaires sont impliqués dans la capture et la présentation des antigènes aux effecteurs, ainsi que dans l’orientation de la réponse immune. Le phénotype des DC générées in vitro a été comparé au phénotype de plusieurs population de cellules présentatrices d’antigène présentes in vivo chez le macaque.La transfection avec des ARNm par électroporation est un moyen sûr et efficace de charger les DC en antigènes. Nous avons étudié dans un premier temps l’immunogénicité du vaccin chez des macaques sains. Les résultats montrent qu’une réponse cellulaire de type Th1 (IFN-gamma et interleukine-2) spécifique à Gag est induite dès la première injection et peut être renforcée après les injections suivantes. Nous avons également mis en évidence l’induction de lymphocytes T CD8+ capables de sécréter en réponse à Gag plusieurs de ces cytokines, IFNg, IL2, TNFa, la chimiokine MIP1b, ou encore le marqueur de dégranulation cytotoxique CD107a. En revanche, aucune sécrétion de cytokine de type 2 ni de réponse anticorps spécifique de Gag n'a pu être mise en évidence.La seconde partie de notre projet a consisté en l’étude d’une stratégie de vaccination par ciblage des DC in vivo avec des protéines de fusion DC-spécifiques associées à des antigènes. Ce travail a été mené en collaboration avec le Baylor Insitute for Immunology Research (BIIR) à Dallas. Nous avons tout d’abord sélectionné les meilleurs clones d’Ac spécifiques de molécules humaines pour leur réactivité croisée avec les molécules du macaque cynomolgus. L’immunogénicité de protéines de fusion (dirigées contre LOX-1 et DC-ASGPR couplées à Gag du VIH ou HA1 de Influenza), a ensuite été évaluée in vivo chez le macaque. Ces travaux ont confirmé in vivo que l’induction de différents profils de réponses immunitaires Ag-spécifiques (Th1 et IL10) est possible par ciblage in vivo des DC avec des protéines de fusion dirigées contre différentes molécules (LOX-1 et DC-ASGPR). / Current treatments against HIV infection would benefit from the development of complementary immunotherapeutic strategies. Dendritic cells (DC) play a major role in the induction of immune responses. In this thesis, we examine the use of the DC in therapeutic vaccination. Ex vivo loading of DC with messenger RNA encoding viral proteins and in vivo loading of DC by targeting antigen to DC-specific endocytic receptors are two strategies evaluated in healthy macaque.