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A search for members of the genus Leucospor idium (Ustilaginaceae) in and near southern British Columbia has yielded 147 isolates of L. scottii, and a single isolate of an undescribed species with apparent affinities in the genus. L. scottii was primarily found on decaying marine vegetation and driftwood, but isolates were also obtained from stream foam, snow, a decaying turnip root, bark mulch, and rain-derived stem flow over the trunk of a living tree. The species predominated in laboratory incubations of marine algal materials collected in the winter, spring, and late autumn. The majority of isolates obtained directly from natural substrates were also found during periods of cold seasonal conditions. It is suggested that low temperature is characteristic of L. scottii habitats. Locally-obtained L. scottii strains are all heterothallic, and are completely interfertile with mating test strains originating from the southern hemisphere. Morphological and known physiological and biochemical characters of the local strains are similar to those previously described for the species. However, mating studies of local isolates have revealed that the tetrapolar incompatibility system of L. scottii is distinguished by the possession of multiple alleles at the A locus. Similar modifications of the tetrapolar system are known in Tremella and other heterobasidiomycete genera, but have not previously been reported in species of the Leucosporidium-Rhodosporidium group. The strain thought to belong to an undescribed species of Leucosporidium was obtained from a sample of filamentous green algae growing in a vernal pond near a peat bog. The fungus is homothallic, and is morphologically and physiologically distinct from other Leucosporidium and Rhodosporidium species. Of the six known species of Leucosporidium, five (L. antarcticum, L. friqidum, L. gelidum, L. nivalis, and L. stokesii) were not found during the course of the present study. All five species are obligately psychrophilic and may not be able to remain established within the study area. However, a survey of local L. scottii isolates showed that 5 out of 147 isolates (3.4%) were obligately psychrophilic. / Science, Faculty of / Botany, Department of / Graduate

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The L-asparaginase (ASNase) obtained from yeasts species has been poorly studied and a new yeast ASNase could be an alternative to minimize the side effect in the treatment of lymphoblastic leukemia. The Antarctic ecosystems have a great potential to obtain novel enzymes produced from psychrophilic and psychrotolerant microorganisms. Yeasts isolated from samples collected in the Antarctic Peninsula by the PROANTAR expedition team were tested for the production of ASNase and L-glutaminase (GLNase). From this screening, the strain Leucosporidium scottii L115 presented the highest ASNase activity (6.24 U g-1 of dried cell weight (dcw)) with a combination of low GLNase activity (0.41 U g-1 dcw). The ASNase belonging to L. scottii L115 (LsASNase) was purified 227 fold with a specific activity of 137.01 U mg-1 at 37 ºC, and with 0.93 U mg-1 for GLNase. Moreover, the maximum activity was observed at pH 7.5 at 55 ºC. The enzyme is a multimer presenting a single band of 54.5 kDa of molecular weight in reduced conditions and 462 kDa by size exclusion chromatography. The LsASNase is a glycosylated enzyme that presented a band lower at 25 kDa when was treated with PGNase F. The enzymatic kinetic reveals an allosteric regulation of the enzyme and the kinetic parameters were determined at 37º C, pH 7.0 as K0.5 = 233 µM, kcat = 54.7 s-1 and nH = 1.52 demonstrating a positive cooperativity by the enzyme and the substrate. The ASNase production by L. scottii L115 was improved by applying DoE for the culture medium development. The PB and CDD designs were used to optimize the ASNase production providing the nutrient values of 6.15 g L-1 of proline, 28.34 g L-1 sucrose, and 15.61 g L-1 of glycerol for a maximal production. The synthetic medium containing the optimized quantities was added with the salts: KCl, 0.52 g L-1; MgSO4.7H2O, 0.52 g L-1; CuNO3.3H2O, 0.001 g L-1; ZnSO4.7H2O, 0.001 g L-1; FeSO4.7H2O, 0.001 g L-1.The optimized medium produces a 23.75 ULh-1 of ASNase in shake flask culture. Furthermore, L. scottii is characterized as an oleaginous yeast that accumulates lipids with a suitable fatty acid profile. The production of ASNase and lipids were scaled up in the 1 L bioreactor to evaluate the initial cell concentration, carbon source, and oxygen transfer rate (kLa).The experiments were performed at 15ºC in the bioreactor BIOSTAT®Q plus (Sartorius Stedim, Germany) in batch mode, using 0.5 L of the optimized medium culture in phosphate buffer 50 mM pH 7.0. The initial cell concentration was evaluated at 1%, 3%, and 5% (v/v). Sucrose and glycerol were tested alone to examine if the combination of both is mandatory to produce ASNase. All these assays were carried in duplicate. The kLa was assessed through a CCD design in the range of 1.42 - 123.0 h-1. The performance in bioreactor showed the productivity of 36.95 ULh-1of ASNase under the optimized conditions (growth temperature 15º C, X0: 5 g L-1, pH 7.0, 48 h, kLa 89-92 h-1). The cultivation of L. scottii L115 at 15ºC in sucrose and glycerol as carbon sources generate an interesting lipid profile, where it presents monounsaturated and polyunsaturated lipids. / A L-asparaginase (ASNase) obtida a partir de espécies de leveduras tem sido pouco estudada e uma nova ASNase de levedura pode ser uma alternativa para minimizar os efeitos adversos no tratamento da leucemia linfoblástica. Os ecossistemas Antárticos têm um grande potencial para obter novas enzimas produzidas a partir de microorganismos psicrofílicos e psicotrolerantes. As leveduras isoladas de amostras coletadas na Península Antártica pela equipe de expedição do PROANTAR foram testadas para a produção de ASNase e L-glutaminase (GLNase). A partir desta triagem, a cepa Leucosporidium scottii L115 apresentou a maior atividade de ASNase (6,24 U g-1 dcw) com uma combinação de baixa atividade de GLNase (0,41 U g-1 dcw). A ASNase pertencente a L. scottii L115 (LsASNase) foi purificada 227 vezes com uma atividade específica de 137,01 U mg-1 a 37 ºC e com 0,93 U mg-1 de GLNase. A atividade máxima foi observada a pH 7,5 a 55 ºC. A enzima é um multímero que apresenta uma banda única de 54,5 kDa de peso molecular em condições redutoras e 462 kDa por cromatografia de exclusão molecular. A LsASNase é uma enzima glicosilada que apresentou uma banda menor a 25 kDa quando tratada com PGNase F. A cinética enzimática revela uma regulação alostérica da enzima e os parâmetros cinéticos foram determinados a 37º C, pH 7,0 como K0,5 = 233 µM, kcat = 54,7 s-1 e nH = 1,52 demonstrando uma cooperatividade positiva pela enzima e o substrato. A produção de ASNase por L. scottii L115 foi melhorada aplicando DoE para o desenvolvimento do meio de cultura. Os desenhos experimentais de PB e CDD forma usados para otimizar a produção de ASNase e forneceram os valores de nutrientes de 6,15 gL-1 de prolina, 28,34 gL-1 de sacarose e 15,61 gL-1 de glicerol para uma produção máxima. O meio sintético contendo as quantidades otimizadas foi adicionado com os sais: : KCl, 0.52 g L-1; MgSO4.7H2O, 0.52 g L-1; CuNO3.3H2O, 0.001 g L-1; ZnSO4.7H2O, 0.001 g L-1; FeSO4.7H2O, 0.001 g L-1.O meio otimizado produz 23.75 ULh-1 de ASNase em cultivo em frasco agitado. Além disso, L. scottii é caracterizada como uma levedura oleaginosa que acumula lipídios com um perfil adequado de ácidos graxos. A produção de ASNase e lipídios foi ampliada no biorreator de 1 L para avaliar a concentração celular inicial, fonte de carbono e taxa de transferência de oxigênio (kLa). Os experimentos foram realizados a 15ºC no biorreator BIOSTAT®Q plus (Sartorius Stedim) em modo batelada, utilizando 0,5 L da cultura de meio otimizado em tampão fosfato 50 mM pH 7,0. A concentração celular inicial foi avaliada em 1%, 3% e 5% (v / v). Sacarose e glicerol foram testados isoladamente para examinar se a combinação de ambos é obrigatória para produzir ASNase. Todos esses ensaios foram realizados em duplicado. O kLa foi avaliado através de um planejamento CCD na faixa de 1,42-123,0 h-1. O desempenho no biorreator mostrou a produtividade de 36,95 ULh-1 de ASNase sob condições otimizadas (temperatura de crescimento 15º C, X0: 5 g L-1, pH 7,0, 48 h, kLa 89-92 h-1). O cultivo de L. scottii L115 a 15ºC em sacarose e glicerol como fontes de carbono gera um perfil lipídico interessante, onde apresenta lipídios monoinsaturados e poliinsaturados.

The L-asparaginase (ASNase) obtained from yeasts species has been poorly studied and a new yeast ASNase could be an alternative to minimize the side effect in the treatment of lymphoblastic leukemia. The Antarctic ecosystems have a great potential to obtain novel enzymes produced from psychrophilic and psychrotolerant microorganisms. Yeasts isolated from samples collected in the Antarctic Peninsula by the PROANTAR expedition team were tested for the production of ASNase and L-glutaminase (GLNase). From this screening, the strain Leucosporidium scottii L115 presented the highest ASNase activity (6.24 U g-1 of dried cell weight (dcw)) with a combination of low GLNase activity (0.41 U g-1 dcw). The ASNase belonging to L. scottii L115 (LsASNase) was purified 227 fold with a specific activity of 137.01 U mg-1 at 37 ºC, and with 0.93 U mg-1 for GLNase. Moreover, the maximum activity was observed at pH 7.5 at 55 ºC. The enzyme is a multimer presenting a single band of 54.5 kDa of molecular weight in reduced conditions and 462 kDa by size exclusion chromatography. The LsASNase is a glycosylated enzyme that presented a band lower at 25 kDa when was treated with PGNase F. The enzymatic kinetic reveals an allosteric regulation of the enzyme and the kinetic parameters were determined at 37º C, pH 7.0 as K0.5 = 233 µM, kcat = 54.7 s-1 and nH = 1.52 demonstrating a positive cooperativity by the enzyme and the substrate. The ASNase production by L. scottii L115 was improved by applying DoE for the culture medium development. The PB and CDD designs were used to optimize the ASNase production providing the nutrient values of 6.15 g L-1 of proline, 28.34 g L-1 sucrose, and 15.61 g L-1 of glycerol for a maximal production. The synthetic medium containing the optimized quantities was added with the salts: KCl, 0.52 g L-1; MgSO4.7H2O, 0.52 g L-1; CuNO3.3H2O, 0.001 g L-1; ZnSO4.7H2O, 0.001 g L-1; FeSO4.7H2O, 0.001 g L-1.The optimized medium produces a 23.75 ULh-1 of ASNase in shake flask culture. Furthermore, L. scottii is characterized as an oleaginous yeast that accumulates lipids with a suitable fatty acid profile. The production of ASNase and lipids were scaled up in the 1 L bioreactor to evaluate the initial cell concentration, carbon source, and oxygen transfer rate (kLa).The experiments were performed at 15ºC in the bioreactor BIOSTAT®Q plus (Sartorius Stedim, Germany) in batch mode, using 0.5 L of the optimized medium culture in phosphate buffer 50 mM pH 7.0. The initial cell concentration was evaluated at 1%, 3%, and 5% (v/v). Sucrose and glycerol were tested alone to examine if the combination of both is mandatory to produce ASNase. All these assays were carried in duplicate. The kLa was assessed through a CCD design in the range of 1.42 - 123.0 h-1. The performance in bioreactor showed the productivity of 36.95 ULh-1of ASNase under the optimized conditions (growth temperature 15º C, X0: 5 g L-1, pH 7.0, 48 h, kLa 89-92 h-1). The cultivation of L. scottii L115 at 15ºC in sucrose and glycerol as carbon sources generate an interesting lipid profile, where it presents monounsaturated and polyunsaturated lipids. / A L-asparaginase (ASNase) obtida a partir de espécies de leveduras tem sido pouco estudada e uma nova ASNase de levedura pode ser uma alternativa para minimizar os efeitos adversos no tratamento da leucemia linfoblástica. Os ecossistemas Antárticos têm um grande potencial para obter novas enzimas produzidas a partir de microorganismos psicrofílicos e psicotrolerantes. As leveduras isoladas de amostras coletadas na Península Antártica pela equipe de expedição do PROANTAR foram testadas para a produção de ASNase e L-glutaminase (GLNase). A partir desta triagem, a cepa Leucosporidium scottii L115 apresentou a maior atividade de ASNase (6,24 U g-1 dcw) com uma combinação de baixa atividade de GLNase (0,41 U g-1 dcw). A ASNase pertencente a L. scottii L115 (LsASNase) foi purificada 227 vezes com uma atividade específica de 137,01 U mg-1 a 37 ºC e com 0,93 U mg-1 de GLNase. A atividade máxima foi observada a pH 7,5 a 55 ºC. A enzima é um multímero que apresenta uma banda única de 54,5 kDa de peso molecular em condições redutoras e 462 kDa por cromatografia de exclusão molecular. A LsASNase é uma enzima glicosilada que apresentou uma banda menor a 25 kDa quando tratada com PGNase F. A cinética enzimática revela uma regulação alostérica da enzima e os parâmetros cinéticos foram determinados a 37º C, pH 7,0 como K0,5 = 233 µM, kcat = 54,7 s-1 e nH = 1,52 demonstrando uma cooperatividade positiva pela enzima e o substrato. A produção de ASNase por L. scottii L115 foi melhorada aplicando DoE para o desenvolvimento do meio de cultura. Os desenhos experimentais de PB e CDD forma usados para otimizar a produção de ASNase e forneceram os valores de nutrientes de 6,15 gL-1 de prolina, 28,34 gL-1 de sacarose e 15,61 gL-1 de glicerol para uma produção máxima. O meio sintético contendo as quantidades otimizadas foi adicionado com os sais: : KCl, 0.52 g L-1; MgSO4.7H2O, 0.52 g L-1; CuNO3.3H2O, 0.001 g L-1; ZnSO4.7H2O, 0.001 g L-1; FeSO4.7H2O, 0.001 g L-1.O meio otimizado produz 23.75 ULh-1 de ASNase em cultivo em frasco agitado. Além disso, L. scottii é caracterizada como uma levedura oleaginosa que acumula lipídios com um perfil adequado de ácidos graxos. A produção de ASNase e lipídios foi ampliada no biorreator de 1 L para avaliar a concentração celular inicial, fonte de carbono e taxa de transferência de oxigênio (kLa). Os experimentos foram realizados a 15ºC no biorreator BIOSTAT®Q plus (Sartorius Stedim) em modo batelada, utilizando 0,5 L da cultura de meio otimizado em tampão fosfato 50 mM pH 7,0. A concentração celular inicial foi avaliada em 1%, 3% e 5% (v / v). Sacarose e glicerol foram testados isoladamente para examinar se a combinação de ambos é obrigatória para produzir ASNase. Todos esses ensaios foram realizados em duplicado. O kLa foi avaliado através de um planejamento CCD na faixa de 1,42-123,0 h-1. O desempenho no biorreator mostrou a produtividade de 36,95 ULh-1 de ASNase sob condições otimizadas (temperatura de crescimento 15º C, X0: 5 g L-1, pH 7,0, 48 h, kLa 89-92 h-1). O cultivo de L. scottii L115 a 15ºC em sacarose e glicerol como fontes de carbono gera um perfil lipídico interessante, onde apresenta lipídios monoinsaturados e poliinsaturados.

L-asparaginase (L-ASNase) é uma enzima com propriedades interessantes para a indústria médica, farmacêutica e de alimentos, que tem recebido atenção especial, inclusive no Brasil, por fazer parte do protocolo de tratamento de distúrbios linfoproliferativos, como a leucemia linfoblástica aguda (LLA). No mercado desde a década de 1970, as enzimas de origem bacteriana enfrentam algumas limitações por provocarem reações adversas graves em quase 80% dos pacientes em tratamento. Nesse contexto, L-ASNases provenientes de leveduras se destacam como alternativa, por serem mais próximas às congêneres humanas. A Antártica ainda é um ambiente pouco explorado, com grande diversidade de microrganismos com potencial para a produção de moléculas biológicas de interesse industrial. Nesse contexto, 150 leveduras isoladas de amostras de sedimento marinho coletadas na Península Antártica como parte do projeto MICROSFERA (PROANTAR/CNPq) foram avaliadas para a produção de L-ASNase. A triagem resultou em 9 isolados produtores, dos quais 7 pertencem ao gênero Leucosporidium. A linhagem L. muscorum CRM 1648 foi a que produziu mais enzima (540 U.L-1), com maior produtividade (5,6 U.L-1.h-1) e, por isso, foi alvo deste estudo. A análise univariada de fontes de carbono e nitrogênio indicou maior crescimento desse microrganismo e produção de L-ASNase em meio CD com extrato de levedura, prolina e sacarose. Ureia, cloreto de amônio e sulfato de amônio resultaram em baixa ou nenhuma produção da enzima, sugerindo que a metabolização de fontes de nitrogênio por essa linhagem está sob a influência do fenômeno de repressão catabólica pelo nitrogênio (RCN). Dois delineamentos experimentais do tipo fatorial completo resultaram em um aumento de 10 vezes na produção e produtividade da enzima (4582,5 U.L-1 e 63,6 U.L-1.h-1, respectivamente). A análise univariada da concentração inicial de inóculo (X0), pH inicial do meio, temperatura e adição de água do mar mostrou que a melhor condição para a produção foi: pH = 5,5 ou 6,5, cultivo a 15°C com adição de água do mar (25-50% m/v). A variável X0 não foi significativa nas concentrações avaliadas. Cultivos em biorreator (batelada) foram conduzidos em quatro diferentes níveis de oxigênio dissolvido (OD): (1) OD não controlado e abaixo de 20%, (2) OD não controlado e acima de 20%, (3) OD controlado em 80% e (4) OD controlado em 20%. Os resultados mostraram que OD é fator limitante para o crescimento de L. muscorum CRM 1648 e produção de L-ASNase por essa levedura e deve ser mantido acima de 35% para maior produção da enzima.Neste trabalho, a composição do meio e condições de cultivo foram estabelecidas para favorecer a produção de uma nova L-ASNase livre de atividade glutaminásica por levedura adaptada ao frio, abrindo espaço para novos estudos acerca de seu potencial antileucêmico e possível uso como alternativa às enzimas já existentes no mercado no tratamento de LLA. / L-asparaginase (L-ASNase) is an enzyme with interesting properties for medical, pharmaceutical and food industry, which has received special consideration, especially in Brazil, for being part of lymphoproliferative disorders treatment, such as acute lymphoblastic leukemia (ALL). Bacterial enzymes are on the market since the 1970s and face some limitations related to theirserious adverse reactions that reach almost 80% of all patients in treatment. In this context, L-ASNases from yeasts are highlighted as important alternative to bacterial enzymes, due to the closerphylogeny to human congeners. Antarctic environment has much to be explored, with a vast diversity of microorganisms with potential to produce biomolecules with industrial interest. A total of 150 yeasts isolated from Antarctic marine sediments as part of MICROSFERA project (PROANTAR/CNPq) were evaluated for L-ASNase production. The screening resulted in 9 producers, 7 species from the genus Leucosporidium. L. muscorum CRM 1648 was the strain that yielded the highest L-ASNase activity (540 U.L-1) and volumetric productivity (5.6 U.L-1.h-1). Carbon and Nitrogen sources were evaluated by a method of one-factor at a time (OFAT). From the gather results, sucrose, yeast extract and proline resulted in a maximal growth and highest enzyme production.The absence or low production of L-ASNase in medium with urea, ammonium chloride and ammonium sulfate suggests the presence of nitrogen catabolic repression (NCR). Carbon and nitrogen concentration were evaluated by full factorial design and yielded about ten times higher enzyme and volumetric productivity (4582.5 U.L-1 and 63.6 U.L-1.h-1, respectively). Initial inoculum concentration (X0), initial pH, temperature and concentration of seawater in the culture were evaluated by OFAT analysis and the best condition for L-ASNase production was: pH = 5.5 or 6.5, at 15 °C with addition of seawater (25-50 wt%). X0 was not considered a significant variable. Bioreactor assays (in batch regime) were performed in four different dissolved oxygen (DO) levels: (1) without DO control (DO remained under 20%), (2) without DO control (DO remained above 20%), (3) DO controlled at 80%, and (4) DO controlled at 20%.The results showed that DO is a key factor for growth of L. muscorum CRM 1648 and production of L-ASNase by this yeast and should be maintained above 35% for higher production of this enzyme.At this work, the medium and culture conditions were established to support the production of a novel glutaminase-free L-ASNase by a cold adapted yeast, opening a new path for further studies regarding its antileukemic potential and possible use as an alternative for ALL treatment.