Four analogues of the Lewis X trisaccharide antigen (β-D-Galp(1→4)[α-L-Fucp(1→3)]-D-GlcNAcp) in which the galactosyl residue is modified at O-4 as a methyloxy, deoxychloro, deoxyfluoro or deoxy were synthesized. The preparation of the modified 4-OMe, 4-Cl, 4-F and 4-H trichloroacetimidate galactosyl donors is described as well as their use in the glycosylation of an N-acetylglucosamine glycosyl acceptor. The resulting disaccharides were deprotected at O-3 of the glucosamine residue and fucosylated giving access to the desired protected Lewis X analogues. One step global deprotection (Na/NH3) of the protected 4”-methoxy and 4”-deoxy analogues, and two step deprotections (removal of a p-methoxybenzyl with DDQ, then Zemplén deacylation) of the 4”-deoxychloro and 4”-deoxyfluoro protected Lex analogues gave the desired compounds in good yields. The relative binding energies of the 4” manipulated Lewis X methyl glycoside analogues for anti-Lewis X mAb SH1 were determined using competitive ELISA procedures. The binding experiments revealed that substitution of the 4” site with a deoxychloro, deoxyfluoro or deoxy function had a large differential change in the free energy of binding; yet they did not completely abolish cross reactivity with native Lewis X. Substitution with a methyloxy function eliminated recognition by anti-Lewis X monoclonal antibody SH1. / NSERC

Helicobacter pylori (H. pylori) is a human-specific gastric pathogen which is responsible for a spectrum of diseases ranging from superficial gastritis to gastric and duodenal ulceration, and which is also highly associated with gastric cancer. The pathogenesis of severe gastric disorders caused by H. pylori is multifactorial and involves complex interactions between the microbe and the gastric mucosa. H. pylori expresses several adhesion proteins. These molecules have important roles in the establishment of persistent infection and chronic inflammation, which cause tissue damage. The aim of this thesis was to study the attachment of this bacterium to human gastric epithelium, mediated by blood group antigens in both health and disease. One of the bestcharacterized H. pylori adhesins is the histo-blood group antigen binding adhesin (BabA), which binds specifically to the Lewis b antigen (Leb) in the gastric mucosa. A protective mucus layer lines the stomach. The mucosal glycosylation patterns (GPs) vary between different cell lineages, different locations along the gastrointestinal (GI) tract and different developmental stages. In addition, GPs undergo changes during malignant transformation. MUC5AC is a mucin molecule produced by the surface epithelium. Three distinctly different types of human gastrointestinal tissue were studied by bacterial adherence analysis in situ. MUC5AC is the most important carrier of Leb and the new results demonstrate that it forms major receptors for H. pylori adherence. By analysing an H. pylori babA-deletion mutant, a novel adhesin-receptor binding mode was found. Surprisingly, the mutant bound efficiently to both human gastric mucosa and to gastric mucosa of Leb transgenic mice. The sialylated and fucosylated blood group antigen, sialyl-dimeric-Lewis x (sdiLex), was structurally identified as the new receptor. A positive correlation was found between adherence of H. pylori to sialyl-Lewis x (sLex) and elevated levels of inflammation response in the human gastric mucosa. These results were supported by detailed analysis of sialylated and fucosylated blood group antigen glycosylation patterns and, in addition, in situ bacterial adherence to gastric mucosa of experimentally challenged Rhesus monkey. The cognate sialic acid-binding adhesin (SabA) was purified by the retagging technique, and the corresponding sabA-gene was identified. H. pylori lipopolysaccharide (LPS) contains various Lewis blood group antigens such as Lewis x (Lex) and Lewis y (Ley). Additional bacterial adherence modes, which are independent of the BabA and/or SabA adhesins, could possibly be mediated by Lex interactions. Adherence of a clinical isolate and its corresponding Lex mutant to human gastric mucosa with various gastric pathologies was studied in situ. The results suggest that H. pylori LPS plays a distinct but minor role in promotion of bacterial adhesion. Taken together, the results suggest mechanisms for continuous selection of H. pylori strains, involving capacity to adapt to changes in the local environment such as shifts in cell differentiation and associated glycosylation patterns. Adherence of H. pylori is dependent on both the BabA and the SabA adhesin. Multi-step dependent attachment mechanisms may direct the microbes to distinct ecological niches during persistent infections, driving the chronic inflammation processes further toward the development of peptic ulcer disease and/or malignant transformation. Key words: H. pylori, BabA, adhesin, Lewis b, MUC5AC, sialyl-dimeric-Lewis x, chronic inflammation, SabA, Lewis x, LPS.

Les glucides, les biomolécules les plus abondants dans la nature, sont essentiels pour le maintien et la survie des organismes. Certaines molécules à base de glucides à la fois d'origine synthétique et naturelle sont connues pour leurs activités pharmacologiques et utilisés pour traiter différentes maladies. Deux projets ont été réalisés sur la base d'oligosaccharides biologiquement actifs dans cette thèse. Sialyl Lewis X (sLex), un tétrasaccharide exprimé sur la surface cellulaire d'un tissu embryonnaire et un tissu tumoral, a été découvert pour jouer un rôle important dans l'adhésion entre les cellules tumorales et les cellules endothéliales dans les métastases tumorales à travers la liaison de E-sélectine avec une forte affinité et sélectivité. E-sélectine est un membre de famille des sélectines des molécules d'adhésion cellulaire, exprimée sur l'endothélium tumoral qui est activé par la cytokine. En conséquence, un type de sonde moléculaire basé sur sLex a été conçu et synthétisé dans le but de diagnostiquer le cancer. Aminoéthyle glycoside de sLex 36 a été efficacement préparé à partir de quatre synthons monosaccharidiques par sept étapes d’une manière hautement stéréosélective et régiosélective avec un rendement total de 18%. La sonde moléculaire conjuguant 36 avec une protéine marqué a été montré capable de visualiser une tumeur implantée chez la souris par imagerie in vivo, alors que le contrôle négatif a donné seulement un profil de circulation vasculaire. Ce travail est actuellement dans le processus d'un dépot de brevet. D'autre part, le mécanisme de traitement des N-glycanes par l'endo-α-mannosidase et les inhibiteurs de cette enzyme ont été étudiés. Décorations de N-glycane existent sur la plupart des protéines eucaryotes et leurs compositions aberrantes sont associés à diverses maladies, y compris les infections virales et le cancer. Endo-α-mannosidase hydrolyse la liaison α-1,2-mannosidique entre le mannose en glucose-substitué et le reste de la N-glycane dans l'appareil de Golgi, en fournissant une voie indépendante de glucosidase I et II pour la maturation de N-glycane. Le but de présente étude est de confirmer le mécanisme catalytique nouvellement proposé pour endo-α-mannosidase: la participation du groupe voisin via un 1,2-anhydro intermédiaire de sucre. Etant donné que cet intermédiaire est instable, le glycosyl-1,2-β-anhydro carbasucre 53 a été conçu et synthétisé pour soutenir l'existence de cet intermédiaire pour l'hydrolyse catalysée par glycosidase. De plus, le glycosyl-1,2-β-aziridine carbasucre 64 et le glycosyl-1,2-oléfinique carbasucre 63 ont été conçus et synthétisés comme nouveaux inhibiteurs d’endo-α-mannosidase pour le développement d'agents thérapeutiques. En outre, le glycosyl-1,2-α-anhydro carbasucre 52 et le glycosyl-1,2-α-aziridine carbasucre 65 ont également été synthétisés comme références. Tous les composés cibles ont été préparés de manière efficace à partir du même glycosyl-carbasucre qui a été obtenu de D-(+)-maltose par plusieurs étapes de protections, de modifications, du réarrangement de Claisen. L'évaluation biologique est en cours. / As the most abundant biomolecules found in nature, carbohydrates are essential for sustaining and survival of organisms. Some carbohydrate-based molecules both of synthetic and natural origin are known for their pharmacological activities and used to treat different diseases. Two projects were carried out based on biologically active oligosaccharides in this thesis. Sialyl Lewis X (SLex), which is a tetrasaccharide expressed on cell surface of embryonic tissue and tumor tissue, was discovered to play an important role in the adhesion between tumor cells and blood endothelial cells in tumor metastases through binding E-selectin with high affinity and selectivity. E-selectin is a member of the selectin family of cell adhesion molecules, expressed on cytokine activated tumoral endothelium. Accordingly, a kind of molecular probe based on sLex was designed and synthesized for the purpose of diagnosing cancer. Aminoethyl glycoside of sLex 36 was efficiently prepared from four monosaccharide building blocks through seven steps with high stereoselectivity and regioselectivity in 18% total yield. The molecular probe conjugating 36 with a labelled scaffold protein was shown to visualize an implanted tumor in the mouse by in vivo imaging, whereas the negative control gave only a vascular circulation profile. This work is currently in the process of a patent application. On the other hand, N-linked glycans processing mechanism by endo-α-mannosidase and this enzyme’s inhibitors were studied. N-glycan decorations exist on the majority of eukaryotic proteins and their aberrant compositions are associated with various diseases, including viral infection and cancer. Endo-α-mannosidase hydrolyzes the α-1,2-mannosidic bond between the glucose-substituted mannose and the rest of the N-glycan in Golgi apparatus, providing a glucosidase I and II independent pathway for the maturation of N-glycan. The aim of the present study is to confim the newly proposed catalytic mechanism for endo-α-mannosidase: neighboring group participation via a 1,2-anhydro sugar intermediate. Since this intermediate is unstable, glycosyl-1,2-β-anhydro carbasugar 53 was designed and synthesized to support the existence of this intermediate for glycosidase-catalyzed hydrolysis. Moreover, glycosyl-1,2-β-aziridine carbasugar 64 and glycosyl-1,2-olefinic carbasugar 63 were designed and synthesized as novel endo-α-mannosidase inhibitors for the development of therapeutic agents. In addition, glycosyl-1,2-α-anhydro carbasugar 52 and glycosyl-1,2-α-aziridine carbasugar 65 were also synthesized as compare. All the target compounds were prepared efficiently from the same glycosyl-carbasugar that was obtained from D-(+)-maltose through several steps of protections, modifications, and Claisen rearrangement. The biological evaluation is underway.

Influenza A viruses (IAVs) cause occasional pandemics and seasonal epidemics, thus presenting continuous challenges to public health. Vaccination is the primary strategy for the prevention and control of influenza outbreaks. The antigenicity matched high-yield seed strain is critical for the success of influenza vaccine. Currently, there are several limitations for the influenza vaccine manufacture: 1) the conventional methods for generating such strains are time consuming; 2) egg-based vaccines, the predominant production platform, have several disadvantages including the emergence of viral antigenic variants that can be induced during egg passage; 3) vaccine seed viruses often do not grow efficiently in mammalian cell lines. Previous studies suggested that mutations in the receptor binding site (RBS) that locates at the globular head of the HA1 can change IAVs’ binding specificity, antigenicity, and yield and thus RBS would be an potential target for engineering vaccine seed strain. However, systematic analysis of the mutations on RBS affecting those viral phenotypes is lacking. Specifically, this dissertation has following aims: Firstly, we developed a novel method to rapidly generate high-yield candidate vaccine strains by integrating error-prone PCR, site-directed mutagenesis strategies, and reverse genetics. The error-prone PCR- based reverse genetic system could also be applied to gain-ofunction studies for influenza virus and other pathogens; Secondly, in this dissertation, we identified an Y161F mutation in the hemagglutinin (HA) that enhanced the infectivity and thermostability of virus without changing its original antigenic properties which would prompted the development of cell-based vaccines; Thirdly, the molecular mechanisms underlying host adaption of equine-origin influenza A(H3N8) virus from horses to dogs are unknown. This dissertation identified that a substitution of W222L in the HA of the equine-origin A(H3N8) virus facilitated its host adaption to dogs. This mutation increased binding avidity of the virus specifically to sialyl Lewis X motifs, which were found abundantly in the submucosal glands of dog trachea but not in equine trachea. To summary, this dissertation investigated the role of RBS in IAVs biology and expanded the current knowledge toward IAV vaccine strain engineering, IAV host adaption and evolution.

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Dans cet ouvrage sera décrite la synthèse de nouveaux analogues du sialyl Lewis X (sLex). A cet effet, nous avons préparé une librairie d’analogues synthétisée à partir d’une approche mettant en jeu un «espaceur» acyclique permettant d’avoir un biais conformationnel que nous avons défini comme la stratégie ATC-B. Nous avions déjà démontré que certains analogues portant un groupe benzoate en C-2 et en C-4 du galactose présentent une activité 50 fois supérieure à celle du sLex. Nous avions par ailleurs démontré qu’en l’absence du benzoate en C-2, l’activité devient alors trois fois plus faible. A présent, il paraissait interessant de synthétiser des analogues ayant seulement un groupe benzoate en C-4 pour evaluer l’impact de ce groupement sur la puissance de nos analogues. Par le passé, nous avions également mis en évidence le rôle des esters sur l’activité des analogues portant un «espaceur» acyclique dans le cadre de la stratégie ATC-B. Nous effectuerons donc des variations à ce niveau pour en évaluer l’impact. Enfin, nous avons préparé une nouvelle famille d’analogues de type dimère. Ceux-ci seront constitués de 2 unités des composés monomériques synthétisés précédemment. La synthèse de ces dimères fera l’emploi de la «Click Chemistry». Cette étude nous mènera a vous présenter la synthèse de ces composés et la méthodologie employée. / This work describes the synthesis of novel sialyl Lewis X (sLex) analogues. To this end, we have prepared a library of analogues by implementing a strategy that makes use of an Acyclic Tether which allows for defined Conformational Bias (ATCB strategy). We have previously shown that analogues bearing a benzoate group at both positions C-2 and C-4 of the galactose exert an activity 50-fold greater than that of sLex. Indeed, removing the benzoate at position C-4 while keeping the one at C-2 led to a three fold decrease in potency. We are currently preparing the corresponding analogues that have the benzoate only at position C-4 in order to fully evaluate its impact on the potency of the analogue. We have also previously elucidated the role of esters on the activity of analogues that have acyclic tether as part of the ATC-B strategy. Variations have been made at the level of the ester and their impact has been evaluated. Lastly, we have prepared a novel family of analogues consisting of two identical monomeric subunits linked together. Synthesis of these dimers was performed via «Click Chemistry». This study describes the synthesis of the compounds and the methodology employed.

Dans cet ouvrage sera décrite la synthèse de nouveaux analogues du sialyl Lewis X (sLex). A cet effet, nous avons préparé une librairie d’analogues synthétisée à partir d’une approche mettant en jeu un «espaceur» acyclique permettant d’avoir un biais conformationnel que nous avons défini comme la stratégie ATC-B. Nous avions déjà démontré que certains analogues portant un groupe benzoate en C-2 et en C-4 du galactose présentent une activité 50 fois supérieure à celle du sLex. Nous avions par ailleurs démontré qu’en l’absence du benzoate en C-2, l’activité devient alors trois fois plus faible. A présent, il paraissait interessant de synthétiser des analogues ayant seulement un groupe benzoate en C-4 pour evaluer l’impact de ce groupement sur la puissance de nos analogues. Par le passé, nous avions également mis en évidence le rôle des esters sur l’activité des analogues portant un «espaceur» acyclique dans le cadre de la stratégie ATC-B. Nous effectuerons donc des variations à ce niveau pour en évaluer l’impact. Enfin, nous avons préparé une nouvelle famille d’analogues de type dimère. Ceux-ci seront constitués de 2 unités des composés monomériques synthétisés précédemment. La synthèse de ces dimères fera l’emploi de la «Click Chemistry». Cette étude nous mènera a vous présenter la synthèse de ces composés et la méthodologie employée. / This work describes the synthesis of novel sialyl Lewis X (sLex) analogues. To this end, we have prepared a library of analogues by implementing a strategy that makes use of an Acyclic Tether which allows for defined Conformational Bias (ATCB strategy). We have previously shown that analogues bearing a benzoate group at both positions C-2 and C-4 of the galactose exert an activity 50-fold greater than that of sLex. Indeed, removing the benzoate at position C-4 while keeping the one at C-2 led to a three fold decrease in potency. We are currently preparing the corresponding analogues that have the benzoate only at position C-4 in order to fully evaluate its impact on the potency of the analogue. We have also previously elucidated the role of esters on the activity of analogues that have acyclic tether as part of the ATC-B strategy. Variations have been made at the level of the ester and their impact has been evaluated. Lastly, we have prepared a novel family of analogues consisting of two identical monomeric subunits linked together. Synthesis of these dimers was performed via «Click Chemistry». This study describes the synthesis of the compounds and the methodology employed.

Mon travail de thèse a porté sur le ciblage de la vascularisation tumorale : des molécules ciblant l'endothélium tumoral ont été recherchées dans le but d'amener des molécules thérapeutiques spécifiquement vers l'endothélium tumoral afin de le détruire et d'atteindre la tumeur qui en dépendait. D'après les données de la littérature, deux cibles ont été choisies pour notre étude : la sélectine E et l'endogline. La sélectine E est une glycoprotéine surexprimée à la surface de l'endothélium activé des zones inflammatoires et tumorales. Classiquement, des antagonistes de son ligand naturel, le SleX, sont recherchés. En nous appuyant sur les groupements clés de l'interaction entre la sélectine E et le SleX, plusieurs familles de mimes du SleX ont été élaborées. La capacité de ces mimes à déplacer l'interaction du SleX exprimé à la surface des cellules HL-60 avec la sélectine E a été évaluée dans un test d'adhésion. Cependant, aucun des mimes testés n'a présenté une affinité suffisante pour envisager son utilisation comme tête de ciblage. Une deuxième stratégie a consisté à rechercher des ligands peptidiques de la sélectine E en criblant des HUVECs activées avec une banque de peptides sur phages. Plusieurs phages-peptides testés en ELISA ont montré une meilleure affinité pour la sélectine E et / ou avec la sélectine P par rapport au phage sans insert. Des tests de compétition avec des peptides synthétiques correspondants permettront d'évaluer leur spécificité pour la cible. En ce qui concerne l'endogline, des ligands peptidiques ont été recherchés avec une banque de peptides sur phages. Dans un premier temps, le gène codant l'endogline humaine a été cloné dans un vecteur d'expression eucaryote afin de réaliser la sélection sur la protéine cellulaire. Une sélection sur la protéine recombinante a été réalisée par la suite pour diminuer le bruit de fond lié aux cellules. Parmi les peptides obtenus, certains ont montré des homologies de séquence avec des ligands de l'endogline et le test de ces phages-peptides en ELISA sur la protéine recombinante a donné un fort signal par rapport au phage sans insert. Ces peptides seront caractérisés prochainement. En conclusion, des ligands peptidiques des sélectines E et P et de l'endogline ont peut-être été identifiés. Ce travail a par ailleurs permis de mettre en place les outils nécessaires à l'utilisation de la technologie de sélection avec des banques de peptides sur phages dans les meilleures conditions possibles.