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Efecto inmunomodulador de las células madre mesenquimales sobre linfocitos T helper 1 y T helper 17

Fernández Barriga, Ximena Beatriz January 2012 (has links)
Memoria para optar el título de Bioquímico / Las Células Madre Mesenquimales (MSCs) se han convertido en un interesante campo de estudio. Inicialmente fueron estudiadas por su capacidad de diferenciarse a células de diversos tejidos mesodermales, sin embargo, con el paso de los años se determinó que las MSCs tenían una amplia capacidad de escapar del reconocimiento de células del sistema inmune. Más tarde se descubrió que las MSCs no solo tienen la capacidad de escapar del reconocimiento, sino que también son capaces de inhibir la activación y proliferación de células del sistema inmune. Diversas enfermedades autoinmunes y proinflamatorias están mediadas por linfocitos T, principales células efectores del sistema inmune adaptativo, por tanto, dadas las características inmunosupresoras de las MSCs, han sido propuestas como nueva estrategia terapéutica para el tratamiento de estas enfermedades. Con este objetivo, varios autores han enfocado sus estudios para determinar el mecanismo por el cual las MSCs ejercen este efecto inhibitorio. Algunos autores postulan que el contacto celular, entre MSCs y linfocitos, es indispensable para producir este efecto, sin embargo otros postulan que las MSCs secretan una amplia variedad de factores solubles inmunosupresores que son suficientes para producir el efecto inmunosupresor. Dentro de las estirpes linfocitarias sobre las cuales las MSCs podrían ejercer su efecto inmunosupresor encontramos a los linfocitos T helper (TH), las cuales son células efectoras que se clasifican principalmente en: linfocitos TH1 que participan en la respuesta contra bacterias intracelulares, linfocitos TH2 que participan en la respuesta contra parásitos, linfocitos TH17 que participan en la respuesta contra bacterias extracelulares y hongos y, finalmente, los linfocitos T reguladores (Treg) cuya función es mantener la homeostasis del sistema inmune y promover la tolerancia inmunológica frente a antígenos propios. Durante más de una década fue ampliamente descrita la capacidad inmunosupresora de las MSCs sobre linfocitos T, sin embargo en los últimos años se ha descrito que bajo ciertas condiciones las MSCs producen un efecto estimulador sobre algunas de estas estirpes linfocitarias. El objetivo de este estudio fue determinar si las MSCs suprimen la proliferación y diferenciación de linfocitos TH1 y TH17. Estos linfocitos fueron estudiados ya que se ha descrito que diversas enfermedades autoinmunes se caracterizan por un aumento o desbalance de estas estirpes. Para esto, investigamos si es que el efecto inmunomodulador de las MSCs era dependiente del estado de activación y diferenciación de linfocitos, del ratio MSCs:CD4+, del contacto celular o de factores solubles. Dado que ha sido ampliamente descrito que las MSCs son capaces de secretar basalmente IL-6, la cual corresponde a una citoquina que cumple diversas funciones sobre el sistema inmune, entre ellas promover la secreción de citoquinas y factores de crecimiento necesarias para la respuestas de linfocitos T y que además son capaces de promover la estirpe, altamente proinflamatoria, TH17, y que esta secreción aumenta cuando las MSCs se encuentran frente a estímulos proinflamatorios como IFN-γ o TNF-α, postulamos que la IL-6 secretada por las MSCs es el principal factor soluble involucrado en la inmunomodulación ejercida por las MSCs. Las MSCs fueron obtenidas a partir de médula ósea de ratones C57BL/6 y caracterizadas por el patrón de expresión de antígenos de superficie y por su capacidad de multidiferenciación. Los linfocitos T CD4+ fueron obtenidos a partir de bazo de ratones C57BL/6, purificados mediante kit comercial y cultivados en presencia de citoquinas que favorecen la diferenciación hacia la estirpe TH1 o TH17. Las MSCs fueron agregadas a los cultivos de linfocitos TH1 o TH17 a distintos tiempos de cultivo celular en presencia o ausencia de contacto celular, contacto MSCs-linfocito. La diferenciación de los linfocitos fue medida por medio de la detección de citoquinas intracelulares características de ambas estirpes, IFN-γ e IL-17 para linfocitos TH1 y TH17 respectivamente, por medio de citometría de flujo. Demostramos que las MSCs son capaces de inhibir a linfocitos TH1 independiente del estado de activación y del ratio MSCs:CD4+. Determinamos que el efecto inmunosupresor está presente incluso en condiciones donde no existe contacto celular y que este efecto es independiente de la IL-6 secretadas por las MSCs. A diferencia de lo que ocurre con linfocitos TH1, las MSCs sólo son capaces de inhibir a linfocitos TH17 cuando estas son agregadas a tiempo temprano al cultivo celular y este efecto es dependiente del contacto celular, mientras que cuando las MSCs son agregadas al cultivo a tiempos tardíos, al día 4 de cultivo celular, promueven la diferenciación de linfocitos TH17. Concluimos que el efecto inmunomodulador que ejercen las MSCs sobre linfocitos TH1 y TH17 es por medio de mecanismos diferenciales. El efecto inmunosupresor sobre linfocitos TH1 es independiente de IL-6, sin embargo, no ha sido posible determinar el efecto real que ejerce la IL-6 secretada por las MSCs sobre linfocitos TH17 ya que la diferenciación de linfocitos TH17 requiere de IL-6 en el medio de cultivo. Sin embargo, determinamos que las MSCs en baja concentración no solo pierden su capacidad inhibitoria cuando se encuentran con linfocitos TH17 diferenciados sino que son capaces de promover su diferenciación. Observamos también que la IL-6 proveniente de MSCs podría, bajo ciertas, de revertir este efecto / Mesenchymal Stem Cells (MSCs) have become an interesting field of study. Initially MSCs where studied for their capacity to differentiate into various cell types from different tissues from the mesoderm, however, over the years was determined that MSCs have a large capacity to escape from the recognition by cells from the immune system. Later it was discovered that MSCs not only have the capacity to escape recognition, but are also able to inhibit the activation and proliferation of immune cells. Several autoimmune and proinflammatory diseases are mediated by T cells, major effectors cells of the adaptive immune system, therefore, given the immunosuppressive properties of MSCs they have been proposed as a new therapeutic strategy for treating these diseases. To this end, several authors have focused their studies to determine the mechanisms by which MSCs exert this inhibitory effect. Some authors postulate that cell contact between MSCs and lymphocytes is essential to produce this effect, while others postulate that MSCs secrete a wide variety of immunosuppressive soluble factors that are sufficient to produce the immunosuppressive effect on T lymphocytes. MSCs can exert their immunosuppressive effect on lymphocytes called T helper (TH), which are an effectors cell line mainly classified into: TH1 cells that participate in the response against intracellular bacteria, TH2 cells that participate in the response against parasites, TH17 cells that participate in the response against extracellular bacteria and fungi. Finally there are T regulatory (Treg) cells which main function is to maintain immune system homeostasis and to promote immunologic tolerance against self antigens. For over a decade, it was widely described the immunosuppressive capacity of MSCs on T lymphocytes, however in recent years it has been described that under certain conditions MSCs may produce a stimulatory effect on some of these lymphocytes strains. The aim of this study was to determine whether MSCs are able to suppress TH1 and TH17 proliferation and differentiation. These cells were studied because it has been previously described that many autoimmune disease are characterized by and increase or imbalance of this two strains. For this purpose, we investigated whether de immunomodulatory effect of MSCs was dependent on lymphocytes activation and differentiation state, MSCs: CD4+ ratio, cell contact or soluble factors. It has also been highly described that MSCs are able to secrete basal amounts of IL-6, cytokine which has a variety of function on the immune system, among them, to promote cytokine and growth factor secretion necessary for T cell response, and to promote differentiation of the highly proinflammatory TH17 cells. These IL-6 basal secretion is augmented when MSCs are in presence of proinflammatory stimulus like IFN-γ or TNF-α, thus we postulate that MSCs secreted IL-6 main soluble factor involved in MSCs immunomodulation. MSCs were obtained from mice bone marrow and characterized by their surface antigen expression pattern and their capability of multilineage differentiation. CD4+ T cells were obtained from mice splenocytes, purified by a commercial Kit and cultivated with cytokines that promote the differentiation to TH1 or TH17 cells. MSCs were added to TH1 or TH17 cultures at early or late time points and in the presence or absence of cell to cell contact, MSCs-T cell contact, mediated by a transwell system. The differentiation of TH1 or TH17 cell was measured by the detection of intracellular cytokines characteristics for each population, IFN-γ and IL-17 for TH1 and TH17 cells respectably, by flow cytometry. We demonstrated that MSCs are capable to suppress TH1 cells differentiation despite on their state of activation or MSCs:CD4+ ratio. We determined that the immune suppressor effect of MSCs is present even in the absence of cell to cell contact and that this effect is independent of MSCs secreted IL-6. In contrast with TH1 cells, MSCs are only capable to suppress TH17 cells when added at early time points of cell culture and that this effect requires cell to cell contact, while promoting TH17 differentiation when added at later time points, at day 4 of cell culture. We concluded that the immune modulator effect of MSCs on TH1 and TH17 cells is mediated by differential mechanism. The immune suppressor effect on TH1 cells is independent from IL-6, though it was not possible to determined de real effect of MSCs secreted IL-6 over TH17 cells, since the TH17 differentiation media requires IL-6. However, we determined that low concentration of MSCs in the coculture, fail to inhibit TH17 differentiation more over they promote an augmentation of TH17 cells. We also observed that under certain culture conditions MSCs secreted IL-6 may revert this effect
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Produção de anticorpos monoclonais para a molécula CD28 de linfócitos de galinha

Ribeiro, Caroline Fidalgo 28 January 2013 (has links)
Resumo: CD28 de mamífero é uma glicoproteína com um importante papel na ativação de células T, através de sua interação com seus ligantes CD80 e CD86. Para se tornarem ativadas, células T naïve precisam reconhecer um peptídeo não próprio em moléculas MHC especificas. Entretanto, as células não estarão prontas para proliferar e iniciar a resposta imune sem o sinal co-estimulatório. Esse sinal ocorre através da interação entre CD28 e seus ligantes, induzindo as células T a proliferarem e expressarem IL-2. Em galinhas, CD28 possui propriedades funcionais similares, inclusive a ativação de células T; porém, seu perfil de expressão em células aviárias é desconhecido. Enquanto há inúmeros estudos sobre CD28 humano ou murino, há uma pequena quantidade de estudos acerca de CD28 de aves. Portanto, clonamos toda a proteína CD28 de galinha e sua porção extracelular em um plasmídeo reengenheirado eucarioto (pcDNA3.1(-)6His) e procarioto (pET28a(+)) respectivamente, visando a produção de uma ferramenta biotecnológica que auxilie o estudo do sistema imunológico de aves e o papel de CD28 nele. A proteína heteróloga expressa em bactérias foi purificada a partir de corpos de inclusão usando cromatografia de afinidade por metal imobilizado. Soro hiperimune foi gerado em camundongos por três imunizações intraperitoniais com a porção extracelular de CD28 como antígeno. Os anticorpos policlonais reconhecem tanto o CD28 expresso em células 293T, quanto a proteína endógena expressa em células T. Esplenócitos foram fusionados a células mielóides (P3.653) e hibridomas estáveis reativos a CD28 foram obtidos. Juntos, estes resultados sugerem que o antígeno expresso em bactéria é um imunógeno adequado para a obtenção de anticorpos contra a proteína expressa em células sanguíneas de aves.
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Participação de estoques intracelulares de Ca2+ no mecanismo de secreção de insulina : efeito do anestesico local tetracaina

Bosqueiro, José Roberto 08 March 1999 (has links)
Orientador: Antonio Carlos Boschero / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-25T05:18:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bosqueiro_JoseRoberto_D.pdf: 3058404 bytes, checksum: 8c3a8b84e90f4ed4b5bce3915db95301 (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: Foi realizado estudo do efeito da tetracaína sobre o efluxo de 45Ca, a concentração de Ca2+ citoplasmático, [Ca2+]i, e a secreção de insulina em ilhotas pancreáticas e células B isoladas. Na ausência de Ca2+ externo, tetracaína (0,12,0 mM) aumentou, de maneira dose-dependente, o efluxo de 45Ca de ilhotas isoladas. Tetracaína não afetou o aumento do efluxo de 45.ca causado por 50 mM de K+ ou pela associação de carbacol (Cch - 0,2 mM) e 50 mM de K+. Tetracaína aumentou permanentemente a [Ca2+]i em células B isoladas em meio livre de Ca2+ e acrescido de 2,8 mM de glicose e 25 µM D-600 (metoxiveparamil). Este efeito também foi observado na presença de 10 mM de cafeína ou 1 µM de tapsigargina. Em presença de 16,7 mM de glicose, tetracaína aumentou de maneira transitória a secreção de insulina das ilhotas perfundidas, tanto na ausência quanto na presença de Ca2+ externo. Estes dados indicam que tetracaína mobiliza Ca2+ de um estoque insensível à tapsigargina e estimula a secreção de insulina na ausência de Ca2+ extracelular. O aumento do efluxo de 45Ca causado pelas altas concentrações de K+ e pelo Cch indica que tetracaína não interfere nos estoques sensíveis a cátions ou ao IP3 / Abstract: The effect of tetracaine on 45Ca efflux, cytoplasmic Ca2+ concentration [Ca2+]i and insulin secretion in isolated pancreatic islets and B-cells was studied. In the absence of external Ca2+, tetracaine (0.1-2.0 mM) dose-dependently increased the 45Ca efflux from isolated islets. Tetracaine did not affect the increase in 45Ca efflux caused by 50 mM K+ or by the association of carbachol (Cch - 0.2 mM) and 50 mM K+. Tetracaine permanently increased the [Ca2+]i in isolated B-cells in Ca2+ -free medium enriched with 2.8 mM glucose and 25 µM D-600 (methoxiverapamil). This effect was also observed in the presence of 10 mM caffeine or 1 µM thapsigargin. In the presence of 16.7 mM glucose, tetracaine transiently increased the insulin secretion from islets perifused in the absence and presence of external Ca2+. These data indicate that tetracaine mobilises Ca2+ from a thapsigargin-insensitive store and stimulates insulin secretion in the absence of extracellular Ca2+. The increase in 45Ca efflux caused by high concentrations of K+ and by Cch indicates that tetracaine did not interfere with a cation or IP3-sensitive Ca2+ pool in B-cells / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Ciências
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Rol del receptor 3 de dopamina en la respuesta citotóxica generada en linfocitos T CD8+

Chovar Vera, Ornella January 2018 (has links)
Seminario de Título para optar al Grado de: Magíster en Ciencias Biológicas / El sistema nervioso y el sistema inmune se encuentran íntimamente relacionados comunicándose bidireccionalmente mediante citoquinas, neuropéptidos y neurotransmisores, como la dopamina. Este neurotransmisor ejerce su efecto a través de cinco receptores dopaminérgicos que poseen diferentes grados de afinidad, contando con la mayor afinidad el receptor 3 (D3R). Su presencia se ha reportado en diferentes células del sistema inmune. La estimulación del D3R promueve la producción de IFN-γ en linfocitos T CD4+, favoreciendo su diferenciación a un perfil Th1. Sin embargo, el rol de este receptor en los linfocitos T CD8+ aún no se ha estudiado a cabalidad. En esta tesis se estudió la incidencia del D3R en la formación del perfil citotóxico en linfocitos T CD8+, que poseen un TCR transgénico específico para el péptido OVA(257-264) alojado sobre el MHC de clase I H2-Kb (linfocitos OT-I). La diferenciación in vitro muestra que la carencia del D3R en linfocitos OT-I (OT-I D3RKO) resulta en una reducción significativa en la producción de IFN-γ, TNF-α, IL-2 y en la expresión de CD25 (cadena α del receptor de IL-2) en respuesta a la estimulación con péptido OVA(257-264). Estas deficiencias se revierten al añadir IL-2 exógena a los cultivos, sugiriendo que el mecanismo de acción por el cual el D3R favorece la diferenciación hacia un fenotipo efector productor de IFN-γ y TNF- α ocurre a través de la producción de IL-2. Concordante con lo anterior, se observó que la expresión del D3R en linfocitos OT-I promueve la expansión clonal y la protección antitumoral frente a melanoma. En conjunto los resultados obtenidos en linfocitos T CD8+ sugieren que el D3R promueve la formación de un perfil citotóxico, induciendo la producción de IFN-γ y favoreciendo una alta tasa de expansión clonal, lo que conlleva a una mayor sobrevida frente a un desafío tumoral. / The nervous system and the immune system are intimately related, communicating bi-directionally through cytokines, neuropeptides and neurotransmitters. Dopamine is a neurotransmitter that exerts its effect through five dopaminergic receptors which display different degrees of affinity. The D3R, which display the highest affinity for dopamine, has been found expressed in CD4+ T cells, where its stimulation promotes high production of IFN-γ, favoring the acquisition of the Th1 profile. However, the role of this receptor in CD8+ T lymphocytes has not yet been fully studied. In this thesis the role of D3R in the acquisition of the cytotoxic profile by CD8+ T lymphocytes was studied. For this purpose, in this thesis CD8+ T-cells bearing a transgenic TCR specific for the recognition of the OVA peptide(257-264) over the class I MHC H2-Kb (OT-I lymphocytes) were used. In vitro differentiation experiments show that lack of D3R in OT-I lymphocytes (OT-I D3RKO) results in a significant reduction in the production of IFN-γ, TNF-α and on the expression of CD25 (α chain of the IL-2 receptor) in response to the stimulation with OVA peptide(257-264). These effects were reversed by adding exogenous IL-2 into the cultures, suggesting a mechanism by which D3R favors the differentiation towards an effector phenotype through the production of IL-2. In vivo experiments show that D3R expressed on OT-I lymphocytes favors a higher clonal expansion and thereby an stronger protection against melanoma tumors. The results obtained suggest that D3R promotes the formation of a more efficient cytotoxic profile capable of producing higher percentages of IFN-γ and higher rates of clonal expansion, which leads to greater survival in the face of a tumor challenge. / junio 2020
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Criterios citomorfológicos y términos empleados en el reporte de linfocitos variantes, entre tecnólogos médicos de laboratorios de Lima y Callao, 2010

Vergaray Matos, Milagros Ruth January 2010 (has links)
El reconocimiento de linfocitos variantes (LV) es una importante contribución para la decisión clínica en diversas enfermedades que pueden ir desde una linfocitosis reactiva a una enfermedad maligna con expresión en sangre periférica (SP); sin embargo debido al pleomorfismo que presenta, dificulta su diferenciación de otros tipos celulares generando duda en el reporte. Por otro lado en nuestro país no se ha elaborado un documento normativo para el reporte de citomorfología de SP dándose el caso que la interpretación esta basada en la pericia del observador y la disposición de la información clínica la cual a veces no llega al laboratorio. El presente trabajo tuvo como objetivo establecer los criterios citomorfológicos (CC) utilizados en el reconocimiento y los términos a emplear en el reporte de los linfocitos variantes (LV), entre Tecnólogos Médicos (TM) de laboratorios de Lima y Callao, 2010. Materiales y métodos: Se aplicó una encuesta basada en las pruebas de suficiencia a un total de 200 TM de los laboratorios de Lima y Callao, período Enero-Marzo 2010, quienes participaron voluntariamente en el estudio. La validación del instrumento se logró mediante una prueba piloto, pruebas estadísticas y juicio de expertos. Resultados: En relación a los criterios citomorfológicos mas frecuentemente empleados para el reconocimiento de LV; el “tamaño celular” reportó un 78%, el “tipo de cromatina” 77%, la “forma y posición del núcleo” 56%. Por otro lado el orden de importancia señalado fué: “tipo de cromatina” (24%), seguido por “Basofília citoplasmática” (22%); “tamaño celular” (16.50%) y “relación núcleo /citoplasma” (16.50%). A partir de la prueba de imágenes se halló que el 84.50% reporto la imagen Nº 1(Linfocito) como un linfocito con morfología normal; el 86.00% reporto la imagen Nº 2 (LV no maligno) como un LV; el 67.50% de los reportes informo la imagen Nº 3 (LV maligno), como un LV. De los TM que realizaron el reporte correctamente para la Imagen Nº 02 (172/200), el 61.63% (106/172) emplea el término de “Linfocito Atípico” alcanzando el mayor porcentaje, seguido por un 22.09% (38/172) que emplea “linfocito Variante (LV)”. En relación a las principales discrepancias en el reporte se halló que solo un 34.30% (59/172) incorpora una descripción morfológica en su reporte además del término y porcentaje; el 21.50% (38/177) registra a los LV como una fracción porcentual independiente; mientras que el 78.50% (139/177) incorpora a los LV dentro del conteo porcentual de linfocitos, reportándolos como una subpoblación. Por otro lado el 81% de entrevistados consideran de 0 a 6% como un valor porcentual normal, para nuestro estudio no se ha encontrado un valor referencial en población adulta sana del país. Ante la ausencia de un documento normativo nacional, el 55.50% de los entrevistados se basa en fuentes teóricas y años de experiencia a la vez para el reconocimiento y reporte de LV. Conclusiones: El tipo de cromatina es el principal criterio para establecer el grado de maduración de la célula y ayuda a identificar linaje. El término mas empleado por los entrevistados es Linfocito atípico, sin embargo se presentaron discrepancias en el empleo de este término para referirse a una célula maligna, al igual que sobre incluir o no los LV dentro del porcentaje de linfocitos, la descripción morfológica y como realizarla, los valores referenciales señalados como normales. Por consiguiente es necesario y de suma importancia promover y llevar a cabo un consenso sobre citomorfología hemática, donde se defina el término a emplear, aclarando su connotación maligna, benigna o ambos y la forma de realizar el reporte de LV. Palabras clave: Linfocito variante, Criterio citomorfológico, Términos de Reporte, Linfocito atípico.
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Criterios citomorfológicos y términos empleados en el reporte de linfocitos variantes, entre tecnólogos médicos de laboratorios de Lima y Callao, 2010

Vergaray Matos, Milagros Ruth January 2010 (has links)
El reconocimiento de linfocitos variantes (LV) es una importante contribución para la decisión clínica en diversas enfermedades que pueden ir desde una linfocitosis reactiva a una enfermedad maligna con expresión en sangre periférica (SP); sin embargo debido al pleomorfismo que presenta, dificulta su diferenciación de otros tipos celulares generando duda en el reporte. Por otro lado en nuestro país no se ha elaborado un documento normativo para el reporte de citomorfología de SP dándose el caso que la interpretación esta basada en la pericia del observador y la disposición de la información clínica la cual a veces no llega al laboratorio. El presente trabajo tuvo como objetivo establecer los criterios citomorfológicos (CC) utilizados en el reconocimiento y los términos a emplear en el reporte de los linfocitos variantes (LV), entre Tecnólogos Médicos (TM) de laboratorios de Lima y Callao, 2010. Materiales y métodos: Se aplicó una encuesta basada en las pruebas de suficiencia a un total de 200 TM de los laboratorios de Lima y Callao, período Enero-Marzo 2010, quienes participaron voluntariamente en el estudio. La validación del instrumento se logró mediante una prueba piloto, pruebas estadísticas y juicio de expertos. Resultados: En relación a los criterios citomorfológicos mas frecuentemente empleados para el reconocimiento de LV; el “tamaño celular” reportó un 78%, el “tipo de cromatina” 77%, la “forma y posición del núcleo” 56%. Por otro lado el orden de importancia señalado fué: “tipo de cromatina” (24%), seguido por “Basofília citoplasmática” (22%); “tamaño celular” (16.50%) y “relación núcleo /citoplasma” (16.50%). A partir de la prueba de imágenes se halló que el 84.50% reporto la imagen Nº 1(Linfocito) como un linfocito con morfología normal; el 86.00% reporto la imagen Nº 2 (LV no maligno) como un LV; el 67.50% de los reportes informo la imagen Nº 3 (LV maligno), como un LV. De los TM que realizaron el reporte correctamente para la Imagen Nº 02 (172/200), el 61.63% (106/172) emplea el término de “Linfocito Atípico” alcanzando el mayor porcentaje, seguido por un 22.09% (38/172) que emplea “linfocito Variante (LV)”. En relación a las principales discrepancias en el reporte se halló que solo un 34.30% (59/172) incorpora una descripción morfológica en su reporte además del término y porcentaje; el 21.50% (38/177) registra a los LV como una fracción porcentual independiente; mientras que el 78.50% (139/177) incorpora a los LV dentro del conteo porcentual de linfocitos, reportándolos como una subpoblación. Por otro lado el 81% de entrevistados consideran de 0 a 6% como un valor porcentual normal, para nuestro estudio no se ha encontrado un valor referencial en población adulta sana del país. Ante la ausencia de un documento normativo nacional, el 55.50% de los entrevistados se basa en fuentes teóricas y años de experiencia a la vez para el reconocimiento y reporte de LV. Conclusiones: El tipo de cromatina es el principal criterio para establecer el grado de maduración de la célula y ayuda a identificar linaje. El término mas empleado por los entrevistados es Linfocito atípico, sin embargo se presentaron discrepancias en el empleo de este término para referirse a una célula maligna, al igual que sobre incluir o no los LV dentro del porcentaje de linfocitos, la descripción morfológica y como realizarla, los valores referenciales señalados como normales. Por consiguiente es necesario y de suma importancia promover y llevar a cabo un consenso sobre citomorfología hemática, donde se defina el término a emplear, aclarando su connotación maligna, benigna o ambos y la forma de realizar el reporte de LV. Palabras clave: Linfocito variante, Criterio citomorfológico, Términos de Reporte, Linfocito atípico.
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Exo70 regula la eficiente fusión de lisosomas en la sinapsis inmune

Sáez Pons, Juan José Tomás. 06 1900 (has links)
Doctor en Ciencias con Mención Biología Molecular, Celular y Neurociencias / Los linfocitos B (LB) son las únicas células del sistema inmune capaces de producir anticuerpos. La activación de LB comienza con el reconocimiento de un antígeno específico en la superficie de una célula presentadora, promoviendo la formación de una región especializada en la membrana plasmática conocida como sinapsis inmunológica. Esta estructura permite la extracción, procesamiento y presentación de antígenos a linfocitos T, etapas necesarias para la activación del LB. Durante la extracción la célula adquiere un fenotipo polarizado. El centrosoma, o centro organizador de microtúbulos, se reposiciona hacia la sinapsis inmunológica y actúa como guía para el reclutamiento y posterior fusión de lisosomas a la membrana sináptica, liberando proteasas e hidrolasas que facilitan la extracción del antígeno. La secreción del contenido lisosomal es un proceso esencial para la extracción antigénica, sin embargo, aún se desconocen los mecanismos involucrados en el reclutamiento y fusión de lisosomas. Para indagar en las proteínas involucradas en el mecanismo de regulación de la fusión de lisosomas a la membrana sináptica se utilizó un estudio de proteómica asociado a la sinapsis inmunológica. Tomando en consideración que el centrosoma se polariza y recluta muy cercanamente hacia la sinapsis inmune en LB, se aislaron centrosomas de células activadas y no activadas para detectar cambios en la composición de la sinapsis. Usando esta aproximación se observó un aumento en las células activadas de 4 proteínas del complejo Exocisto. El Exocisto es un complejo proteico encargado del anclaje de vesículas secretorias a la membrana plasmática. Está involucrado en múltiples procesos de secreción polarizada, aunque su rol en LB X se desconoce. En este trabajo se muestra que Exo70, una proteína del complejo Exocisto, se encuentra asociada al centrosoma y se recluta a la sinapsis inmune. La localización y el reclutamiento a la sinapsis de Exo70 se encuentran regulados por la dinámica de microtúbulos y por la proteína de polaridad Par3. Más aun, el silenciamiento de Exo70 inhibe la fusión de los lisosomas a la membrana sináptica, disminuyendo la capacidad de extraer antígeno y presentarlos a linfocitos T. De esta forma, Exo70 surge como un regulador de la extracción de antígenos mediada por la secreción de lisosomas, esencial para el procesamiento y presentación de antígenos. / B lymphocytes are the only cells of the immune system able to produce antibodies. B cells activation starts with a specific antigen recognition presented on the surface of an antigen presenting cell, promoting the formation of a specialized membrane region known as the immune synapse. This structure allows the extraction, processing and presentation of antigens to T lymphocytes, necessary stages for the LB activation. During antigen extraction, B cells adopt a polarized phenotype. The centrosome, or microtubule-organizing center, is repositioned towards the immune synapse and guides the recruitment and posterior fusion of lysosomes to the immune synapse, releasing proteases and hydrolases that facilitate the antigen extraction. The secretion of lysosomal content at the synaptic membrane is an essential process for antigen extraction; however, the mechanisms involved in the recruitment and fusion of the lysosomes remain unknown. To inquire on the proteins involved in the regulation mechanism of lysosome fusion at the synaptic membrane we used a proteomic study associated to the immune synapse. Considering that the centrosome polarizes and is recruited closely to the synaptic membrane, centrosomes from activated and resting cells were isolated to detect protein changes associated to the immune synapse. Using this approach, we observed an increase in 4 proteins belonging to the exocyst complex in the centrosome obtained from activated B cells. The Exocyst is a protein complex involved in the tethering of secretory vesicles to the plasma membrane. It has been associated in multiple processes of polarized secretion, however, its role on the B cells is unknown. In this work we show that Exo70, an exocyst complex subunit, is XII concentrated in the centrosome and is recruited to the immune synapse. Exo70 localization and recruitment depends on the microtubule dynamics and the polarity protein Par3. Moreover, Exo70 silencing inhibits lysosome fusion to the synaptic membrane, impairing efficient antigen extraction and presentation to T lymphocytes. Thus, Exo70 emerges as a regulator of the lysosome-dependent antigen extraction, essential for the processing and presentation of antigens. / Beca de doctorado nacional 2013 CONICYT. - Proyectos FONDECYT 1141182 y 1180900. - Ayuda para estadías cortas de investigación, convocatoria 2015-2016. Vicerrectoría de asuntos académicos, Universidad de Chile. - Proyecto ECOS-CONICYT 111329, convocatoria 2014.
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Efeito do óleo de fígado de tubarão e óleo de peixe sobre a viabilidade de linfócitos expostos ao quimioterápico fluoruracila in vitro

Laffitte, Andressa Madalozo January 2017 (has links)
Orientador : Prof. Dr. Ricardo Antonio Tanhofer / Coorientador : Prof. Dr. Sandro José Ribeiro Bonatto / Dissetação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Fisiologia. Defesa: Curitiba, 28/08/2017 / Inclui referências : f. 65-78 / Resumo: Introdução: A quimioterapia usada no tratamento de neoplasias malignas pode provocar leucopenia, que pode levar à necessidade de suspensão do tratamento até a melhora da imunidade. Mesmo havendo muitos estudos que mostram o efeito imunomodulatório de alguns lipídios, pouco se sabe sobre os mecanismos envolvidos. Objetivos: Avaliar viabilidade/capacidade proliferativa dos linfócitos após período de incubação na presença de óleo de fígado de tubarão (OFT) ou óleo de peixe (OP) e/ou quimioterápico. Material e métodos: Células mononucleares do plasma de homens saudáveis com idade de 20 a 30 anos, foram obtidas e separadas em 12 grupos experimentais para avaliação da capacidade proliferativa (Alamar Blue®) em presença de óleo de peixe (OP) ou óleo de fígado de tubarão (OFT) (complexados com soro fetal bovino), associados ou não ao quimioterápico (Qt), com estímulo do mitógeno concanavalina A (ConA). Apoptose e necrose celular também foram avaliadas após 72 horas de incubação por citometria de fluxo, e a presença de AGPI n-3 no sobrenadante das células foi avaliada por HPLC. Os dados foram submetidos à análise de variância de uma via (ANOVA), seguida de pós-teste de Tukey, nível de significância p < 0,05. Resultados e discussão: Resultados obtidos com AlamarBlue® revelaram que linfócitos tratados com quimioterápico associado com OP ou OFT demonstraram maior viabilidade celular do que os submetidos apenas ao quimioterápico. As células tratadas com Qt1+OFT mantiveram-se 54%, 42% e 36% mais viáveis que as células tratadas apenas com quimioterápico, em 24, 48, e 72h, respectivamente. As tratadas com Qt1+OP apresentaram resultado ainda mais pronunciado, com aumento da viabilidade de 64%, 69% e 74% em 24, 48 e 72h, respectivamente. As células tratadas com Qt3+OFT mantiveram-se 38% e 45% mais viáveis que as células tratadas apenas com quimioterápico, em 24 e 72h, respectivamente. As tratadas com Qt3+OP apresentaram resultado ainda mais significativo, com aumento da viabilidade de 52%, 64% e 68% em 24, 48 e 72h, respectivamente. Por citometria foi possível observar que OP e OFT, após 72h de cultivo, associados ou não a Qt, foram capazes de reverter efeito pró-necrótico do quimioterápico em maior concentração. Os resultados obtidos por HPLC sugerem presença de efeito dependente e independente de incorporação dos ácidos graxos n-3 na membrana celular. Conclusão: OFT e OP foram capazes de se contrapor ao efeito do quimioterápico nas condições estudadas, sendo o efeito do OP mais pronunciado. Palavras-chave: Óleo de peixe, óleo de fígado de tubarão, quimioterapia, linfócitos. / Abstract: Introduction: Chemotherapy used in the treatment of malignant neoplasms promotes leukopenia, which may lead to treatment suspension until immunity improves. Although there are many studies that show the immunomodulatory role of some lipids, little is known about the mechanism. Objectives: To evaluate the viability / proliferative capacity of lymphocytes after the incubation period in the presence of shark liver oil (SLO) or fish oil (FO) and/ or chemotherapy. Material and methods: Plasma mononuclear cells from healthy men aged from 20 to 30 years were collected and separated into 12 experimental groups for the evaluation of proliferative capacity (Alamar Blue®) in the presence of fish oil (FO) or shark liver oil (SLO) (complexed with fetal bovine serum - FBS), associated or not to chemotherapy (Ct), stimulated by mitogen concanavalin A (ConA). Apoptosis and cell necrosis were also evaluated after 72 hours of incubation by flow cytometry and presence of n-3 PUFA in the cell supernatant by HPLC. For the statistical test, data were submitted to One-Way ANOVA, followed by Tukey post-test, significance level p<0.05. Results and discussion: Results obtained with AlamarBlue® revealed that lymphocytes treated with OP or OFT chemotherapy showed greater cell viability than those submitted to chemotherapy alone. Cells treated with Ch1 + SLO remained 54%, 42% and 36% more viable than cells treated with chemotherapy alone at 24, 48, and 72h, respectively. Those treated with Ch1 + FO presented an even more significant result, with a viability increase of 64%, 69% and 74% at 24, 48 and 72h, respectively. Cells treated with Ch3 + SLO remained 38% and 45% more viable than cells treated with chemotherapy alone, at 24 and 72h, respectively. Those treated with Ch3 + FO presented an even more significant result, with a viability increase of 52%, 64% and 68% at 24, 48 and 72h, respectively. By cytometry it was possible to observe that FO and SLO, after 72h of culture, associated or not to Ch, were able to revert pro-necrotic effect of the chemotherapeutic in higher concentration. The results obtained by HPLC suggest the presence of a dependent and independent effect of n-3 fatty acids incorporation into the cell membrane. Conclusion: SLO and FO were able to reverse chemotherapy effect under the investigated conditions, with the effect of OP being more pronounced. Keywords: Fish oil, Shark liver oil, chemotherapy, lymphocytes.
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Fas-l promueve muerte celular en células linfoides vía liberación de ATP y activación de receptores p2x7

Aguirre Ducler, Adam Jesús January 2011 (has links)
Entre los receptores de muerte celular, se describe al receptor Fas en células linfoides como un receptor que activa tanto apoptosis como necrosis. Recientemente se ha asociado la inducción de apoptosis con la salida de ATP vía hemicanales formados por panexina-1 en linfocitos. Por otra parte, muchas evidencias señalan al ATP extracelular como mediador de muerte celular, tanto por necrosis como por apoptosis, identificándose al receptor purinérgico P2X7 como receptor de muerte, el que tiene como único ligando biológico al ATP. En este contexto, en esta Tesis, se determinó que las células A20 (derivadas de linfocitos B de ratón) y Jurkat (derivadas de linfocitos T humanos), pero no Ramos, Raji (derivadas de linfocitos B humanos) y A20R (derivadas de linfocitos B de ratón) son sensibles a FasL. En células Jurkat el tipo de muerte celular que predominó fue la apoptosis, en cambio en A20 fue la necrosis. Solo las células Jurkat liberaron ATP en forma significativa de manera tiempo dependiente en respuesta a estimulación con FasL y no se obtuvo evidencia de daño en la membrana plasmática. En estas células la liberación de ATP fue inhibida por zVAD (inhibidor general de caspasas) y z-IETD (inhibidor de caspasa 8), pero no por zDEVD (inhibidor de caspasa 3). Además, la pre-incubación con inhibidores de hemicanales formados por panexinas (carbenoxolona y probenecid), pero no de hemicanales formados por conexinas (heptanol) también inhibió la liberación de ATP en respuesta a FasL. Por otra parte, en las células Jurkat los inhibidores de los receptores P2X7, oATP y BBG, inhibieron la muerte celular por apoptosis, en cambio los inhibidores de esfingomielinasas (miriocina, imipramina y GW4869) no protegieron a estas células al estimularlas con FasL. En células A20, oATP y el inhibidor de esfingomielinasa neutra (GW4869) mostraron un efecto protector al inhibir la muerte por necrosis inducida por FasL. Además, se apreció un efecto protector en la muerte por apoptosis al pre-tratar estas células con suramina. En ambos tipos celulares el tratamiento con N-acetilcisteína bloqueó la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) inducidas por FasL. Estos resultados representan la primera evidencia de que se produce una cooperación entre dos receptores de muerte celular, Fas y P2X7, en la ejecución de la muerte celular en células linfoides. Frente al mismo estímulo en células A20 y Jurkat, el tipo de muerte celular y los mecanismos involucrados son en parte distintos. En células A20, FasL gatilla muerte celular por necrosis, que podría involucrar la participación de otros receptores P2X distintos a P2X7. En cambio, en las células Jurkat la activación del receptor Fas por FasL lleva, por una parte a la activación de caspasa-8 y posteriormente, a la activación de la caspasa-3. Por otro lado, la liberación de ATP activada por caspasa-8 sería mediada por hemicanales formados por panexina-1. Esto a su vez llevaría a la activación del receptor P2X7, que gatillaría la muerte celular por apoptosis en un mecanismo que podría involucrar la participación de ROS. Esto es un hallazgo importante, ya que en las células Jurkat, que son células tipo II, además de tBID, liberan ATP vía hemicanales formados por panexina-1 lo que también contribuiría a la amplificación de la vía intrínseca de la apoptosis mediante la activación del receptor P2X7.
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Mayores niveles de linfocitos TCD4+CCR7+ en periodontitis y su potencial implicancia en la formación de tejido linfoide ectópico periodonta

Rojas Pérez, Carolina Isabel January 2017 (has links)
Trabajo de Investigación Requisito para optar al Título de Cirujano Dentista / Las periodontitis son un conjunto de patologías inflamatorias crónicas que se desencadenan en respuesta a la disbiosis polimicrobiana generada por bacterias periodonto-patógenas residentes en la bio-película sub-gingival. En este contexto, la formación de un denso infiltrado inmuno-inflamatorio en los tejidos periodontales, compuesto por una amplia variedad de leucocitos, citoquinas, quimioquinas proinflamatorias y factores ósteo-destructivos, resulta en la destrucción de los tejidos de soporte de los dientes. El receptor de quimioquinas homeostático CCR7 y sus ligandos desempeñan un rol clave en la migración de linfocitos y células dendríticas hacia los órganos linfoides secundarios, regulando el proceso de presentación antigénica. En otras enfermedades inflamatorias crónicas, se ha demostrado que la expresión ectópica de CCR7 altera la ubicación de los infiltrados de células inmunitarias, promoviendo la migración, activación y diferenciación de células naïve en la periferia, induciendo la formación de agregados linfoides ectópicos. Sin embargo, el rol de CCR7 en etiopatogenia de la periodontitis no ha sido aun completamente dilucidado. El objetivo de este estudio fue establecer la frecuencia de linfocitos T CD4+CCR7+ infiltrantes en tejidos periodontales de pacientes afectados de periodontitis crónica y sujetos sanos. A partir de biopsias gingivales obtenidas de pacientes afectados de periodontitis y sujetos sanos, se obtuvieron células totales en suspensión mediante digestión enzimática. La expresión de los marcadores CD4, CD25α, CD45RA, CD45RO, RORC2, Foxp3, T-bet y CCR7 fue analizada mediante citometría de flujo. Además, los marcadores CD4 y CCR7 fueron inmunolocalizados en los tejidos periodontales mediante inmuno-fluorescencia. Se detectó un mayor porcentaje de linfocitos T CD4+CD25α-CD45RA+CCR7+ (naïve), CD4+CD25α-CD45RO+CCR7 (memoria) y CD4+CD25+RORC2+CCR7 (Th17) en pacientes afectados de periodontitis en comparación con los sujetos sanos. En conclusión, existe un aumento en la frecuencia de linfocitos T naïve, de memoria y Th17 CCR7+ en los tejidos periodontales de sujetos afectados de periodontitis, lo que sugiere el posible rol quimiotáctico de CCR7 en la formación del infiltrado inflamatorio y de agrupaciones linfoides ectópicas durante la periodontitis. / Adscrito a Proyecto de FONDECYT regular 1140904.

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