Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T11:26:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 276691.pdf: 1483324 bytes, checksum: b4f538164d553239d6fa75c6a1ac46f6 (MD5) / As lipases são enzimas altamente versáteis que catalisam reações químicas com diversos substratos em diferentes condições e possuem características tanto bioquímicas quanto estruturais que lhes conferem resistência e termotolerância, além de serem empregadas em vários bioprocessos industriais como na produção de alimentos e biocombustíveis. A lipase de S. xylosus (AF208229) foi recentemente isolada e inicialmente caracterizada por nosso grupo de pesquisa e colaboradores. Essa proteína possui uma alta homologia e identidade estrutural com diversas outras lipases da família I.5, e apresenta atividade enzimática sobre p-nitrofenil-ésteres. Apesar de ser considerada uma enzima moderadamente termoestável e ter atividade enzimática sobre diferentes ésteres, o mecanismo de ação catalítica ainda permanece desconhecido, e principalmente, os mecanismos estruturais envolvidos em sua estabilização térmica nunca foram descritos. O objetivo deste trabalho foi caracterizar bioquimicamente a lipase recombinante AF208229 de S. xylosus recentemente clonada e expressa heterologamente, e investigar os possíveis mecanismos envolvidos em sua termotolerância por meio de análises de espectroscopia de dicroísmo circular (DC). Nesse trabalho a lipase de S. xylosus (AF208229) foi expressa e purificada, submetida a ensaios enzimáticos em três temperaturas (25°C, 37°C e 42°C), e três pH (7,0 8,0 e 9,0), sua especificidade catalítica foi analisada utilizando-se diferentes p-nitrofenil-ésteres como substratos (de 2 a 18 carbonos) e sua termoestabilidade foi acompanhada durante 10, 20 e 30 minutos em 95°C. Para as análises espectroscópicas, a enzima foi submetida a um tratamento de remoção de íons (produzindo-se a apo enzima) e sua atividade enzimática e sua termotolerância foram reavaliadas. Por fim o espectro de dicroísmo circular (DC) da apo e da holo_enzima foram analisados em diferentes condições. Os resultados obtidos apresentam pela primeira vez o perfil estrutural e os mecanismos de estabilidade 8 térmica dessa lipase. O perfil de DC da holo_enzima foi avaliado nas mesmas temperaturas descritas para os ensaios enzimáticos, bem como sua capacidade de re-enovelamento. O perfil de DC e a capacidade de re-enovelamento também foram observados para a apo_enzima. O efeito dos cofatores metálicos Zn2+ e Ca2+ foram avaliados nos ensaios enzimáticos da apo_enzima, na sua termotolerância, no seu perfil de DC e na sua capacidade de re-enovelamento. Observou-se que a holo_enzima apresenta sua maior atividade em pH 9,0 e 42°C, que tem preferência por substratos de cadeias curtas (pNP-acetato, 2 carbonos) e que retem 77% de sua atividade enzimática após 10 minutos de tratamento térmico (95°C). A holo_enzima é capaz de se re-enovelar, readquirindo sua conformação estruturalmente estável e ativa. A apo_enzima também é capaz de se re-enovelar após o tratamento térmico, porém perde quase totalmente sua atividade. Observou-se que na presença do íon Zn2+ a apo_enzima se re-enovelou e reteve sua atividade enzimática. Com base nesses resultados poderia afirmar-se que a lipase de S. xylosus (AF208229) é uma metaloenzima dependente de zinco e que esse íon possivelmente localizado em um motivo estrutural rico em -hélices próximo ao ativo site. / Lipases are highly versatile enzymes, which catalyze many chemical reactions with different substrates in different conditions. These enzymes have particular biochemical and structural characteristiscs which promote stability and thermal resistance. Besides, they are used by industries, i.e: food technology, detergents and biofuels. S. xylosus lipase (AF208229) was recently isolated and characterized by our group. This enzyme shares a high homology with other lipases among I.5 lipases family and has activity on p-nitrophenyl esters. Although considered a moderated thermostable lipase, its catalytic function remains unclear and its structural mechanisms for thermal stabilization have never been described. This work assessed the enzymatic activity of the recombinant lipase from S. xylosus in three different temperatures (25°C, 37°C and 42°C) and pH (7.0, 8.0 and 9.0), and the thermostability (incubation at 95°C for 10, 20 and 30 minutes). In order to investigate the mechanism involved in enzymatic activation, the enzyme was submitted to an ion removal treatment (to obtain an apo_- enzyme) and its activity and themotolerance were evaluated in the presence and absence of Zn2+ and Ca2+. The structural profile of apo-_enzyme and holo_enzyme were assessed by circular dichroism (CD) at different conditions in the presence an in the absence of metal cofactors as: Zn2+ and Ca2+. These results represent the first insights on S. xylosus lipases secondary structure and its mechanism for thermal stabilization. S. xylosus lipase (AF208229) was more active in pH 9.0, 42°C with specificity for short-chain substrates (pNP-acetate C2). In addition, this enzyme was able to maintain 77% of its activity after a thermal treatment (95°C for 10 min) and to refold to its stable conformation. apo_enzyme showed the same ability to refold as seen to holo_enzyme, but was not able to keep its activity after thermal treatment, which indicate the need of metal for its activity stabilization. Interesting, in the presence of Zn2+ the apo_enzyme was able to acquire a more stable conformation after thermal treatment and still keep residual activity. 10 These results propose that S. xylosus lipase (AF208229) is a metalloenzyme which uses Zn2+ as its metal coordinating, and the Zn2+ is possibly located in a-helical rich motif close to the active site.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química / Made available in DSpace on 2012-10-23T06:25:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 262003.pdf: 2404218 bytes, checksum: f15d8f2351fbcef3c1108a77b1203b3d (MD5) / Este trabalho teve como objetivo principal estudar a imobilização de lipase comercial (Lipozyme CALB L) em esferas de quitosana funcionalizadas com várias concentrações de glutaraldeído e avaliar a melhor concentração para posterior imobilização. Constatou-se que a concentração de 3% (v/v) foi a que proporcionou a enzima maior estabilidade e conferiu a mesma maior atividade residual. A atividade enzimática da CALB L também foi determinada em vários valores de pH (3,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0 e 10,0) e de temperaturas (30 a 100oC), onde foi possível observar que o melhor pH foi o valor de pH 9,0 tanto para a CALB L imobilizada covalentemente em esferas de quitosana e de Novozym 435 imobilizada em resina macroporosa. A temperatura que conferiu a CALB L e Novozym 435 maior atividade enzimática foi a de 90oC. A segunda etapa do trabalho envolveu o uso das enzimas caracterizadas na transesterificação enzimática do óleo de mamona comercial com álcool etílico 95oGL, onde foram realizados ensaios em que se avaliaram a reação com razão molar de 3:1 (álcool etílico: óleo de mamona), com 3% de enzima imobilizada, sem a presença de solvente orgânico, obtendo-se valores de conversão de ésteres etílicos superiores a 90%. Dessa forma, foi possível verificar que existe a viabilidade do uso de enzimas imobilizadas na produção de biodiesel de mamona sem o uso de solventes orgânicos derivados do petróleo. This work had as main objective to study the commercial immobilization of lipase (Lipozyme CALB L) in spheres of chitosan with different glutaraldehyde concentrations and evaluate the best concentration for posterior immobilization. The results suggested that the concentration of 3% (v/v) was the one that afforded the highest enzyme stability and also conferred greater residual activity. The enzymatic activity of CALB L was also determined in different pH values (3.0; 5.0; 6.0; 7.0; 8.0; 9.0 and 10.0) and temperatures (30 to 100oC), where was observed that the best pH value was 9.0, both for immobilized CALB L with crosslinking in chitosan spheres and immobilized Novozym 435 in macroporous resin. The temperature that conferred both CALB L and Novozym 435 the greater enzymatic activity was 100oC. The second phase of the work involved the use of enzymes characterized at the enzymatic transesterification of the commercial castor oil with ethylic alcohol 95oGL, where the assays had been carried out evaluating the reaction with molar ratio of 3:1 (alcohol: castor oil), with 3% of immobilized enzyme, at the absence of the organic solvent, obtaining values of ethylic esters conversion up to 90%. In this way, it was possible to verify the viability for the use of immobilized enzyme in the production of biodiesel from castor oil without the use of organic solvents derived from petroleum.

Lipases (triacilglicerol acilhidrolases, EC 3.1.1.3) são serino hidrolases de considerável relevância fisiológica e potencial uso industrial. O fungo filamentoso Metarhizium anisopliae é um dos mais importantes e bem estudados agente biológico para o controle de muitos artrópodes-praga incluindo o carrapato bovino Boophilus microplus. Lipases secretadas por M. anisopliae podem estar potencialmente envolvidas no processo de infecção do hospedeiro, porém, estudos sobre estas enzimas vêm sendo negligenciados em fungos. Neste trabalho, desenvolvemos uma estratégia simples objetivando detectar e quantificar a atividade de lipase durante a infecção de B. microplus por M. anisopliae. Além disso, estudamos os efeitos de diferentes fontes de carbono, incluindo componentes do tegumento do hospedeiro, na secreção de lipases por M. anisopliae em sobrenadantes de cultura. Apresentamos, também, a purificação parcial de uma lipase secretada em cultura líquida de M. anisopliae. A atividade de lipase aumentou de 0,03 U para 0,207 ± 0,021 U e de 0,033 ± 0,002 U para 0,358 ± 0,05 U durante a infecção (6 a 96 horas) em carrapatos vivos e mortos, respectivamente, infectados por M. anisopliae. Em culturas líquidas observamos altos níveis de atividade lipolítica principalmente em culturas suplementadas com quitina mais lipídeo animal. Nos zimogramas a atividade de lipase foi detectada em carrapatos infectados mortos e vivos em todos tempos testados como também em todos sobrenadantes de cultura analisados. A purificação parcial foi realizada com dois passos cromatográficos incluindo uma cromatografia de troca aniônica que apresentou somente um pico de atividade no gradiente salino. Esperamos que os resultados apresentados neste trabalho contribuam para elucidar a função desempenhada pelas lipases no processo de infecção do hospedeiro de M. anisopliae. / Lipases (triacylglycerol acylhydrolases, EC 3.1.1.3) are serine hydrolases of considerable physiological significance and industrial potential. The filamentous fungus Metarhizium anisopliae is one of the most important and best-studied biological agent for control of many arthropod pests including the cattle tick Boophilus microplus. Lipases secreted by M. anisopliae could potentially be involved in the host infection process but studies about these enzymes have been neglected mainly in fungi. In this work, we developed a simple strategy aiming to detect and quantify lipase activity during B. microplus infection by M. anisopliae. Moreover, we studied the effects of different carbon sources, including components of the tegument of host, on lipase secretion by M. anisopliae in culture supernatants. We presented, also, a partial purification of secreted lipolytic enzyme in M. anisopliae liquid culture. Lipase activity increases from 0.03 ± 0 U to 0.207 ± 0.021 U and from 0.033 ± 0.002 U to 0.358 ± 0.05 U during infection (6 to 96 hours) in live and dead ticks, respectively, infected by M. anisopliae. In liquid cultures we observed high levels of lipolytic activity mainly in cultures supplemented of chitin plus animal lipid. In zymograms, lipase activity was detected in infected dead and live ticks in all times tested as well as in all analyzed liquid culture supernatants. A partial purification was achieved with two chromatographic steps including an anionic exchange chromatography that presents only one peak of lipase activity in the saline gradient. We hope that results presented in this work contributes to elucidate the role played by lipases in M. anisopliae host infection process.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2018-01-30T03:18:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 349700.pdf: 1368390 bytes, checksum: 766a8792c9f1f48a9a9749afda021df5 (MD5) Previous issue date: 2017 / Visando atender ao compromisso firmando no Tratado de Quioto, o governo brasileiro iniciou o Programa Nacional de Produção e Uso de Biodiesel. Para atender ao aumento na demanda deste combustível a produção aumentou em mais de dez vezes nos últimos 10 anos. A principal fonte oleaginosa é o óleo de soja. Para manter a competitividade do setor, outras matérias-primas têm sido avaliadas Entre elas, as residuais, por apresentarem menor custo. O processamento de resíduos apresenta desafio devido a impossibilidade do emprego de processos convencionais já consolidados no mercado. Visando preencher esta importante lacuna, este trabalho avaliou a hidroesterificação enzimática da borra de soja com uso de lipases provenientes do fungo Thermomyces lanuginosus. Os testes foram realizados em duas etapas sequenciais: iniciando pela hidrólise da matéria-prima bruta seguida da esterificação dos ácidos graxos, ambas em reator tipo batelada. Na etapa de hidrólise a melhor condição encontrada, com maior produção de ácidos graxos livres, foi com o emprego de proporção mássica de água e borra de 0,25:1, teor de 0,2% (m/m borra) de catalisador enzimático NS-40116 (Novozymes®), agitação de 450 rpm e 45 ºC, obtendo-se uma acidez final média de 25,47 ± 3,24% de desvio padrão. Sem a purificação da massa resultante da hidrólise, esta foi submetida a esterificação em reator de batelada e verificou-se a redução média da acidez em 72,85 ± 3,09%, confirmando a capacidade da enzima em hidrolisar matéria graxa e esterificar os ácidos graxos livres formados, apresentando assim uma opção para se produzir ésteres de ácidos graxos a partir de uma matéria-prima residual com o uso de processo enzimático. / Abstract : Aiming to attend to the commitment established in the Kyoto Protocol, Brazilian government established the National Program for the Production and Use of Biodiesel. To attend the increase in demand for this fuel, the production has improved more than tenfold in the last 10 years. The main oil source is soybean oil. In order to maintain the competitiveness of the sector, other raw materials have been evaluated. Among them, the residual ones, because they present a lower cost. Waste processing presents challenges due to the impossibility of using conventional processes already consolidated in the market. In order to fill this important gap, this work evaluated the enzymatic hydro esterification of soybean soap stock with the use of lipases from the fungus Thermomyces lanuginosus. The tests were carried out in two sequential stages: starting with the crude soap stock hydrolysis followed by esterification of the fatty acids, both in a batch reactor. In the hydrolysis step, the best free fatty acid production was obtained using a water and soap stock weight ratio of 0.250:1, 0.2% (w/w) of the enzyme NS-40116 (Novozymes®), agitation of 450 rpm and 45 °C, obtaining an average final acidity of 25.47 ± 3.24%. Without any purification of hydrolyzed soap stock, it was submitted to esterification in a batch reactor. The mean acid reduction was found to be 72.85 ± 3.09%, confirming the enzyme's ability to hydrolyze grease matter and to esterify the free fatty acids, thus presenting an option to produce esters of fatty acids from a residual raw material using an enzymatic process.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos, 2014. / Made available in DSpace on 2015-02-05T21:04:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 331967.pdf: 2546491 bytes, checksum: ae5dd718aed5b91d7ae9d46cf8925bf7 (MD5) Previous issue date: 2014 / Lipase B de Candida antarctica (CalB) apresenta um papel importante na indústria química e de alimentos. A imobilização desta enzima em um suporte inerte, de baixo custo, que aumente sua estabilidade em diferentes condições de processo, e que permita sua reutilização aparece como uma alternativa aos métodos de imobilização já existentes. Com o objetivo de selecionar o melhor método de interação entre a espuma de poliuretano e a lipase B de Candida antarctica (CalB) para aplicação na síntese do éster geranil propionato, diferentes métodos de imobilização foram estudados: adsorção ao suporte (PU-ADS), incorporação ao suporte (PU), ligação covalente utilizando revestimento por polietilenoimina (PU-PEI), ligação covalente utilizando revestimento por polietilenoimina e tratamento com glutaraldeído (PU-PEI-GA). A espuma utilizada como suporte foi produzida com tolueno diisocianato e poliol poliéter (5:3). A caracterização dos derivados enzimáticos imobilizados foi realizada por densidade aparente, microscopia eletrônica de varredura e análise de Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (EITF). A atividade enzimática foi medida por hidrólise utilizando p-NPP (p-nitro-fenil-palmitato) como substrato. A enzima livre e os preparados enzimáticos foram avaliados em diferentes pHs (5,0; 7,0 e 9,0) por 24 h, e nas temperaturas de 25, 40, 60 e 80 ºC por 48 h, e os parâmetros cinéticos (Km e Vmáx) foram avaliados. O derivado com mais alta atividade foi obtida com a imobilização pelo método PU (5,52 U/g). Os métodos que se destacaram em relação às estabilidades e aos parâmetros cinéticos foram o PU e PU-ADS. Os derivados obtidos por estes métodos de imobilização foram avaliados durante 60 dias de incubação e na aplicação na síntese do geranil propionato. Foram obtidas10conversões de 83,5% para PU e 95,9% para PU-ADS, em 24 horas de reação, utilizando óleo de citronela e ácido propiônico como substratos.<br> / Abstract : Lipase B from Candida antarctica (CalB) has an important role in chemical and food industry. The immobilization of the enzyme on an inert support, low cost, to increase its stability under different process conditions, and allows their reuse is an alternative to existing methods of immobilization. With the aim of selecting the best method to interact polyurethane foam and Candida antarctica lipase B (CalB) to application in the synthesis of geranyl propionate, different methods of Calb immobilization were studied: adsorption (PU-ADS), covalent (using polyethyleneimine) (PU-PEI), ionic exchange (with polyethyleneimine and glutaraldehyde) (PU-PEI-GA) and entrapment (PU). PU foam as support was synthesized using toluene diisocyanate and polyether in a molar ratio 5:3. The characterization of immobilized enzyme derivatives was performed by apparent density, Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR). The enzymatic activity was measured by hydrolysis of p-NPP as substrate. The free enzyme and enzyme preparations were evaluated at different pHs (5.0, 7.0 and 9.0) during 24 h and at temperatures of 25, 40, 60 and 80 °C during 48 h, the kinetic parameters (Km and Vmáx) were evaluated. The highest enzyme activity was obtained in PU (5.52 U/g) method. The methods that stood out compared the stabilities and kinetic parameters were the PU and PU-ADS, so these were evaluated during 60 days of storage and application in the synthesis of geranyl propionate. Conversions of 83.5% and 95.9% for PU and PU-ADS were obtained, at 24h reaction, using citronella oil and propionic acid as substrates.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas, Programa de Pós-Graduação em Química, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2015-09-15T04:09:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 334385.pdf: 3188222 bytes, checksum: 0dff536d3b2ab608fc0930a80ab7d5f1 (MD5) Previous issue date: 2015 / Neste trabalho, as lipases comerciais LSD, LAY, LAK, LM, LCR, e as nativas de A. niger bruta e LRO, foram imobilizadas em filmes de amido de milho, na presença ou ausência de dextrana. Além destas lipases, também foram utilizadas a CALB e a RM-IM, que são adquiridas imobilizadas.Estes sistemas, foram utilizados na resolução enantiosseletiva da (±)2-etilhexilamina (58) e do (±)-mentol (64) na presença de acetato de etila ou vinila e propionato de vinila com agentes acilantes. Também foi realizada a acilação régiosseletiva do 2-aminoetanol (62) com acetato de vinila.Testes para a resolução de 58 foram realizados utilizando acetato de etila e diversas lipases em razões molares diferentes. Além disto, n-hexano foi combinado aos LIs [BMIm][BF4] e [BMIm][PF6]. Os melhores resultados obtidos foram de conversão, eep e E obtidos foram de 42,5 %, 28,8 % e 2,4, respectivamente, ao usar a LBC imobilizada em filme de amido de milho/dextrana, razão molar 1:2 (amina:acetato) e n-hexano puro como solvente.A acilação régiosseletiva de 62 foi realizada com acetato de vinila utilizando a CALB. Os dados obtidos entre os tempos de 0-20 h, mostraram que a reação não foi seletiva, e além do método escolhido para quantificação (EM) não ser o mais adequado, não foi possível a diferenciação entre 2 dos 3 possíveis produtos formados na reação.Na resolução enantiosseletiva do (±)-mentol com o acetato de vinila para a obtenção do acetato de mentila (73), entre as lipases testadas, a LAY foi a mais adequada. A reação foi otimizada em 35 ºC, 40 mg de LAY e razão molar 1:2 (álcool:acetato de vinila). Nessas condições, obtiveram-se valores de conversão, ees, eep, e E de 33,6 %, 50,3 %, >99 %, e >200, respectivamente. O solvente mais adequado dentre os testados foi o tolueno e a utilização de mistura entre tolueno e LIs ([BMIm][BF4],[BMIm][Cl], [BMIm][PF6], [BMIm][SCN] e [BMIm][Br]) não demostrou melhora na seletividade da reação. Dentre os amidos e suportes testados para a imobilização da LAY, o filme de amido de milho foi o mais adequado. Este foi usado por 4 vezes, com tempo de estocagem de 71 dias, sendo que 73 foi obtido com conversão, ees, eep, e E de 7,5 %, 8,2 %, >99 %, e >200, respectivamente.Na resolução de 64 com propionato de vinila, a lipase mais adequada, entre as testadas foi a LCR. Porém, após imobilização ocorreu uma grande perda na enantiosseletividade da lipase, e a reação apresentouvalores de conversão, ees, eep, e E de 30,3 %, 25,9 %, 59,5 %, e 5,1, respectivamente, em 48 h. Mesmo tendo otimizado a temperatura (45 °C), massa da LCR (50 mg) e razão molar dos reagentes (1:10), esta reação apresentou E<15, o que é considerado inadequado em uma resolução enzimática.Salienta-se que o uso de enzimas, e em especial as lipases, é de interesse na obtenção de compostos enantiomericamente puros. Porém, para cada substrato, as condições reacionais devem ser cuidadosamente analisadas.<br> / Abstract : In this work, the commercial lipases BCL, SDL AYL, AKL, ML, CRL, native from A.niger and ROL were immobilized in starch films in the presence or absence of dextran. In addition to these enzymes, CALB and the RM-IM, lipases acquired immobilized, were also usedThese systems were used in the enantioselective resolution of (±)-2-ethylhexylamine (58) and (±)-menthol (64) with vinyl and ethyl acetate or vinyl propionate, as acylating agents. The regioselective acylation of 2-aminoethanol (62) with vinyl acetate, was also performedSeveral tests were realized for the resolution of 58 with ethyl acetate and various lipases using different molar ratio. Besides, n-hexane was used in mixture with ILs [BMIm] [BF4] or [BMIm] [PF6]. The highest degree of conversion (42.5 %), eep (28.8 %) and E (2.4) were obtained using BCL immobilized in corn starch film/dextran, a molar ratio of 1:2 (amine: ethyl acetate) and pure hexane as solvent.The regioselective acylation of 62 was performed with vinyl acetate and CALB. The obtained data (0-20 h), showed that the reaction was not selective. In addition, the method chosen for the products measurements (MS) was not the most suitable and it was not possible to differentiate between the two of the three possible products formed in the reaction.In the enantioselective resolution of (±)-menthol with vinyl acetate for the preparation of menthyl acetate (73), AYL was the most appropriate lipase. The reaction was optimized in 35 °C, 40 mg of AYL and a molar ratio of 1:2 (alcohol:vinyl acetate). Under these conditions, the values of conversion degree, ees, eep and E were of 33.6 %, 50.3 %, >99 %, and >200, respectively. The results showed that the reaction was more efficient using pure toluene, and the use of toluene and ILs [BMIm][BF4], [BMIm][CI], [BMIm][PF6], [BMIm][SCN] and [BMIm][Br] mixtures did not present an improvement in the reaction selectivity.When starches from different sources or other supports were used for AYL immobilization, the best tested system was corn starch film. This system was used 4 times during 71 days of storage, and 73 was obtained with conversion degree, ees, eep, and E of 7.5 %, 8.2 %, >99 % and >200.In the resolution of (±)-menthol with vinyl propionate, the most suitable lipase, among the tested, for the preparation of menthyl propionate (75) was CRL. However, after immobilization a great loss in the lipase enantioselectivity was observed and the reaction presentedconversion degree, ees, eep, and E values of 30.3 %, 25.9 %, 59.5 %, and 5.1, respectively, in 48 h. Even after the optimization of the reaction conditions, such as temperature (45 °C), mass of CRL (50 mg) and molar ratio of reagents (1:10), this reaction presented E<15, which is considered inappropriate for an enzymatic resolution.It is worth of mentioning that the use of enzymes, in particular lipases, is of interest to obtain enantiomerically pure compounds. However, for each substrate, the reaction conditions must be carefully analyzed.

CAVALCANTE. K . F. Estudo da imobilização de lipase de rhizomucor miehei em organo-gel para aplicação em síntese orgânica. 2014. 82 f. Dissertação (Mestrado em Engenharia Química) - Centro de Tecnologia, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014. / Submitted by Marlene Sousa (mmarlene@ufc.br) on 2015-02-25T17:23:06Z No. of bitstreams: 1 2014_dis_kfcavalcante.pdf: 1665911 bytes, checksum: 4373f300779af75be7201f806c4ccdbc (MD5) / Approved for entry into archive by Marlene Sousa(mmarlene@ufc.br) on 2015-02-26T14:51:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_dis_kfcavalcante.pdf: 1665911 bytes, checksum: 4373f300779af75be7201f806c4ccdbc (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-26T14:51:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_dis_kfcavalcante.pdf: 1665911 bytes, checksum: 4373f300779af75be7201f806c4ccdbc (MD5) Previous issue date: 2014-02-17 / Lipases, triacylglycerol ester hydrolases EC 3.1.1.3, are enzymes that act on ester bonds of triacylglycerols, releasing organic acids and glycerol. May in microaquosas conditions, catalyze the reverse reaction. A limitation of using these enzymes in industrial processes is the lack of operational stability and the inability to re-use the free form. The use of organo-gels system is an alternative for the immobilization of enzymes and to their use in enzyme catalysis in organic media. In this system the enzyme is located in the micelle center (aqueous center) of the organo-gel, eliminating problems such as stabilizing the enzyme against inactivation by a non-aqueous solvent. The aim of this work was immobilize lipases from Rhizomucor miehei into organo - gels based on polymers for future application in ethyl esters synthesis through esterification of raw materials with high free fatty acids content. Supports were obtained using different combinations of components. It was used gelatin polymers (Gel), alginate (Alg) and / or chitosan (Chi), organic phases such as hexane (Hex) and heptane (Hep) and surfactants sodium dodecyl sulfate (SDS) or acetylmetylamonium bromide (CTABr). In the first step, derivatives were produced with and without glutaraldehyde 2% (v/v) activation. Enzymatic activity was measured by hydrolysis of p – nitrophenyl butyrate (PNPb). Biocatalysts were characterized as: stability at 60 ° C and compared to free enzyme, immobilization efficiency and yield factor, thus determining the best biocatalysts. Among the catalysts obtained, (Gel/SDS/Hex) showed the best efficiency of 4.1% , 30 –fold more stable; (Alg/SDS/Hep) with 6.0% efficiency , 1.3 –fold more stable and (Qui/SDS/Hep) with efficiency of 1.0 % , 1.3 –fold more stable than free lipase. Obtained supports activated with glutaraldehyde 2 % (v/v) showed lower activities and efficiencies, in despite of having good values for stability factor. Produced derivatives using surfactant CTABr presented low activity, efficiency and stability factor. In the second step, derivatives were analyzed as maximum load (50 U.g-1 a 500 U.g-1) enzyme immobilization and efficiency at 15 ° C and 25 ° C. It was evaluated biocatalysts application in ethyl oleate achievement in an esterification reaction, using oleic acid and ethanol, by varying molar ratio acid / alcohol with and without using of desiccant agent (zeolite) at 37 ° C and 24 h of reaction. Derivatives were submitted storage stability under 10 ° C studies, for a period of 100 days. All derivatives showed higher efficiencies using an initial enzyme loading of 50 U.g -1, with values of 4.2% and 4.8% (Gel/SDS/Hex), 2.0 % and 2.3 % (Alg/SDS/ Hep) and 0.9 % to 1.1% (Qui/SDS/Hep) at 15 ° C and 25 ° C, respectively. In esterification reactions, Gel/SDS/Hex and Alg/SDS/Hep derivatives showed higher conversions 72.9 % and 16.9 %, respectively, with molar acid / alcohol 1:10. The chemical derivative Qui/SDS/Hep presented 80.0 % conversion with molar acid / alcohol 1:1 ratio. Using zeolites, Gel/SDS/Hex conversion increased to 79.0 % using ratios of 1:1 and 1:5, the Alg/SDS/Hep and Qui/SDS/Hep presented a decreasing in conversions. During 100 days of storage at 10 ° C, Gel/SDS/Hex and Qui/SDS/Hep hydrolytic activity maintained up to 40 days and a decreasing during this period, however, Alg/SDS/ Hep achieved more than 60 days with activity. / Lipases, triacilglicerol éster hidrolases E.C. 3.1.1.3, são enzi¬mas que atuam nas ligações ésteres de triacilgliceróis, liberando ácidos orgânicos e glicerol. Podendo, em condições microaquosas, catalisar a reação reversa. Uma limitação da utilização destas enzimas em processos industriais reside na falta de estabilidade operacional e na impossibilidade de sua reutilização na forma livre. O uso do sistema de organo-géis consiste em uma alternativa para a imobilização de enzimas, e para sua utilização na catálise enzimática em meio orgânico. Neste sistema a enzima está localizada no centro micelar (centro aquoso) do organo-gel, eliminando o problemas como de estabilizar a enzima contra inativação por um solvente não-aquoso. O objetivo deste trabalho foi desenvolver derivados de lipases de Rhizomucor miehei imobilizadas em organo-géis à base de polímeros, visando à síntese de ésteres etílicos a partir de reações de esterificação de matérias-primas com elevado teor de ácidos graxos livres. Os suportes foram obtidos através de diferentes combinações entre os componentes. Utilizaram-se polímeros gelatina (Gel), alginato (Alg) ou quitosana (Qui), fases orgânicas hexano (Hex) ou heptano (Hep) e os tensoativos dodecilsulfato de sódio (SDS) ou brometo de acetilmetilamônio (CTABr). Verificou-se a estabilidade térmica da enzima na sua forma livre, determinando seu tempo de meia-vida. Na primeira etapa, foram produzidos derivados com e sem ativação via glutaraldeído 2% (v/v). A atividade enzimática foi avaliada através hidrólise do p-nitrofenilbutirato (pNPB). Os derivados foram caracterizados quanto: fator de estabilidade a 60°C em relação à enzima livre, eficiência e rendimento de imobilização para assim determinar os melhores biocatalisadores. Dentre os catalisadores obtidos, os melhores apresentaram eficiência de 4,1% e fator de estabilidade 30 vezes (Gel/SDS/Hex), eficiência de 6,0% e fator de estabilidade 1,3 vezes (Alg/SDS/Hep) e eficiência de 1,0% e fator de estabilidade de 2,3 vezes (Qui/SDS/Hep). Os suportes produzidos ativados com glutaraldeído 2% (v/v) apresentaram baixas atividades e eficiências, apesar de obterem valores bons de tempo de meia-vida e fator de estabilidade. Os derivados produzidos com o tensoativo CTABr apresentaram baixas atividades, eficiências, tempo de meia-vida e fator de estabilidade. Na segunda fase, os derivados selecionados foram estudados quanto à carga máxima (50 U.g-1 a 500 U.g-1) de imobilização e eficiência, nas temperaturas de 15°C e 25°C. Avaliou-se a aplicação dos biocatalisadores na reação de esterificação do oleato de etila a partir de ácido oleico e etanol, variando a razão molar ácido/álcool e utilização de agente dessecante (zeólitas). Verificou-se a estabilidade de estocagem sob 10°C por um período de 100 dias. Todos os derivados apresentaram melhores eficiências utilizando carga de 50 U.g-1, apresentando valores de 4,2% e 4,8% (Gel/SDS/Hex), 2,0% e 2,3% (Alg/SDS/Hep) e 0,9% e 1,1% (Qui/SDS/Hep ) nas temperaturas de 15°C e 25°C, respectivamente. Nas reações de esterificação os derivados Gel/SDS/Hex e Alg/SDS/Hep obtiveram maiores conversões na razão molar ácido/álcool 1:10, 72,9% e 16,9%, respectivamente. O derivado Qui/SDS/Hep obteve 80,0% de conversão na razão de 1:1. Com utilização de zeólitas o derivado Gel/SDS/Hex aumentou a conversão para 79,0% nas razões 1:1 e 1:5, os derivados Alg/SDS/Hep e Qui/SDS/Hep apresentaram decréscimo nas conversões. Durante os 100 dias de estocagem sob 10°C, os derivados Gel/SDS/Hex e Qui/SDS/Hep mantiveram atividade hidrolítica até 40 dias, tendo um decréscimo ao longo do tempo. O derivado Alg/SDS/Hep obteve um tempo maior de 60 dias, apresentando também um decréscimo.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-06-27T04:17:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 346681.pdf: 2052007 bytes, checksum: f14b99ddf4617f7615ddb3e18ba7b387 (MD5) Previous issue date: 2017 / Lipases de Thermomyces lanuginosus apresentam um papel importante na indústria química e de alimentos. A lipase NS-40116 é uma nova lipase produzida a partir de Thermomyces lanuginosus, e será lançada no mercado com baixo custo em relação às lipases já comercializadas. A imobilização desta enzima em um suporte inerte, de baixo custo, que aumente sua estabilidade em diferentes condições de processo, e que permita sua reutilização, aparece como uma alternativa aos métodos de imobilização já existentes. Com o objetivo de conhecer o melhor método de interação entre partículas de poliestireno e a lipase NS-40116, diferentes métodos de imobilização foram estudados: adsorção ao suporte, retenção física em matriz, e ligação covalente pelo tratamento das partículas com glutaraldeído. Foram empregados dois métodos de polimerização para a produção do suporte. Na polimerização por suspensão em pérola foram utilizados estireno, polivinilpirrolidona e Trigonox® 141 como iniciador. O outro método foi a polimerização em emulsão através de estireno, álcool polivinílico, divinil benzeno, Span 80 e Trigonox® 141 como iniciador. O derivado com melhor atividade (7,96 U/g) foi obtido pela imobilização por adsorção ao suporte (partículas obtidas da polimerização em emulsão). A retenção física em matriz através da polimerização em suspensão resultou num derivado com atividade de 2,87 U/g, sendo que esta enzima foi escolhida para as posteriores caracterizações e aplicações, devido ao seu tamanho, que facilitou sua recuperação na síntese de ésteres metílicos a partir de gordura abdominal de frango. A caracterização das superfícies do suporte e da enzima imobilizada foi realizada por microscopia eletrônica de varredura. Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (EITF) também foi realizada para caracterizar a enzima livre, o suporte e enzima imobilizada. A atividade enzimática foi medida por hidrólise utilizando p-NPP (p-nitrofenil palmitato) como substrato. A enzima livre e o derivado enzimático imobilizado foram avaliados por 2 h em diferentes pHs (2,1, 3, 3,43, 4,75, 7, 8, 9, 10, 11 e 12), temperaturas (30, 40, 50, 60, 65 e 75 ºC), e solventes (metanol, etanol, hexano e propanol). Os parâmetros cinéticos das duas enzimas (Km e Vmax) foram obtidos através do sistema gráfico de Lineweaver & Burk. Para a estabilidade ao armazenamento, as enzimas foram monitoradas por 106 dias em temperatura ambiente, e 122 dias sob refrigeração (6 ºC). O derivado imobilizado foi eficazmente utilizado na produção de ácidos graxos livres a partir do óleo de soja, bem como apresentou potencial de aplicação em reações de transesterificação e esterificação utilizando gordura abdominal de frango como substrato. Na hidrólise do óleo de soja, o derivado demonstrou estabilidade operacional após cinco ciclos de uso.<br> / Abstract : Lipases B from Thermomyces lanuginosus has an important role in chemical and food industry. The lipase NS-40116 is a novel lipase produced from Thermomyces lanuginosus, and it will be launch in the market with low cost in relation to lipases already commercialized. The immobilization of the enzyme on an inert support, low cost, to increase its stability under different process conditions, and allows their reuse is an alternative to existing methods of immobilization. With the aim of knowing the best method to interact polystyrene particles and lipase NS-40116, different methods of immobilization were studied: support adsorption, entrapment and covalent bond by treating the particles with glutaraldehyde. Two polymerization methods were used for the production of the support. In the pearl suspension polymerization were used styrene, polyvinylpyrrolidone and Trigonox® 141 was used as the initiator. The other method was emulsion polymerization through styrene, polyvinyl alcohol, divinyl benzene, Span 80 and Trigonox® 141 as the initiator. The highest enzyme activity (7.96 U/g) was obtained in support adsorption method. The entrapment through suspension polymerization resulted in a derivative with activity of 2.87 U/g, and this enzyme was chosen for the later characterizations and applications, due to its size, than facilitated its recovery in the synthesis of methyl esters from chicken abdominal fat. The characterization of the surfaces of the support and immobilized enzyme was performed by scanning electron microscopy. Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) was also performed to characterize the free enzyme, the support and immobilized enzyme. The enzymatic activity was measured by hydrolysis of p-NPP (4-nitrophenyl palmitate) as substrate. The free enzyme and immobilized enzyme derivative were evaluated during 2 h at different pHs (2.1, 3, 3.43, 4.75, 7, 8, 9, 10, 11 and 12), temperatures (30, 40, 50, 60, 65 and 75 ºC), and solvents (methanol, ethanol, hexane and propanol). The kinetic parameters of the two enzymes (Km and Vmax) were obtained through the Lineweaver & Burk graph system. For storage stability, the enzymes were monitored for 106 days at room temperature, and 122 days under refrigeration (6 °C). The immobilized derivative was effectively used in the production of free fatty acids from soybean oil, and also showed application potential in transesterification and esterification reactions using chicken abdominal fat as substrate. In the hydrolysis of soybean oil, the derivative demonstrated operational stability after five cycles of use.

Na indústria coureira há uma grande preocupação com o meio ambiente, já que a maioria das etapas para o processamento do couro são realizadas através de processos químicos. Estes processos devem ser controlados para um baixo impacto ambiental e menor custo de tratamento de resíduos. Este trabalho visa desenvolver um extrato enzimático completamente biodegradável, constituído por lipases de microrganismos, para diminuir o uso de tensoativos nos curtumes. Para tal foi necessário o uso de microrganismos que produzem lipases de maneira eficiente para substratos específicos com a variação no espectro de temperatura e pH utilizados nos processos de processamento do couro. Portanto, foi realizado o isolamento de diversos microrganismos em um curtume e estes foram submetidos à análise da produção de lipases induzida por gordura animal. A partir destes isolados foram selecionados e identificados os melhores produtores de lipases: Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Pichia pastoris e Proteus sp. Dentre estes microrganismos, o mais promissor, foi a levedura P. pastoris. A produção de lipases é afetada por diferentes fatores ambientais, assim foram testados, em escala piloto, a influência do tempo de cultivo, pH, temperatura de cultivo e agitação. Além disso, também foram testados o uso de goma arábica e três diferentes surfactantes no cultivo para o possível aumento da produção da enzima. As melhores condições de crescimento para uma maior produção de lipase por P. pastoris foram otimizadas em 72 h, 28ºC, pH 8,0 e 200 rpm. A adição de Triton X-100 ao final do cultivo também aumentou a atividade de lipase. A partir destes resultados a levedura foi submetida ao cultivo em reator de 10 L e determinados o melhor tempo de cultivo, o consumo de glicose e a densidade óptica a 600 nm. O melhor tempo de cultivo manteve-se em 72 h. Ao final deste cultivo, o extrato bruto foi utilizado para determinar a estabilidade da enzima à formulação empregada nos processos de curtimento, já que as condições destes processos podem afetar a atividade de algumas enzimas. A enzima não se mostrou estável aos químicos utilizados no processamento de couros. Por isto, para testar a eficácia da enzima em relação aos produtos encontrados no mercado algumas etapas foram reformuladas para que a enzima pudesse manter a sua atividade original. Os resultados destes experimentos mostraram-se satisfatórios, provando que a produção e utilização desta enzima no mercado é promissora. / The tanning industry has a great concern with the environment, since the majority of stages for leather processing is carried out using chemicals. These processes must be controlled for a low ambient impact and lesser cost of residues treatment. This work aims to develop a completely biodegrading enzymatic extract consisting of microbial lipases, to diminish the use of surfactants in the tanneries. For this product production is necessary the use of efficient microorganisms producing lipases for specific substrates with the variation in the specter of temperature and pH used in the tannery. Therefore, the screening of diverse microorganisms in a tannery was carried out and these had been submitted to the analysis of the induced lipases production with animal fat. It had been selected and identified the best lipases producers: Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Pichia pastoris and Proteus sp. Among these microorganisms, the most promising was P. pastoris. The lipase production is affected by different ambiental factors, thus it was tested, in scale pilot, the influence of the growth time, pH, growth temperature and agitation. Moreover, also the use of arabic gum and three different surfactants in the culture for the possible increase of the enzyme production was tested. The best growth conditions for the best lipase production of P. pastoris are 72 h, 28ºC, pH 8.0 and 200 rpm. The addition of Triton X-100 in the cultivation end also increases the lipase activity. Through these results the yeast was grown in 10 L culture reactor. During this cultivation the best growth time, the glucose consumption and the optical density at 600 nm were determined. The best growth time remained in 72 h. This culture crude extract was used to determine the enzyme stability to the formulation used in the tanning processes, since the conditions of these processes may affect enzyme activity. The enzyme was not stable in the presence of these chemicals. To compare the enzyme effectiveness with the chemicals and commercial enzymes, some processing stages were improved, so that the enzyme could keep its original activity. These results were satisfactory, suggesting that this enzyme production and its commercial use are promising.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-02-23T04:01:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 337591.pdf: 3853649 bytes, checksum: 518e5d14891a79b8585dfef831bf5e7f (MD5) Previous issue date: 2015 / Materiais superparamagnéticos encapsulados em matriz polimérica são interessantes em diversos tipos de aplicações, incluindo áreas biomédicas, processos de separação, biotecnologia e imobilização de enzimas. Neste trabalho, nanopartículas superparamagnéticas de poli(ureia-uretano), PUU, foram obtidas via polimerização interfacial em miniemulsão e utilizadas como suporte na imobilização da lipase B de Candida antarctica. Nanopartículas de magnetita com comportamento superparamagnético foram obtidas pelo método de co-precipitação e, após a síntese, as nanopartículas magnéticas, NPMs, foram recobertas com ácido oleico, AO, para a obtenção de uma superfície hidrofóbica. A síntese de nanopartículas de PUU foi conduzida utilizando 1,6-hexanodiol como poliol e diisocinato de isoforona, IPDI, como diisocianato. As NPMs-AO foram incorporadas em PUU durante a polimerização interfacial em miniemulsão. Nanopartículas de PUU com NPMs-AO incorporadas foram caracterizadas por Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier, (FTIR), análise termogravimétrica, (TGA), magnetometria de amostra vibrante, (MAV), microscopia eletrônica de transmissão, (MET), e microscopia eletrônica de varredura, (MEV-FEG). Os resultados mostraram alta eficiência de encapsulação e as análises de MAV confirmaram que NPMs-AO apresentam comportamento superparamagnético após a encapsulação. Lipase B de Candida antarctica foi imobilizada nas nanopartículas poliméricas magnéticas de PUU, (NPMs PUU), em uma única etapa durante a polimerização interfacial em miniemulsão e o derivado atraído por um campo magnético externo foi utilizado como catalisador em reações de síntese de etil oleato, geranil oleato e geranil propionato. O teor de ácidos graxos livres nas amostras, medido pelo método de titulação, mostrou que conversões em ésteres acima de 85% foram obtidas para todos os sistemas estudados. A análise de microscopia óptica de fluorescência mostrou a presença de lipase na superfície das NPMs-PUU, confirmando a formação de ligação entre enzima-suporte. Em um segundo método de imobilização, lipase B de Candida antarctica foi imobilizada em NPMs PUU em duas etapas após a polimerização interfacial em miniemulsão, com as partículas liofilizadas. O processo foi realizado pelo contato da enzima com o suporte em tampão fosfato pH 7,6, a solução foi incubada em shaker a 30 °C a 150 rpm e a atividade de esterificação enzimática foi medida. Atividades relativas acima de 85% em relação à enzima livre foram obtidas em uma hora deimobilização com concentração de enzima de 0,55 mg/mL. Análises de FTIR, MEV-FEG, estabilidade térmica (40, 60 e 80 °C), estabilidade ao pH (4, 7 e 10) e estabilidade ao armazenamento mostraram a eficiência de imobilização da lipase por adsorção em NPMs PUU, que apresentou estabilidade em diferentes condições reacionais.<br> / Abstract : Superparamagnetic materials encapsulated in a polymeric matrix are interesting for several applications, including biomedical, separation process, biotechnology and enzyme immobilization. In this work, superparamagnetic poly(urea-urethane), PUU, nanoparticles were obtained by interfacial miniemulsion polymerization and used as a support for the immobilization of lipase B from Candida antarctica (CALB). Magnetite nanoparticles presenting superparamagnetic behavior were obtained by the co-precipitation method and after the synthesis the magnetic nanoparticles, MNPs, were coated with oleic acid, OA, to provide a hydrophobic surface. The synthesis of PUU nanoparticles was performed using 1,6-hexanediol as polyol and isophorone diisocyanate, IPDI, as diisocyanate. The MNPs-OA were incorporated during the interfacial miniemulsion polymerization. PUU with MNPs-OA were characterized by Fourier transform infrared spectroscopy, (FTIR), thermogravimetric analysis, (TGA), electromagnetic vibrating sample magnetometry, (VSM), transmission electron microscopy, (TEM), and scanning electron microscopy, (SEM-FEG). Results showed a high encapsulation efficiency and VSM analysis showed that PUU with MNPs-OA still presented superparamagnetic behavior after the encapsulation step. CALB was immobilized on magnetic poly(urea-urethane) nanoparticles, (MNPs PUU) in a single step during the interfacial miniemulsion polymerization. After the immobilization process, the immobilized enzyme was attracted by an external magnetic field and was used as a catalyst in the synthesis of ethyl oleate, geranyl propionate and geranyl oleate. Ester conversions above 85% were obtained for all systems based on the free fatty acids contents measured by titration. Fluorescence microscopy images confirmed the immobilization of enzyme onto MNPs-PUU. CALB was immobilized on MNPs PUU in two steps after the interfacial polymerization in miniemulsion. Lipase was added to lyophilized particles (MNPs PUU) in phosphate buffer (0.1 M, pH 7.6). The mixture was incubated at 30 °C in a shaker for 30-360 min to determine the time required for maximum immobilization efficiency and the enzyme activity was determined by the esterification reactions between lauric acid and propanol. The relative activities of the immobilized enzyme in relation to free enzyme were above 85% in one hour with 0.55 mg/mL of enzyme in solution. FTIR analysis, SEM-FEG, thermal stability (40, 60 and 80 °C), pH stability (4, 7 e 10) and storagestability showed the efficiency of the method, that allowed to maintain high stability of the immobilized enzyme under different conditions.