Biodiesel é um biocombustível que consiste na mistura de ésteres monoalquílicos de ácidos graxos de cadeia longa. O processo usual de produção deste combustível é a transesterificação de óleos vegetais com álcoois de cadeia curta. Nesse processo, a matéria prima deve conter baixo conteúdo de ácido graxos livres ( ≤ 1%) e água (≤ 0,5%). Como alternativa ao processo de transesterificação, destaca-se o emprego de matérias-primas de baixo custo, com elevado teor de ácidos graxos livres, para a síntese de ésteres alquílicos através de reações de esterificação. As reações de produção do biodiesel podem ser catalisadas por via química (ácida e básica) ou enzimática. Na catálise enzimática, os biocatalisadores empregados são as lipases, que catalisam a hidrólise e síntese de ésteres e podem ser obtidas a partir de microrganismos, plantas ou tecido animal, sendo as de origem microbiana as mais utilizadas. O objetivo principal deste trabalho foi avaliar o potencial da lipase de Yarrowia lipolytica, uma levedura não convencional, na síntese de ésteres do ácido oleico visando à obtenção de ésteres alquílicos (biodiesel). Foram estudados os efeitos da temperatura (25, 30, 35, 40, 50 e 60oC), do teor enzimático (5, 10, 20, 30 e 40% v/v) e do tipo de álcool (metanol, etanol, n-propanol e n-butanol ) nas reações de esterificação do ácido oleico empregando o extrato enzimático líquido produzido por Yarrowia lipolytica. Os resultados obtidos mostraram que as reações conduzidas a 30oC e com 10% v/v do extrato enzimático apresentaram maior taxa inicial de reação. Também foi avaliada a utilização do extrato enzimático liofilizado (5% m/v) e do PES (produto enzimático sólido) (5% m/v) de Yarrowia lipolytica na reação de esterificação do ácido oleico com n-butanol a 30oC. O maior consumo de ácido oleico ocorreu na reação conduzida com o PES. O efeito da temperatura (25, 30, 35, 40 e 50oC) na síntese de oleato de butila foi, então, investigado nas reações empregando PES como biocatalisador e a maior conversão de ácido oleico foi verificada na temperatura de 40oC / Biodiesel is a biofuel which consists in a mix of monoalkylesters from long chain fatty acids. The usual method of producing this fuel is transesterification of vegetable oils with lower alcohols. In this process, the raw material should have a low content of free fatty acid (≤ 1%) and water(≤ 0.5%). As an alternative to the transesterification process stands out the use of low cost raw materials with high content of free fatty acids for the synthesis of alkyl esters through esterification reactions. Reactions for biodiesel production can be catalyzed chemically (acid and basic) or enzymatic. In enzymatic catalysis biocatalysts employed are lipases which are enzymes that catalyze hydrolysis and ester synthesis and can be obtained from microorganisms, plants and animal tissue and the most widely used is from microbial origin. The main objective of this study was to evaluate the potential of Yarrowia lipolyticas lipase a non-conventional yeast on the synthesis of esters of oleic acid in order to obtain alkyl esters (biodiesel). Effects of temperature (25, 30, 35, 40, 50 and 60oC) enzyme content (5, 10, 20, 30 and 40% v/v) and type of alcohol (methanol, ethanol, n-propanol and n-butanol) were studied in the esterification reactions of oleic acid employing enzymatic liquid produced by Yarrowia lipolytica. The results demonstrated that reactions conducted at 30oC and with 10% v/v of the enzyme extract showed higher initial reaction rate and higher conversion of oleic acid for all alcohols studied. Use of lyophilized enzyme extract (5%w/v) and SEP(solid enzymatic product) (5% w/v) from Yarrowia lipolytica was also evaluated in the esterification reaction of oleic acid with n-butanol at 30oC. The higher consumption of oleic acid has occurred in the reaction conducted with SEP. The effect of temperature (25, 30, 35, 40 and 50oC) in the synthesis of butyloleate was then investigated in reactions employing SEP as biocatalyst, and the higher conversion of oleic acid was observed at 40oC

Made available in DSpace on 2015-04-01T14:16:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Arquivototal.pdf: 2215115 bytes, checksum: 40dd5f4fb946f6f9e74f8da93471a174 (MD5) Previous issue date: 2012-02-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The lipases and biosurfactants produced by microorganisms are involved in the metabolism of oil substrates and they receive great biotechnological interest. In this work the production of lipases and biosurfactants by bacteria isolated from soil used for discard of the residual vegetable oil was analyzed. The 66 strains tested demonstrated lipolytic activity on the tributirine agar. In the rhodamine B agar medium with olive oil or soy oil, the number of lipolytic strains varied from 31,8% to 37,8%, depending on the substrate and medium pH. Lipolytic activity of the 25 positive strains in the rhodamine B agar with olive oil, analyzed by titrimetric method varied from 0.62 U/mL/min to 12.4 U/mL/min. The most active strain in the lipases production, identified as the species belonging to the Burkholderia cepacia complex by 16S rRNA gene sequencing analysis, was submitted to the Surface Respond Methodology analysis to determine the optimal conditions of pH and temperature. The Burkholderia sp. O19 strain showed high lipolytic activity in wide range of pH and temperature, and the highest activity was predicted for pH and temperature above 8.5 and 65oC. All of the bacterial strains showed to produce biosurfactants in at least one of the three analyzed methods. The test of dispersion of the diesel oil allowed the biosurfactants detection in all of the strains, while the oil emulsification and hemolytic activity were observed in 73% and 59% of the strains, respectively. The soil used for the disposal of vegetable oil proved conducive to prospecting of lipolytic microorganisms and producers biosurfactants. / As lipases e os biossurfactantes produzidos por microrganismos estão envolvidos no metabolismo de substratos oleosos e despertam grande interesse biotecnológico. Neste trabalho foi analisada a produção de lipases e biossurfactantes por bactérias isoladas de um solo utilizado para descarte do óleo vegetal residual. As 66 linhagens isoladas demonstraram atividade lipolítica quando incubadas no meio ágar tributirina. No meio contendo ágar rodamina B, com azeite de oliva ou óleo de soja, o número de linhagens lipolíticas variou de 31,8% a 37,8%, dependendo do substrato e do pH do meio. Atividade lipolítica das 25 linhagens positivas no ágar rodamina B com azeite de oliva, avaliada pelo método titulométrico, variou de 0,62 U/mL/min a 12,4 U/mL/min. A linhagem mais ativa na produção de lipases foi identificada, com o seqüenciamento do gene 16S rRNA, como espécie do complexo Burkholderia cepacia, e submetida à análise da Metodologia de Superfície de Resposta, para determinar as condições ótimas de pH e temperatura. A linhagem Burkholderia sp. O19 apresentou alta atividade lipolítica em ampla faixa de pH e temperatura, sendo que a maior atividade foi prevista para pH e temperatura superiores a 8,5 e 65oC. Todas as linhagens demonstraram produzir biossurfactantes com pelo menos um dos três métodos avaliados. O teste de dispersão do óleo diesel permitiu a detecção de biossurfactantes em todas as linhagens, enquanto a emulsificação e atividade hemolítica foram observadas em 73% e 59% das linhagens, respectivamente. O solo usado para o descarte de óleo vegetal mostrou-se propício à prospecção de microrganismos lipolíticos e produtores de biossurfactantes.

Biodiesel é um biocombustível que consiste na mistura de ésteres monoalquílicos de ácidos graxos de cadeia longa. O processo usual de produção deste combustível é a transesterificação de óleos vegetais com álcoois de cadeia curta. Nesse processo, a matéria prima deve conter baixo conteúdo de ácido graxos livres ( ≤ 1%) e água (≤ 0,5%). Como alternativa ao processo de transesterificação, destaca-se o emprego de matérias-primas de baixo custo, com elevado teor de ácidos graxos livres, para a síntese de ésteres alquílicos através de reações de esterificação. As reações de produção do biodiesel podem ser catalisadas por via química (ácida e básica) ou enzimática. Na catálise enzimática, os biocatalisadores empregados são as lipases, que catalisam a hidrólise e síntese de ésteres e podem ser obtidas a partir de microrganismos, plantas ou tecido animal, sendo as de origem microbiana as mais utilizadas. O objetivo principal deste trabalho foi avaliar o potencial da lipase de Yarrowia lipolytica, uma levedura não convencional, na síntese de ésteres do ácido oleico visando à obtenção de ésteres alquílicos (biodiesel). Foram estudados os efeitos da temperatura (25, 30, 35, 40, 50 e 60oC), do teor enzimático (5, 10, 20, 30 e 40% v/v) e do tipo de álcool (metanol, etanol, n-propanol e n-butanol ) nas reações de esterificação do ácido oleico empregando o extrato enzimático líquido produzido por Yarrowia lipolytica. Os resultados obtidos mostraram que as reações conduzidas a 30oC e com 10% v/v do extrato enzimático apresentaram maior taxa inicial de reação. Também foi avaliada a utilização do extrato enzimático liofilizado (5% m/v) e do PES (produto enzimático sólido) (5% m/v) de Yarrowia lipolytica na reação de esterificação do ácido oleico com n-butanol a 30oC. O maior consumo de ácido oleico ocorreu na reação conduzida com o PES. O efeito da temperatura (25, 30, 35, 40 e 50oC) na síntese de oleato de butila foi, então, investigado nas reações empregando PES como biocatalisador e a maior conversão de ácido oleico foi verificada na temperatura de 40oC / Biodiesel is a biofuel which consists in a mix of monoalkylesters from long chain fatty acids. The usual method of producing this fuel is transesterification of vegetable oils with lower alcohols. In this process, the raw material should have a low content of free fatty acid (≤ 1%) and water(≤ 0.5%). As an alternative to the transesterification process stands out the use of low cost raw materials with high content of free fatty acids for the synthesis of alkyl esters through esterification reactions. Reactions for biodiesel production can be catalyzed chemically (acid and basic) or enzymatic. In enzymatic catalysis biocatalysts employed are lipases which are enzymes that catalyze hydrolysis and ester synthesis and can be obtained from microorganisms, plants and animal tissue and the most widely used is from microbial origin. The main objective of this study was to evaluate the potential of Yarrowia lipolyticas lipase a non-conventional yeast on the synthesis of esters of oleic acid in order to obtain alkyl esters (biodiesel). Effects of temperature (25, 30, 35, 40, 50 and 60oC) enzyme content (5, 10, 20, 30 and 40% v/v) and type of alcohol (methanol, ethanol, n-propanol and n-butanol) were studied in the esterification reactions of oleic acid employing enzymatic liquid produced by Yarrowia lipolytica. The results demonstrated that reactions conducted at 30oC and with 10% v/v of the enzyme extract showed higher initial reaction rate and higher conversion of oleic acid for all alcohols studied. Use of lyophilized enzyme extract (5%w/v) and SEP(solid enzymatic product) (5% w/v) from Yarrowia lipolytica was also evaluated in the esterification reaction of oleic acid with n-butanol at 30oC. The higher consumption of oleic acid has occurred in the reaction conducted with SEP. The effect of temperature (25, 30, 35, 40 and 50oC) in the synthesis of butyloleate was then investigated in reactions employing SEP as biocatalyst, and the higher conversion of oleic acid was observed at 40oC

FundaÃÃo de Amparo à Pesquisa do Estado do Cearà / Lipases (glycerol ester hydrolases, EC3.1.1.3) are versatile catalysts with broad and diverse possibilities of industrial applications. Its main application is essentially catalyze the hydrolysis of triglycerides. However, in micro-aqueous environments these enzymes have the ability to catalyze the reverse reaction of esterification. These enzymes do not require cofactors, have relatively low cost, are regioespecific, enantioselectives and may act on a broad range of temperature and pH. This work aimed to develop alternative technologies using enzymatic routes mediated by lipase from Rhizomucor miehei (RmL) immobilized on chitosan support in the presence of some classes of surfactants for the production of methyl butyrate and ethyl butyrate, two esters widely used in cosmetic and food industries. In this study two immobilization strategies were evaluated. In the first, the enzymes were immobilized in the presence of selected surfactants on chitosan supports previously activated with glutaraldehyde. In the second immobilization strategy, chitosan was crosslinked with glutaraldehyde after prior adsorption of the enzymes in the presence of surfactants. Among the immobilization procedures studied, the best results were achived when the enzyme was immobilized onto chitosan support in the presence of the surfactant sodium dodecyl sulphate SDS (0.23% m v-1) for 1 h at 4  C and 220 rpm, followed by crosslinking with 0.6% glutaraldehyde (v v-1) for 1 h at 25  C. In esterification experiments conducted with the best derivative, a detailed study of the parameters that affect the reaction rates were performed. The best yields were obtained when the reactions were conducted at 25  C, 6h and 150 rpm using n-heptane as a solvent. For methyl butyrate maximum esterification yield was 89% and for ethyl butyrate the maximum conversion observed was 92%. The results were comparable to yields observed when the esterification reactions were carried out with the commercial enzyme Lipozyme and the soluble enzyme under the same reaction conditions. / Lipases (glicerol Ãster hidrolases, E.C.3.1.1.3) sÃo catalisadores versÃteis com amplas e diversificadas possibilidades de aplicaÃÃo industrial. Sua principal aplicaÃÃo à essencialmente catalisar a hidrÃlise de triglicerÃdeos. Entretanto, em ambientes micro-aquosos estas enzimas possuem a habilidade de catalisar a reaÃÃo reversa de esterificaÃÃo. Estas enzimas nÃo requerem cofatores, possuem custo relativamente baixo, sÃo regioespecÃficas, enantiosseletivas, alÃm de atuarem em uma larga faixa de temperatura e pH. Neste contexto, este trabalho teve por objetivo desenvolver tecnologias alternativas utilizando rotas enzimÃticas mediadas por lipase de Rhizomucor miehei (RmL) imobilizada em suporte quitosana na presenÃa de algumas classes de surfactantes para a produÃÃo de butirato de metila e butirato de etila, dois Ãsteres amplamente utilizados na indÃstria de cosmÃticos e de alimentos. Neste estudo, duas estratÃgias de imobilizaÃÃo foram avaliadas. Na primeira, a enzima foi imobilizada na presenÃa dos surfactantes selecionados em suporte quitosana previamente reticulado com glutaraldeÃdo. Na segunda estratÃgia de imobilizaÃÃo, o suporte utilizado foi reticulado com glutaraldeÃdo apÃs prÃvia adsorÃÃo da enzima na presenÃa dos surfactantes. Dentre os procedimentos de imobilizaÃÃo estudados, os melhores resultados foram obtidos quando a enzima foi previamente adsorvida no suporte quitosana na presenÃa do surfactante dodecil sulfato de sÃdio (0,23% m.v-1) por 1h a 4ÂC e 220 rpm, seguido de reticulaÃÃo com glutaraldeÃdo 0,6% (v.v-1) por 1h a 25ÂC. Nos ensaios de esterificaÃÃo utilizando o melhor derivado obtido, foi efetuado um estudo detalhado dos parÃmetros que afetam as taxas de conversÃo. Os melhores rendimentos foram obtidos quando as reaÃÃes foram conduzidas a 25ÂC, 6h e 150 rpm utilizando n-heptano como solvente. Para o butirato de metila, o rendimento mÃximo de esterificaÃÃo foi de 89% e para o butirato de etila a maior conversÃo observada foi de 92%. Os resultados obtidos foram comparÃveis aos rendimentos de esterificaÃÃo observados quando foi utilizada a enzima comercial Lipozyme nas mesmas condiÃÃes reacionais.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / The present work is divided into three chapters, in which we report the use of lipases to obtain precursors of α-amino acid, derivatives thiamphenicol and chemoenzymatic synthesis of (S)-dapoxetine. The first chapter refers to the use of the lipase from Rhyzomucor miehei, which by means of kinetic resolution of N-acetyl-α-amino esters was possible to obtain derivatives with high values of enantiomeric excesses. The second section aims at obtaining derivatives of thiamphenicol applying the lipase from Candida rugosa for the reaction of hydrolysis of the diacetate thiamphenicol, and Candida antarctica lipase B by acylation process. Finally, the third section reports the chemoenzymatic synthesis of (S)-dapoxetine in the enantiopure form by kinetic resolution process via transesterification reactions of 3-chloro-1-phenylpropan-1-ol, using lipase from Candida rugosa. / O presente trabalho encontra-se dividido em trÃs capÃtulos, na qual relatamos a utilizaÃÃo de lipases para obtenÃÃo de precursores de α-aminoÃcidos, derivados de tianfenicol e a sÃntese quimioenzimÃtica da (S)-dapoxetina. O primeiro capÃtulo refere-se à utilizaÃÃo da lipase a partir de Rhyzomucor miehei, que por meio de uma resoluÃÃo cinÃtica de N-acetil-α-aminoÃsteres foi possÃvel obter derivados com elevados valores de excessos enantiomÃricos. O segundo capÃtulo visa a obtenÃÃo de derivados do tianfenicol aplicando a lipase a partir da Candida rugosa para a reaÃÃo de hidrÃlise do diacetato de tianfenicol, e a lipase B obtida a partir de Candida antarctica por processo de acilaÃÃo. Por fim, o terceiro capÃtulo relata a sÃntese quimioenzimÃtica da (S)-dapoxetina de forma enantiopura por processo de resoluÃÃo cinÃtica via reaÃÃes de transesterificaÃÃo do 3-cloro-1-fenilpropan-1-ol, usando a lipase obtida a partir da Candida rugosa.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Diversos experimentos foram realizados com o objetivo de estudar a reaÃÃo de esterificaÃÃo enzimÃtica do Ãcido olÃico com a frutose em meio etanÃlico, visando a sÃntese de biosurfactantes biodegradÃveis. Para tanto, foi utizada a enzima CÃndida Antartica B na temperatura de 55 ÂC e em tempos de reaÃÃo variando entre 48, 72, 96 e 120 horas. De acordo com os resultados obtidos, constatou-se que a citada enzima catalisou preferencialmente o etanol presente no meio reacional para a formaÃÃo do Ãster oleato de etila. Este fato foi confirmado atravÃs do espectro de ressonÃncia magnÃtica nuclear (1H e 13C), bem como do espectro de infravermelho pela presenÃa de um pico de absorÃÃo em 1738,4 cm-1, caracterÃstico deste Ãster. Os resultados da reaÃÃo de formaÃÃo do oleato de etila indicam que o maior rendimento da reaÃÃo foi observado no tempo de 96 horas e que o tempo de 120 horas o rendimento foi inferior. Os experimentos realizados com o objetivo de se obter Ãsteres de frutose a partir do Ãcido olÃico em meio etanÃlico nÃo lograram Ãxito, apesar da literatura indicar a possibilidade de se realizar esta reaÃÃo em outros meios que utilizam solventes nÃo recomendados para o uso alimentÃcio. O oleato de etila apresenta carÃter lipofÃlico e na indÃstria de alimentos encontra aplicaÃÃo na desidrataÃÃo osmÃtica de tomates e pimentas do tipo âdedo de moÃaâ, facilitando a perda de Ãgua, ganho de aÃÃcar e cor mais luminosa. O uso do oleato de etila no processo de desidrataÃÃo diminui o tempo de secagem, aumenta sua eficiÃncia sem deixar nenhum tipo de resÃduo quÃmico. / Several experiments were done aiming at the study on the enzymatic esterification of the oleic acid with fructose in ethanolic medium, focusing the synthesis of biodegradable biosurfactants. For that purpose, it was utilized the enzyme, Candida antartica B., at temperature of 55 ÂC, in reacting time of 48, 72, 96 e 120 hours. Accordingly to the obtained results it was verified that the related enzyme catalyzed primarily the ethanol present in the reactional medium to form the ester: ethyl oleate. This fact was confirmed through magnetic nuclear resonance spectra (1H and 13C) as well as, through infrared spectrum, by the presence of absorption peak at 1738, 4 cm- 1, characteristic of that ester. The results of the reaction of ethyl oleate production indicate that the highest yield was observed in about 96 hours time, and for the 120 hours time it was observed also an inferior yield. The experiments accomplished for the obtention of fructose esters from oleic acids in ethanolic medium were not successful like in other solvents not recommended for food use. The ethyl oleate shows a lipophilic character and in the food industry it finds application in the osmotic dehydration of tomatoes and peppers âdedo de moÃaâ, improving water release, sugar yield and solar brightness. The use of ethyl oleate in the dehydration process decreases the drying time increases its efficiency without leaving any traces pf chemical residues

Na propriedade rural, onde o leite cru refrigerado fica armazenado até a captação pelo caminhão tanque em coleta a granel, o mesmo é mantido a temperatura de refrigeração entre 1 a 4ºC por longos períodos (até 96 horas), os microrganismos psicrotróficos encontram condições favoráveis para sua multiplicação, produzindo enzimas proteolíticas e lipolíticas termotolerantes, podendo provocar alterações indesejáveis no leite e nos seus derivados. Quando estes microrganismos estão presentes em elevadas populações, pode ser indicativo de baixa qualidade do leite e insatisfatória condições sanitárias para o processamento. Devido a necessidade da melhora da qualidade dos produtos lácteos, objetivou-se a execução desta pesquisa realizando levantamentos sobre o cumprimento dos padrões microbiológicos exigidos pela atual legislação brasileira IN 62 (BRASIL, 2011), pesquisas sobre os microrganismos psicrotróficos, Pseudomonas spp. e produção de enzimas proteolítica e lipolítica por Pseudomonas spp. As coletas foram realizadas em 10 propriedades do Estado de São Paulo na Regional Agrícola do Escritório de Desenvolvimento Rural - EDR Limeira - SP, sendo, 5 propriedades com ordenha manual e 5 propriedades com ordenha mecânica, nos períodos de chuva e seca e em vários pontos durante a obtenção do leite cru refrigerado e também do leite com intervalo de 24 horas até a captação deste leite pelo caminhão. As médias das populações dos microrganismos mesófilos na ordenha manual, foi diferente estatisticamente significativo no leite recém ordenhado (1,52×106 UFC.mL-1) para o leite com 24 horas de armazenamento (2,67×107 UFC.mL-1) no período chuvoso, e na ordenha mecânica, o encontrado foi uma diferença estatisticamente significativa no leite recém ordenhado (3,87×106 UFC.mL-1) para o leite com 24 horas de armazenamento (9,82×108 UFC.mL-1) também no período chuvoso. Nas populações dos microrganismos psicrotróficos, suas médias diferiram estatisticamente na ordenha manual no período da chuva no leite recém ordenhado (1,48×104 UFC.mL-1) para o leite com 48 horas de armazenamento (1,49×105 UFC.mL-1) e na ordenha mecânica, o leite recém ordenhado (8,74×103 UFC.mL-1), com 24 horas de armazenamento (4,33×104 UFC.mL-1) não diferiram entre si e foram diferentes estatisticamente do leite com 48 horas de armazenamento (3,46×105 UFC.mL-1) apresentaram valor elevado, principalmente quando o leite cru refrigerado permanece por longos períodos de armazenamento na propriedade rural, que pode ser um sério fator de comprometimento pela produção de lipases ou proteases principalmente pelas Pseudomonas spp. onde em todos os pontos amostrados foram isolados este microrganismo produzindo enzimas (lipase e/ou protease). A maior porcentagem de atividade lipolítica foi verificada no período seco, já a maior porcentagem de atividade proteolítica foi verificada no período chuvoso. Contudo, deve-se intensificar as medidas de autocontrole para minimizar os efeitos dos microrganismos mesófilos e psicrotróficos sobre a qualidade do leite cru refrigerado e, consequentemente, de seus derivados. / On the farm, where the cold raw milk is stored until the tank truck collects it in bulk, it is kept at refrigeration temperature between 1 and 4°C for extended periods (96 hours), the psychrotrophic microorganisms find favorable conditions for their multiplication, producing proteolytic and lipolytic thermotolerant enzymes, it may cause undesirable changes in milk and its derivatives. When these microorganisms are present in a large population, it can be an indicative of low quality milk and unsatisfactory sanitary conditions for its processing. Due to the need of improving the quality of dairy products, this research was carried out with surveys about fullfilment of microbiological standards required by current Brazilian law IN 62 (BRAZIL, 2011), researches on psychrotrophic microorganisms, Pseudomonas spp. and production of proteolytic and lipolytic enzymes by Pseudomonas spp. Samples were collected in 10 farms in the state of São Paulo in the Regional Agrícola do Escritório de Desenvolvimento Rural - EDR in Limeira - SP, 5 farms with manual milking and 5 farms with mechanical milking; during the rainy and dry periods and in several points during the obtaining of refrigerated raw milk and also milk with a 24-hour-interval before the collection of this milk by the truck. The averages of the mesophilic population in the manual milking were different, statistically significant between the newly expressed milk (1,52×106 UFC.mL-1) and 24 hour-storage milk (2,67×107 UFC.mL-1) in the rainy season, and during mechanical milking, what was found was a statistically significant difference between the newly expressed milk (3,87×106 UFC.mL-1) and 24-hour-storage milk (9,82×108 UFC.mL-1, also in the rainy season. In the populations of psychrotropic microorganisms, the averages statistically differed in manual milking during the period of rain between the newly expressed milk (1,48×104 UFC.mL-1) and 48-hour-storage milk (1,49×105 UFC.mL-1); and during the mechanical milking, newly expressed milk (8,74×103 UFC.mL-1) and 24-hour-storage (4,33×104 UFC.mL-1); were not different and were statistically different from 48-hour-storage milk (3,46×105 UFC.mL-1), they present high value, especially when refrigerated raw milk remains for long storage periods on the farm, which can be a serious impairment factor for the production of lipases and proteases mainly by Pseudomonas spp. where in all the sampling sites these microorganisms were isolated producing enzymes (lipase and/or protease). The highest percentage of lipolytic activity was observed in the dry season; the highest percentage of proteolytic activity was observed during the rainy season. However, the self-control measurementsshould be intensified to minimize the effects of mesophilic and psychrotrophic microorganisms on the quality of refrigerated raw milk and, consequently, its derivatives.

L’agent pathogène responsable de la tuberculose, Mycobacterium tuberculosis, utilise principalement les lipides comme source d’énergie lors du processus infectieux. Cela suggère que les enzymes lipolytiques (ELs) sont des facteurs d’une importance cruciale, qui jouent un rôle essentiel pour la survie et la persistance du bacille au sein des granulomes tuberculeux. Dans ce contexte, nous nous sommes intéressés au rôle physiologique de la protéine LipY (Rv3097c), une TAG-hydrolase apparentée à la lipase Hormono-sensible humaine. En utilisant un modèle expérimental de « foamy » macrophages, nous avons démontré que cette protéine sécrétée par le système de sécrétion ESX-5 était responsable de l’hydrolyse des triacylglycerols (TAG) de l’hôte dans la lumière phagosomale. Dans une seconde étude, nous avons développé un modèle expérimental robuste et réversible basé sur la biodisponibilité en azote et en carbone, deux facteurs essentiels qui gouvernent la formation et l’hydrolyse de TAG sous la forme d’inclusions lipidiques intracytoplasmiques (ILI) chez les mycobactéries. La simplicité d’utilisation de ce modèle s’avère être un excellent système biologique permettant d’étudier les propriétés phénotypiques des bacilles riches en ILI. L’ensemble des résultats obtenus au cours de ces travaux de thèse confirme que certaines ELs sont directement impliquées dans la virulence et/ou la survie des mycobactéries pathogènes. De plus, une très grande partie de ce travail ouvre de nouvelles perspectives sur la caractérisation et l’inhibition d’acteurs protéiques essentiels au métabolisme des lipides in vivo, offrant ainsi de nouvelles opportunités pour lutter contre M. tuberculosis. / Mycobacterium tuberculosis, the pathogenic agent responsible for tuberculosis (TB), mainly uses lipids as a source of energy during the infectious process. This suggests that lipolytic enzymes (LEs) are crucial metabolic agents that play a critical role in the survival and persistence of the bacillus within TB granulomas. In this context, we investigated the physiological role of the LipY protein (Rv3097c), a TAG-hydrolase related to the human Hormono-sensitive lipase. Using an experimental model of "foamy" macrophages, we demonstrated that this protein which is secreted by the ESX-5 secretion system, was responsible for the hydrolysis of host-derived triacylglycerols (TAGs) within the phagosomal compartment. In a second study, we developed a robust and reversible experimental model based on the bioavailability of nitrogen and carbon, two essential factors that govern the formation and hydrolysis of TAGs in the form of intracytoplasmic lipid inclusions (ILI) in mycobacteria. The simplicity of this model proves to be an excellent biological system for studying the phenotypic properties of ILI-rich bacilli. All the results obtained during this thesis confirm that some LEs are directly involved in the virulence and/or survival processes of pathogenic mycobacteria. In addition, we truly believe that this work opens up new perspectives on the characterization and inhibition of protein, that are essential actors for lipid metabolism in vivo, thus offering new opportunities to better control M. tuberculosis.

Neste trabalho realizou-se uma triagem com os fungos de origem marinha Trichoderma sp Gc1, Penicillium miczynskii Gc5, Penicillium raistrickii Ce16 e Aspergilus sydowii Gc12 para catalisar a abertura do (RS)-2-(benziloximetil)oxirano (2). O melhor resultado foi obtido com o fungo Trichoderma sp Gc1, pois forneceu o (R)-(-)-2-(benziloximetil)oxirano (2) com excesso enantiomérico de 60 % e rendimento isolado de 39 %; o diol (S)-(+)-1,2-propanodiol-3-fenilmetóxi (2a) com excesso enantiomérico de 32 % e rendimento de 19 %. Posteriormente otimizou-se as condições experimentais com o epóxido 2 e o fungo Trichoderma sp Gc1, variando-se a massa de biocatalisador, o meio de cultura e o tempo de reação. Os melhores resultados sob essas condições foram aplicadas para os epóxidos 3-5 fornecendo o (S)-(+)-2-[4-metoxifenoxi)metil]oxirano (3a), (S)-(+)-2-(propeniloxi)oriano (4), (R)-(+)-1-alilóxi-2,3-propanodiol (4a) e o (-)-9-deceno-1,2-diol (5a). Nesses estudos embora ocorreu a abertura seletiva dos epóxidos com as células totais do fungo Trichoderma sp Gc1, não obteve-se altas purezas enantioméricas dos produtos. Ainda nesse trabalho realizou-se a síntese das cloroidrinas racêmicas, a (RS)- 1-cloro-2-propanol- 3-fenilmetóxi (2b), (RS)- 1-cloro-2-propanol- 3-(4-metoxifenóxi) (3b) e (RS)- 1-alilóxi-3-cloro-2-propanol (4b) em bons rendimentos e uma metodologia sintética ambientalmente apropriada, pois os compostos foram preparados em meio aquoso na presença de íons cloreto. Em seguida realizou-se uma resolução enzimática da (RS)-1-alilóxi-3-cloro-2-propanol (4b) com a lipase de Candida antarctica onde obteve-se a clorodrina 4a (e.e. 72 %) e o seu correspondente produto acetilado 4c (e.e. 82 %) em bons excessos enantioméricos. Conclui-se que os fungos de origem marinha utilizados neste trabalho são potenciais fontes de epóxido-hidrolases para promover a abertura seletiva de epóxidos. / In this work carried out itself the first study biocatalytic involving reactions of reduction of cetonas with fungi of marine origin. They were utilized 7 cetonas commercial as substratos and 8 fungi derived little seas like biocatalisadores. The fungi were isolated of the sponges little seas Geodia corticostylifera (Trichoderma sp Gc1, Penicillium miczynskii Gc5, Aspergillus sydowii Gc12) and Chelonaplysylla erect (Bionectria sp Ce5, Aspergillus sydowii Ce15, Penicillium raistrickii Ce16 and Aspergillus sydowii Ce19). The reduction 2-chloro-1-phenylethanone (1) was studied under several conditions of reaction (changes of pH, addition or absence of glucose) and the best result was with fungus P. miczynskii Gc5, therefore itself obteve an isolated performance of 60% and excess enantiomeric of 50% for the (S)- 2-chloro-1- phenylethanol (1a). The interesting one in these studies was that all of the fungi utilized in the selection with the 2-chloro-1-phenylethanone (1) presented selectivity anti- Prelog. In the literature is common obtain reduction enzymatic with selectivity Prelog. To 2-bromo-1-phenylethanone (2) was biotransformaded by the fungus A. sydowii Ce19 you correspond composed: (S)-2-bromo-1-phenylethanol (2a), (S)-2-cloro-1- phenylethanol (1a), whereas to (2c), 2-chloro-1-phenylethanone (1) and the 2- phenyloxirane (2b) were obtained by reactions not enzymatic. To 2-bromo-1-(4- bromophenyl)ethanone (3) and to 2-bromo-1-(4-nitrophenyl)ethanone (4) were entirely biodegradadas by the fungus A. sydowii Ce19. The reduction biocatalytic of the 1-(2- iodophenyl)ethanol (5) and 1-(3-iodophenyl)ethanol (6) with the fungus Trichoderma sp Gc1 supplied the 1-(2-iodophenyl)ethanol (5a) and the 1-(3-iodophenyl)ethanol (6a) with excellent excesses enantiomeric (e.e. > 99%). It stayed verified also that the fungi derived little seas for promote the reactions of reduction by biocatalysis are going to be cultivated in water of the artificial sea.

O objetivo deste projeto foi estabelecer um processo de síntese enzimática de biodiesel empregando sebo bovino como matéria-prima lipídica. Para o desenvolvimento deste projeto de mestrado, o trabalho experimental foi direcionado para as seguintes atividades: 1) Determinação das propriedades físico-químicas da matéria-prima; 2) Testes de seleção do derivado imobilizado mais efetivo para mediar a síntese de biodiesel a partir do sebo bovino; 3) Estabelecimento de metodologias para analisar o produto transesterificado por diferentes técnicas; 4) Otimização da síntese de biodiesel por planejamento experimental; 5) Aumento de escala e comprovação do modelo estatístico e 6) Caracterização do produto formado e comparação com o biodiesel comercial. Os resultados das análises de composição da matéria-prima indicaram que a amostra de sebo bovino atende ao padrão exigido para ser utilizado na reação de transesterificação (baixo teor de água e índice de acidez). Para os testes de triagem do biocatalisador, diferentes fontes de lipase (EC 3.1.1.3) foram imobilizadas no suporte híbrido POS-PVA e utilizadas para mediar a reação de transesterificação do sebo bovino e etanol em meio isento de solventes. Todas as reações foram realizadas nas mesmas condições operacionais (temperatura de 45°C, razão molar de 1:9 (gordura/álcool) e 400 unidades de atividade enzimática por grama de sebo bovino). Os rendimentos de transesterificação, bem como os valores de produtividade, foram os parâmetros relevantes na escolha do biocatalisador mais efetivo. Os produtos transesterificados obtidos com rendimentos superiores a 90% foram ainda submetidos a análises complementares, tais como viscosidade cinemática, espectrometria de absorção na região do infravermelho e termogravimetria. O derivado imobilizado selecionado (Pseudomonas cepacia) foi caracterizado quanto às suas propriedades bioquímicas, cinéticas e de estabilidade térmica. Um planejamento experimental foi adotado para determinar a influência do pH e da temperatura na atividade enzimática. Para o estudo da cinética enzimática foram realizados experimentos com diferentes concentrações de substrato (azeite de oliva) visando determinar os parâmetros Km e Vmax na cinética de Michaelis-Menten. Um estudo da estabilidade térmica da lipase livre e imobilizada foi realizado a 60°C para determinar a constante de desativação térmica. Na seqüência, o derivado imobilizado selecionado foi utilizado para otimizar as variáveis do processo (temperatura e razão molar) empregando a metodologia de superfície de resposta, obtendo o seguinte modelo matemático para o rendimento de transesterificação: Y = 86,89-7,46 x1-2,04 x2 em que x1 e x2 são os valores codificados para as variáveis temperatura e razão molar, respectivamente. Com os resultados obtidos, as condições ótimas de reação foram determinadas por software (T= 48ºC e razão molar 1:7 (sebo:etanol)) e então um experimento de comprovação do modelo foi realizado usando uma massa de 110 gramas de meio reacional. Os valores de rendimento da reação apresentaram uma boa correlação com os resultados preditos pelo modelo (91,62% em 8h de reação). Finalmente o produto obtido foi submetido a uma sequência de testes e análises para verificar o potencial do processo enzimático. Os testes indicaram que o processo enzimático é capaz de produzir biodiesel com boa qualidade, apesar de não atender plenamente as normas estabelecidas pela Agência Nacional de Petróleo para uso de combustíveis no país. / The objective of this project was to establish a process for enzymatic synthesis of biodiesel using beef tallow and ethanol as feedstock. For the development of this project, the experimental work was directed to the following activities: 1) Determination of the physicochemical properties of the raw material; 2) Tests for selection of the most eficiente immobilized derivative to mediate the biodiesel synthesis from beef tallow; 3) Methodology establishment for analyzing the product transesterificated by different techniques; 4) Optimization the synthesis of biodiesel by factorial design; 5) Mathematical model comprovation and increase the reaction mass 6) Characterization of the product formed and comparison with the industrial biodiesel. The results of analysis of composition of the raw materials indicated that the sample of beef tallow meets the standard required to be used in the transesterification reaction (low water content and acidity). For screening tests of biocatalysts, different sources of lipase (EC 3.1.1.3) were immobilized on POS-PVA support and used to mediate the transesterification of beef tallow and ethanol in solvent free medium. All reactions were performed under the same operating conditions (temperature of 45°C, molar ratio of 1:9 (fat/ alcohol) and 400 units of enzyme activity per gram of beef tallow). The transesterification yields and the productivity values were important parameters in choosing the most effective biocatalysts. Transesterificated products obtained with yields higher than 90% were subjected to additional tests, such as kinematic viscosity, infrared spectroscopy, thermogravimetry and 1H NMR. The immobilized derivative selected (Pseudomonas cepacia) was characterized according to biochemical and kinetics properties and thermal stability. An experimental design was adopted to determine the influence of pH and temperature on enzyme activity. To study the enzyme kinetics experiments were performed with different concentrations of substrate (olive oil) to determine the parameters Km and Vmax in the Michaelis-Menten kinetics. A study of thermal stability of free and immobilized lipase was performed at 60 °C to determine the constant of thermal deactivation. Following this, the chosen immobilized derivative was used to optimize the transesterification reaction (temperature and molar ratio) via response surface methodology, obtaining the following mathematical model (Y=86.89-7.46x1-2.04x2) for the transesterification yield, where x1 and x2 are the coded values for the variables temperature and molar ratio, respectively. Optima reaction conditions were determined by software (T = 48 ° C and molar ratio of 1:7 (tallow: ethanol)) and then a trial to confirm the mathematical model was performed using 110 g of reaction medium. The yield value showed good correlation with results predicted by the model (91.62% in 8 h reaction). Finally, the product was submitted to a sequence of tests and analysis to verify the potential of the enzymatic process. The tests indicated that the enzymatic process allows producing biodiesel with good quality, although the specifications recommended by the Brazilian Petroleum Agency (ANP) to be used as biofuel were not fully attained.