Zugl.: Braunschweig, Universiẗat, Diss., 1995.

Les bactéries du genre Mycobacterium possèdent une enveloppe très caractéristique composée d'une membrane plasmique, une paroi et une capsule. Le compartiment pariétal est le plus remarquable, notamment grâce à la présence de lipides non liés de façon covalente à la structure : les lipides extractibles. Ubiquitaires ou spécifiques à une espèce, ces derniers sont retrouvés en surface, où ils peuvent jouer un rôle clé dans les interactions hôte-pathogène. La synthèse et le transport de ces lipides nécessite l'intervention d'une enzyme modulaire appelée polykétide synthase (Pks), d'une enzyme activant le substrat de la Pks, d'une autre transférant le produit de la Pks sur une molécule acceptrice et enfin d'un transporteur de la famille RND (résistance, nodulation, division cellulaire). Un locus regroupant les gènes codant pour des protéines de biosynthèse et de transport de lipides extractibles a été retrouvé sur le chromosome de M. smegmatis entre les gènes MSMEG_0406 et MSMEG_0413. Nous avons alors entrepris de caractériser le rôle de chacun de ces gènes. Notre stratégie a consisté à inactiver ces gènes par recombinaison homologue puis à étudier la nature et la localisation des dérivés lipidiques de l'enveloppe des mutants. Suite à la caractérisation structurale des dérivés lipidiques affectés par ces mutations, nous avons montré que ce locus est lié aux polyphléates de tréhalose (PPT), auparavant décrits chez M. phlei. Le composé mature consiste en un tréhalose estérifié par sept acides gras polyinsaturés appelés acides phléiques. L'étude des génomes mycobactériens a montré que ces gènes sont conservés par un large panel de mycobactéries non tuberculeuses, en particulier M. avium et M. abscessus, deux pathogènes opportunistes. L'analyse du contenu lipidique de ces deux espèces a mis en évidence un composé possédant des propriétés similaires aux PPT. Par ailleurs, l'inactivation chez M. abscessus de l'orthologue du gène codant la Pks abolit la production de ces composés, confirmant ainsi le rôle de la Pks. Par analogie avec les voies de biosynthèse des glycolipides produits par M. tuberculosis, agent de la tuberculose, nous avons pu établir un modèle de la voie de biosynthèse des PPT chez les mycobactéries. / The unique mycobacterial envelope can be divided into three entities: a plasma membrane, a cell wall and a capsule. The parietal compartment is remarkable for its lipid content notably the extractible lipids, not covalently bound to the structure. Either ubiquitous or species-specific, these surface lipids can play key roles in host-pathogen interactions. The synthesis and transport of many extractible lipids require at least a modular enzyme called polyketide synthase (Pks), a protein allowing the activation of the Pks substrate, another transferring the Pks product onto an acceptor molecule and a RND transporter (resistance-nodulation-division). A locus containing synthesis and transport coding genes was found on the M. smegmatis chromosome between MSMEG_0406 and MSMEG_0413. We then undertook to characterize the role of each gene composing this locus. Our strategy was to disrupt these genes by homologous recombination and then to analyze the lipid content and localization of the mutant strain envelope. Structural characterization of the impacted lipids showed a link between this locus and trehalose polyphleates (PPT) synthesis. The mature compound is a trehalose acylated by seven polyunsaturated fatty acids called phleic acid and previously described in M. phlei. Analysis of mycobacterial genomes showed that these genes are conserved in several non tuberculous mycobacteria, including the opportunistic pathogens M. avium and M. abscessus. Analysis of the lipid content of both species showed a compound with the same properties than PPT. Moreover, inactivation of the M. abscessus pks orthologue abolished its production, thus confirming the Pks implication in the PPT synthesis. By analogy with M. tuberculosis glycolipid biosynthesis, we could propose a model of the PPT biosynthetic pathway in mycobacteria.

Introduction : L’apolipoprotéine E (ApoE) est une protéine membranaire impliquée dans le catabolisme des lipoprotéines riches en triglycérides (TG). Le polymorphisme du gène de l’apolipoprotéine E epsilon 4 (APOE4) est considéré comme le plus grand facteur de risque génétique de la maladie d’Alzheimer tardive. Il est connu que la consommation d’acide gras polyinsaturé oméga 3 (AGPI n-3) serait associée à une diminution du risque de déclin cognitif. L’acide docosahexaénoïque (DHA) est un AGPI n-3 contenu dans les poissons riches en gras. Des résultats publiés par la professeure Mélanie Plourde ont démontré que suite à une diète riche en DHA, la concentration plasmatique en DHA était 3 fois moins élevée chez les porteurs de l’APOE4. Cela laisse supposer que les porteurs d’APOE4 auraient possiblement une perturbation dans l’homéostasie des AGPI n-3 au niveau entérocytaire. Objectif : Déterminer le profil en acides gras (AG) dans le duodénum et le jéjunum selon la diète et le polymorphisme de l’APOE chez le modèle animal murin. Évaluer si la diète et/ou le polymorphisme de l’APOE affectent l’expression protéique des transporteurs d’AG dans le jéjunum chez le modèle animal murin. Matériel et méthodes : Des souris knock-in pour les différentes formes de l’APOE (APOE3 ou APOE4) ont été utilisées. À 4 mois, celles-ci ont reçu pendant 8 mois soit une diète contrôle ou une diète riche en DHA. Après sacrifice des animaux, le duodénum et le jéjunum ont été prélevés. Une extraction des lipides totaux par la méthode de Folch a été effectuée. Le profil en AG a ensuite été réalisé par chromatographie en phase gazeuse. L’expression protéique des transporteurs d’AG entérocytaire a été mesurée par immunobuvardage de type western. Résultats et discussion : Les souris nourries avec la diète DHA avaient une augmentation en DHA dans le duodénum et le jéjunum établissant ainsi que le DHA est bien absorbé par les entérocytes dans ce modèle animal. Le génotype de l’APOE ne semble pas affecter spécifiquement le métabolisme du DHA puisqu’aucune différence significative n’a été observée pour le génotype. Par ailleurs, les souris ayant consommé la diète DHA avaient une diminution en acide arachidonique. Cette diminution semble plus prononcée chez les souris porteuses de l’APOE4, ce qui pourrait suggérer une demande plus importante en DHA chez les souris porteuses de l’APOE4. D’autre part, les souris nourries avec la diète DHA avaient une augmentation significative de l’expression relative des transporteurs d’AG Cd36 et Fabp2. Finalement, le transporteur d’AG Fabp1 tend à être diminué chez les souris porteuses de l’APOE4 Conclusion : Ces résultats suggèrent une possible perturbation dans le transit et l’exportation des AG sous forme de chylomicron plutôt que dans l’absorption de ceux-ci.

Cells, whether bacterial, fungal or mammalian, are all equipped with metabolic pathways capable of producing an assortment of structurally and functionally distinct lipid species. Despite the structural diversity of lipids being recognized and correlated to specific cellular phenomena and disease states, the molecular mechanisms that underpin this structural diversity remain poorly understood. In part, this is due to the lack of adequate analytical techniques capable of measuring the structural details of lipid species in a direct, comprehensive and quantitative manner. The aim of my thesis study was to establish methodology for automated and quantitative analysis of molecular lipid species based on mass spectrometry. From this work a novel high-throughput methodology for lipidome analysis emerged. The main assets of the methodology were the structure-specific mass analysis by powerful hybrid mass spectrometers with high mass resolution, automated and sensitive infusion of total lipid extracts by a nanoelectrospray robot, and automated spectral deconvolution by dedicated Lipid Profiler software. The comprehensive characterization and quantification of molecular lipid species was achieved by spiking total lipid extracts with unique lipid standards, utilizing selective ionization conditions for sample infusion, and performing structure-specific mass analysis by hybrid quadrupole time-of-flight and ion trap mass spectrometry. The analytical routine allowed the comprehensive characterization and quantification of molecular glycerophospholipid species, molecular diacylglycerol species, molecular sphingolipid species including ceramides, glycosphingolipids and inositol-containing sphingolipids, and sterol lipids including cholesterol. The performance of the methodology was validated by comparing its dynamic quantification range to that of established methodology based on triple quandrupole mass spectrometry. Furthermore, its efficacy for lipidomics projects was demonstrated by the successful quantitative deciphering of the lipid composition of T cell receptor signaling domains, mammalian tissues including heart, brain and red blood cells, and the yeast Saccharomyces cerevisiae.

Lipide erfüllen als Energiespeicher und Element verschiedener Verbindungen für den Organismus lebenswichtige Funktionen. Verändert sich ihre Konzentration im Blut spricht man von Dyslipidämien. Diese stellen, insbesondere als Risikofaktor für kardiovaskuläre Erkrankungen, vor allem in Industrienationen ein bedeutendes gesundheitsökonomisches Problem dar. Verschiedene Studien identifizierten in den letzten Jahren zahlreiche Genloci, die den Lipidstoffwechsel beeinflussen. Darunter befinden sich Gene wie APOC1, CETP oder LPL, die aufgrund ihrer Funktionalität eindeutig dem Fettstoffwechsel zuzuordnen sind. Zusätzlich gerieten bisher unbekannte Loci in den Gegenstand der Forschung. Zusammen erklären diese Loci derzeit lediglich 25 - 30 % der phänotypischen Ausprägung. In der vorliegenden Studie wurde mittels genomweiter Assoziationsstudien (GWAS) nach weiteren, potentiell im Zusammenhang mit den Merkmalen HDL-, LDL-Cholesterol und Triglyceriden stehenden Genloci gesucht. Dazu wurde in einer eigenständigen Population, den Sorben aus der Oberlausitz, eine genomweite Assoziationsstudie (N = 839) durchgeführt. Es zeigten sich 13 signifikant assoziierte Loci mit einem P-Wert < 10 5. Anschließend wurden SNPs mit einem P-Wert < 0,01 in der sorbischen Kohorte für eine Metaanalyse mit den Daten der Probanden der Diabetes Genetics Initiative (N ~ 2600) ausgewählt. So konnten 21 Genloci mit einem kombinierten P-Wert < 10 4 bestätigt werden. Von diesen wurden 5 neu identifizierte, bisher nicht publizierte Varianten in der unabhängigen Metabolisches Syndrom Berlin Potsdam Kohorte (N = 2000) repliziert. Mit einem P-Wert von 1,78x10 7 zeigte die Variante rs8135828 im THOC5 Gen für den Parameter HDL-Cholesterol die stärkste Assoziation in der kombinierten Metaanalyse aller 3 Kohorten. Weitere Analysen sind notwendig, um die Funktionen und den Regulationsmechanismus der identifizierten SNPs auf den Fettstoffwechsel genau zu verstehen.

L'obésité est maintenant perçue comme un problème de santé majeur dans notre société. C'est pourquoi la compréhension des mécanismes moléculaires liés au développement de cette maladie est primordiale. Des études comparatives entre des poulets de lignées grasses et des poulets de lignées maigres ont montré que la lipogénèse hépatique était plus élevée chez les animaux gras. La Synthétase des Acides Gras (FAS) est connue comme étant responsable de la synthèse des lipides saturés à longues chaînes. Des études antérieures ont démontré que ce gène est régulé à la fois par l'état nutritionnel et hormonal. Dans ce contexte, l'objectif de la présente étude était d'examiner le rôle de l'hormone thyroïdienne (T3), et aussi d'un mélange de T3 et d'insuline, sur l'activité transcriptionnelle du gène aviaire de la FAS. Certains des éléments agissant au niveau de la réponse à l'insuline ont déjà été identifiés chez l'humain, le poulet, la souris et le rat. Afin d'identifier l'effet de la T3 et d'un mélange de T3 et d'insuline, un fragment d'ADN de 1,6 Kpb de la partie promotrice de FAS a été isolé, séquencé et cloné dans un vecteur contenant le gène rapporteur codant pour la chloramphénicol acétyl transférase (CAT). Cette construction nommée 1.6FAS-pJFCAT1 a ensuite été transfectée de façon transitoire dans les cellules HepG2 et les hépatocytes embryonnaires de poulet. Les analyses d'expression ont démontré une augmentation de l'activité du gène rapporteur codant pour CAT de 2.5 fois, suite à une stimulation de 48 heures avec 1.6µM de T3. Ce promoteur posséderait donc un élément de réponse nécessaire à la modulation par cette hormone. Des constructions contenant des délétions successives de ce grand fragment d'ADN et des alignements de séquences ont permis l'identification de la région interne localisée entre -902/ -577 pb où se retrouve l'élément de réponse à la T3, appelé TRE pour 'Thyroïd Hormone Response Element'. Des analyses de retard sur gel (EMSA) utilisant comme TRE un oligonucléotide contenant les bases -732 à -692 ont ensuite permis d'identifier des protéines se fixant sur ce fragment d'ADN en réponse à la T3, renforçant ainsi la présence possible d'un TRE. Une augmentation de l'activité CAT de 2.3 fois a d'ailleurs aussi été obtenue après 48 heures de stimulation à la T3 lors d'expériences de transfections transitoires avec la construction contenant le fragment -765/-663 placé devant le promoteur TK. Le TRE correspondrait donc à la séquence CGCCCTgtggTAACCT, séquence très différente du consensus établi et très différente des T3RE retrouvés dans la partie promotrice du gène de l'enzyme malique. Il a toutefois une forte homologie avec un TRE retrouvé dans le gène FAS chez l'humain, le poulet, la souris et le rat. Ceci semble démontrer la forte variation de ces éléments de réponse. L'analyse par retard sur gel révèle qu'en présence de T3 seulement il y a fixation du récepteur TR alors que lorsque l'insuline est aussi présente, il semble que le facteur de transcription RXR se fixe aussi. Ceci suggérerait l'idée que la formation d'hétérodimères TR/RXR serait grandement favorisée en présence d'insuline. Ces informations, en combinaison avec les résultats récents obtenus par d'autres équipes sur la régulation de la FAS, serviront à la compréhension des mécanismes de régulation de la transcription d'un gène clé de la lipogenèse hépatique. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Hormone thyroïdienne, TRE, Synthétase des acides gras, FAS, Lipogenèse.

Zugl.: Berlin, Humboldt-Univ., Diss., 2009

Die Desinfektion von Bruteiern spielt bei der Bekämpfung von Zoonosen, insbesondere Salmonelloseerkrankungen durch den Verzehr von Lebensmitteln aus der Geflügelwirtschaft eine große Rolle.In dieser Arbeit sollte Ozon als eine Alternative zur bereits praktizierten Formaldehydbegasung bei Bruteiern untersucht werden. Biochemische Untersuchungen an Proteinen,Lipiden und der embryonalen DNA sollten mögliche Veränderungen aufgrund einer Ozonbehandlung aufzeigen. Im Hinblick auf die biochemischen Untersuchungen kann zusammenfassend gesagt werden, dass eine Ozonierung von Bruteiern mit einer geeigneten Dosierung keine direkten Schäden für die Entwicklung des Embryos hervorruft und somit ein Einsatz in Brütereien sinnvoll erscheint.

Universiẗat, Diss.--Freiburg i. Br., 2000.

Zugl.: Kiel, Univ., Diss. K. Oehlke, 2009