L'extinction post-transcriptionnelle de gènes ou PTGS (Posttranscriptional Gene Silencing) est un phénomène hautement conservé à travers l'évolution. Retrouvé chez des organismes allant des champignons aux vertébrés, ce système reconnaît spécifiquement les molécules de RNA double brin (db) et les dégrade en fragments de 21-23 nt. Chez les plantes, le PTGS pourrait défendre l'organisme contre les infections virales. En réponse à ce mécanisme de défense, un certain nombre de virus codent pour des protéines capables de supprimer le PTGS. Ces protéines dites "suppresseurs" de PTGS, comme les protéines HCPro des potyvirus et 2b des cucumovirus, ne partagent aucune homologie de séquence ni de structure et jouent des rôles différents dans le cycle de multiplication virale. Les résultats obtenus et décrits dans ce mémoire ont permis l'identification et la caractérisation de nouvelles protéines virales impliquées dans la suppression du PTGS, ceci afin de mieux cerner les mécanismes de suppression. Ainsi, nous avons montré que les protéines P15 et P14 de deux virus apparentés, le PCV (Peanut Clump Virus) et le BNYVV (Beet Necrotic Yellow Vein Virus) sont des suppresseurs de PTGS aux propriétés distinctes. En effet, la protéine P15 se localise dans les peroxysomes et semble être active sous une forme multimérique ; quant à la protéine P14, elle se localise dans le cytoplasme et le nucléole et supprime plus faiblement le PTGS. Par ailleurs, nous avons également découvert que la protéine P0 du BWYV (Beet Western Yellows Virus) est un suppresseur de PTGS très efficace hors de son contexte viral. De manière surprenante, son expression est fortement régulée par le virus au cours de l'infection. Enfin, nous avons confirmé que la protéine P0 jouait un rôle de protection du virus contre le PTGS grâce à l'utilisation de plantes transgéniques exprimant la protéine mineure de capside du BWYV. Ce virus déclenche sur ces plantes un PTGS dirigé contre le transgène, sans être affecté.

La photothérapie dynamique (PDT) consiste en la destruction d'une tumeur par l'association de l'administration d'un photosensibilisateur et de l'exposition à la lumière visible. Ce travail comporte : i) une étude de l'ionisation et de la lipophilie d'une série de photosensibilisateurs, des méso-tétraphénylporphyrines (TPP) glycoconjuguées, ii) une évaluation de l'impact de ces deux propriétés sur la distribution plasmatique et la localisation subcellulaire du photosensibilisateur.La protonation des azotes tétrapyrroliques a été étudiée par spectroscopie électronique, combinéeà une analyse chimiométrique, tandis que la lipophilie a été évaluée par chromatographie liquide haute performance. L'impact de différents effets de substitution (position, nombre ou nature du substituant) sur ces deux propriétés physico-chimiques a été mis en évidence.Dans le plasma, les TPP glycoconjuguées se lient principalement aux lipoprotéines de haute densité. La lipophilie de ces dérivés permet d'expliquer leur affinité pour les lipoprotéines, mais pas pour l'albumine. L'étude de localisation subcellulaire, combinant approche expérimentale et modélisation, a conduit à proposer une hypothèse expliquant la localisation de la TPP(pODEGOαManOH)3 au niveau du réticulum endoplasmique, hypothèse accordant un rôle central à la lipophilie de la TPP . A l'issue de ce travail, avant d'appliquer nos hypothèses à la synthèse de nouvelles molécules, il apparaît nécessaire de mieux explorer l'impact de la distribution plasmatique et de la localisation subcellulaire sur l'efficacité PDT.

Le virus de la mosaïque jaune du navet (TYMV) possède un génome monopartite constitué d’ARN de polarité positive codant pour trois protéines, dont seule la polyprotéine 206K est indispensable à la réplication virale.Elle subit une maturation protéolytique, générant les protéines 140K et 66K, localisées au niveau de l’enveloppe des chloroplastes, siège de la réplication virale.Adressée aux chloroplastes, la protéine 140K y recrute la 66K et se comporte comme une protéine intégrale membranaire.Le domaine d’adressage aux chloroplastes (DAC) de la protéine 140K a été défini grâce à la transfection et à des protoplastes d’Arabidopsis thaliana par différentes constructions codantpour des versions délétées de la protéine fusionnées à l’EGFP, et à leur observation en microscopie confocale. Le DAC comprend deux hélices alpha amphipathiques dont la présence a été attestée par dichroïsme circulaire. Leur nécessité pour la localisation aux chloroplastes, l’association aux membranes et la réplication virale, a été étudiée. Différents patterns de distribution subcellulaire de la protéine 140K ont été observés. Ils sont corrélés au taux d’expression de la protéine. Sa dimérisation a également été démontrée.L’implication d’autres résidus du DAC dans la localisation subcellulaire, la dimérisation et la réplication virale, a également été recherchée. / Turnip yellow mosaic virus (TYMV) is a positive single-stranded RNA virus. Among the three ORFs encoded by the TYMV genome, 206K is the only protein required for viral replication. It is cleaved into 140K and 66K, which are both present at the chloroplast envelope membrane, where viral replication takes place.The 140K protein is targeted to chloroplasts, where it recruits 66K, and behaves as an integral membrane protein. The chloroplast targeting domain (DAC) of the 140K protein was defined using Arabidopsis thaliana protoplasts transfected by various constructs encoding deleted versions of 140Kfused to EGFP and subsequent confocal microscopy. The DAC comprises two amphipathic alpha helices, as confirmed by circular dichroism. Their involvement in chloroplast localisation and membrane association has been assessed, as well as their contribution to viral replication.We observed different subcellular distribution patterns of 140K protein, which correlate with the expression level of the protein. Its capability to dimerize has also been demonstrated.The involvement of other DAC residues in subcellular localisation, dimerization and viral replication has been studied.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

La micro-algue verte Chlamydomonas reinhardtii est considérée comme un modèle dans l’étude du stress métallique chez les organismes photosynthétiques. Les mécanismes de tolérance au stress induit par le cadmium ne sont pas encore clairement établis. Afin de déterminer ces mécanismes, la localisation subcellulaire et la spéciation chimique in situ du cadmium ont été déterminées chez trois souches de C. reinhardtii exposées au cadmium en condition mixotrophe (CO2 + Acétate) : (i) une souche de type sauvage (wt), (ii) la souche cell-wall less (cw15) qui est déficiente en paroi cellulaire, (iii) la souche pcs1 qui surexprime la phytochélatine synthase (PCS), enzyme ordinairement cytosolique, directement dans son chloroplaste. Pour ce faire, la toxicité du cadmium a été déterminée en mesurant la croissance ainsi que la teneur en chlorophylle et en amidon des micro-algues. Puis, la localisation du cadmium au niveau subcellulaire a été réalisée par trois techniques complémentaires (fractionnement subcellulaire, µXRF, TEM/X-EDS). La spéciation chimique in situ du cadmium a été effectuée par µXAS et XAS. Enfin, l’imagerie élémentaire et isotopique par nanoSIMS a permis de compléter les distributions élémentaires dans la cellule et de déterminer l’impact du cadmium sur les mécanismes d’assimilation du carbone. (i) Les résultats de ce travail montrent que la souche wt est la plus sensible au cadmium des trois avec une diminution de la croissance et de la teneur en chlorophylle. Lorsqu’elle ne présente pas ces signes de toxicité, le cadmium est séquestré dans l’ensemble de la cellule par des ligands thiolés et de façon mineure par les granules de polyphosphates. Suite à l’exposition à de fortes concentrations en cadmium, le cadmium intracellulaire est lié majoritairement à des ligands carboxylés probablement induits par le stress oxydatif. De plus, la présence du cadmium dans le pyrénoïde bloque l’assimilation du carbone inorganique (CO2), au profit de l’assimilation du carbone organique (acétate), qui est stocké sous forme d’amidon. (ii) La surexpression de la PCS de la souche pcs1 provoque une production d’amidon importante autour du pyrénoïde et protège la chlorophylle du stress lié au cadmium. Bien que la synthèse de phytochélatines soit potentiellement élevée, la moitié du cadmium intracellulaire est séquestrée par les granules de polyphosphates et l’amidon. (iii) La souche cw15 est la plus tolérante des trois souches et n’accumule pas la totalité du cadmium disponible, contrairement aux cellules possédant une paroi cellulaire. Similairement au wt, le cadmium intracellulaire est séquestré majoritairement par des ligands thiolés et de façon mineure par les granules de polyphosphates. L’observation de granules de polyphosphates excrétées par les micro-algues permet l’hypothèse de l’excrétion du cadmium vacuolaire induisant un flux constant de cadmium à travers la cellule. En conclusion, la séquestration du cadmium via des ligands soufre, potentiellement par des polypeptides thiolés, est le mécanisme de tolérance majoritaire mis en place par C. reinhardtii. Néanmoins, la séquestration du cadmium par les granules de polyphosphates semble apporter une plus grande tolérance vis-à-vis du stress lié au cadmium. / The green micro-alga Chlamydomonas reinhardtii is commonly used as a model for the study of the metallic stress in photosynthetic organisms. Tolerance mechanisms against stress induced by cadmium are not well understood. In order to determine these mechanisms, subcellular location and in situ speciation have been determined in three C. reinhardtii strains exposed to cadmium in mixotrophic conditions (CO2 + Acetate) : (i) a wild type strain (wt), (ii) a cell-wall less strain (cw15) which is deficient in cell-wall, (iii) the pcs1 strain which overexpresses the cytosolic enzyme phytochetlatin synthase (PCS) directly in the chloroplast. Cadmium toxicity has been determined by the monitoring of growth and chlorophyll, starch content in micro-algae. Then, cadmium location at subcellular level has been performed using three complementary techniques (subcellular fractionation, µXRF and TEM/X-EDS). In situ cadmium speciation has been studied by µXAS and XAS. Finally, elemental and isotopic imaging by nanoSIMS has allowed to complete elemental distribution in the cells and to determine the impact of cadmium on the assimilation of carbon. (i) The results of this work show that the wt strain is the most sensitive strain to cadmium stress among the three studied strains with a growth and chlorophyll content decrease. When wt cells do not show signs of toxicity, cadmium is mainly sequestered in the whole cell by thiolated ligands and in polyphosphate granules. After an exposure to high concentration of cadmium, intracellular cadmium is mainly bound to carboxylated ligands, probably induced by oxidative stress. Moreover, cadmium located in the pyrenoid blocks inorganic carbon (CO2) assimilation and increases organic carbon (acetate) assimilation which is stored as starch. (ii) The overexpresssion of PCS in the pcs1 strain induces a strong production of starch around the pyrenoid and proctects the chlorophyll against cadmium stress. Although the synthesis of phytocheltins was potentially strong, half of the intracellular cadmium is sequestered in polyphosphate granules and in starch. (iii) Unlike cell-walled cells, the cw15 strain is the most tolerant strain and does not accumulate the totality of available cadmium. Similarly to wt strain, intracellular cadmium is mainly sequestered by thiolated ligands and in polyphosphate granules. The observation of polyphosphate granules excreted by the micro-algae allows the hypothesis of the excretion of vacuolar cadmium, inducing a constant flux of cadmium through the cells. In conclusion, cadmium sequestration by sulfur ligands, potentially by thiolated polypeptides, is the main tolerance mechanism implemented by C. renhardtii. However, cadmium sequestration in polyphosphate granules seems to allow a better tolerance against cadmium stress.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

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Les dysfonctions placentaires sont fortement associées aux complications de la grossesse et de plus en plus reliées à une augmentation de médiateurs inflammatoires endogènes, appelés alarmines ou motifs moléculaires associés aux dommages (« damage associated molecular patterns » (DAMPs). High-mobility group box 1 (HMGB1), est un DAMP qui a été associé aux grossesses avec PE et accouchement prématuré. HMGB1 est une protéine nucléaire qui peut être sécrétée dans l’espace extracellulaire de façon passive ou active. Une fois dans l’espace extracellulaire, HMGB1 existe sous différents isoformes ayant des actions inflammatoires distinctes. Le rôle de HMGB1 et de ses isoformes à l’interface materno-fœtale est encore peu connu. L’objectif de mes travaux de maitrise était d’investiguer le rôle de HMGB1 à l’interface materno-fœtale, en déterminant sa localisation subcellulaire pendant la syncytialisation, ainsi que les actions pro-inflammatoires sur le placenta. Méthodes : Un modèle d’explants placentaires en conditions physiologiques fut utilisé afin de déterminer et de moduler la localisation subcellulaire de HMGB1. Le même modèle a été traité avec les différentes isoformes de HMGB1 (HMGB1-disulfide: D ou HMGB1-réduit: R) afin de déterminer leurs effets inflammatoires et leurs impacts sur la fonction placentaire. Des placentas de femmes ayant des grossesses sans complications, une prééclampsie (PE) ou une prééclampsie du postpartum (PPPE) ont été étudiés afin de déterminer la distribution de HMGB1 et ses récepteurs (Receptor for advanced glycation end product (RAGE) et Toll like receptor (TLR4)). Résultats : La localisation intracellulaire de HMGB1 est modulée pendant le processus de syncytialisation avec une localisation majoritairement cytoplasmique et extracellulaire par rapport à une localisation généralement nucléaire dans les trophoblastes différenciés. Favoriser l’export nucléaire de HMGB1 avec un inhibiteur d’histone déacétylase (HDAC), le sodium butyrate (NaB) augmente la concentration cytoplasmique de HMGB1 ainsi que la sécrétion de l’hormone chorionique gonadotrope (-hCG), signe de la différentiation des trophoblastes. L’isoforme disulfide de HMGB1 induit la sécrétion de cytokines pro-inflammatoire (IL-1, IL-6 et MCP-1) et a aussi un impact sur la différenciation des trophoblastes, tel qu’observé par une diminution de la sécrétion de -hCG. En conditions pathologiques, l’expression de HMGB1 et ses récepteurs RAGE et TLR4 est augmentée dans des conditions de prééclampsie du post-partum. Pour conclure, la localisation subcellulaire de HMGB1 est modulée pendant la syncytialisation, dans un contexte non-pathologique. L’accumulation cytoplasmique de HMGB1 est la première étape avant la sécrétion dans l’espace extracellulaire. Lorsque dans l’espace extracellulaire, une isoforme spécifique de HMGB1 (HMGB1-D) entraine l’augmentation de la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires. L’expression de HMGB1 et ses récepteurs est augmentée et conditions pathologiques démontrant que ce DAMP peut jouer différents rôles tant dans un contexte inflammatoire et de dysfonctions placentaires ainsi que dans un contexte de différenciation des trophoblastes. / Sterile inflammation, caused by endogenous damaged-associated-molecular-patterns (DAMP), at the maternal fetal interface is frequently observed in pregnancy complications and leads to placental inflammation and dysfunction by unknown mechanisms. HMGB1 has been associated to preeclampsia, preterm birth and it can be released in the extracellular space and associated to increased inflammatory actions. Extracellular HMGB1 has two isoforms, (HMGB1-disulfide-D) inducing proinflammatory cytokines whilst the other (HMGB1-reduced-R) acts as a chemoattractant. The role of HMGB1 and its isoform at the maternal-fetal interface is mostly unknown. The objective of my master was to investigate the roles of HMGB1 at the maternal-fetal interface including its subcellular localisation during trophoblast differentiation and pro-inflammatory effects on the placenta. Methods: Term placental explants were used to determine the subcellular localisation of HMGB1 during trophoblast differentiation or treated with specific HMGB1 isoforms (HMGB1-D or HMGB1-R) to determine the impact on inflammation and placental function. Alongside, placentas from women with either normal term pregnancies, PE or PPPE were used to determine the distribution of HMGB1 and its receptor. Results: HMGB1 subcellular localisation is modulated during the syncytialisation process with major cytoplasmic and extracellular localisation to a more nuclear localisation in differentiated trophoblasts. Promoting HMGB1 nuclear export, using the histone deacetylase inhibitor (HDAC) NaB, increased HMGB1 cytoplasmic concentration leading to increase secretion of human chorionic gonadotropin (-hCG) in placental explants. HMGB1-D treatment of explants led to the secretion of pro-inflammatory cytokines (IL-1, IL-6 et MCP-1) and impacted trophoblasts differentiation observed by decreased -hCG secretion. In pathological conditions, HMGB1 and his receptors, RAGE and TLR4, expression is increased in PPPE compared to non-pathological pregnancy. To conclude, we demonstrated changes in the localisation of HMGB1 in association with trophoblast differentiation in uncomplicated pregnancies. Cytoplasmic accumulation of HMGB1 is the first step before its release in the extracellular space. We showed that a specific isoform of HMGB1 (disulfide isoform) induced inflammatory cytokines secretion which suggests a role of this DAMP in placental inflammation and function. Finally, HMGB1 and its receptors are increased in a pathological condition (PPPE) demonstrating that this DAMP may play different role in both inflammatory context and trophoblast differentiation.

Le rôle important joué par la mitochondrie dans la cellule eucaryote est admis depuis longtemps. Cependant, la composition exacte des mitochondries, ainsi que les processus biologiques qui sy déroulent restent encore largement inconnus. Deux facteurs principaux permettent dexpliquer pourquoi létude des mitochondries progresse si lentement : le manque defficacité des méthodes didentification des protéines mitochondriales et le manque de précision dans lannotation de ces protéines. En conséquence, nous avons développé un nouvel outil informatique, YimLoc, qui permet de prédire avec succès les protéines mitochondriales à partir des séquences génomiques. Cet outil intègre plusieurs indicateurs existants, et sa performance est supérieure à celle des indicateurs considérés individuellement. Nous avons analysé environ 60 génomes fongiques avec YimLoc afin de lever la controverse concernant la localisation de la bêta-oxydation dans ces organismes. Contrairement à ce qui était généralement admis, nos résultats montrent que la plupart des groupes de Fungi possèdent une bêta-oxydation mitochondriale. Ce travail met également en évidence la diversité des processus de bêta-oxydation chez les champignons, en corrélation avec leur utilisation des acides gras comme source dénergie et de carbone. De plus, nous avons étudié le composant clef de la voie de bêta-oxydation mitochondriale, lacyl-CoA déshydrogénase (ACAD), dans 250 espèces, couvrant les 3 domaines de la vie, en combinant la prédiction de la localisation subcellulaire avec la classification en sous-familles et linférence phylogénétique. Notre étude suggère que les gènes ACAD font partie dune ancienne famille qui a adopté des stratégies évolutionnaires innovatrices afin de générer un large ensemble denzymes susceptibles dutiliser la plupart des acides gras et des acides aminés. Finalement, afin de permettre la prédiction de protéines mitochondriales à partir de données autres que les séquences génomiques, nous avons développé le logiciel TESTLoc qui utilise comme données des Expressed Sequence Tags (ESTs). La performance de TESTLoc est significativement supérieure à celle de tout autre outil de prédiction connu. En plus de fournir deux nouveaux outils de prédiction de la localisation subcellulaire utilisant différents types de données, nos travaux démontrent comment lassociation de la prédiction de la localisation subcellulaire à dautres méthodes danalyse in silico permet daméliorer la connaissance des protéines mitochondriales. De plus, ces travaux proposent des hypothèses claires et faciles à vérifier par des expériences, ce qui présente un grand potentiel pour faire progresser nos connaissances des métabolismes mitochondriaux. / The important role of mitochondria in the eukaryotic cell has long been appreciated, but their exact composition and the biological processes taking place in mitochondria are not yet fully understood. The two main factors that slow down the progress in this field are inefficient recognition and imprecise annotation of mitochondrial proteins. Therefore, we developed a new computational tool, YimLoc, which effectively predicts mitochondrial proteins from genomic sequences. This tool integrates the strengths of existing predictors and yields higher performance than any individual predictor. We applied YimLoc to ~60 fungal genomes in order to address the controversy about the localization of beta oxidation in these organisms. Our results show that in contrast to previous studies, most fungal groups do possess mitochondrial beta oxidation. This work also revealed the diversity of beta oxidation in fungi, which correlates with their utilization of fatty acids as energy and carbon sources. Further, we conducted an investigation of the key component of the mitochondrial beta oxidation pathway, the acyl-CoA dehydrogenase (ACAD). We combined subcellular localization prediction with subfamily classification and phylogenetic inference of ACAD enzymes from 250 species covering all three domains of life. Our study suggests that ACAD genes are an ancient family with innovative evolutionary strategies to generate a large enzyme toolset for utilizing most diverse fatty acids and amino acids. Finally, to enable the prediction of mitochondrial proteins from data beyond genome sequences, we designed the tool TESTLoc that uses expressed sequence tags (ESTs) as input. TESTLoc performs significantly better than known tools. In addition to providing two new tools for subcellular localization designed for different data, our studies demonstrate the power of combining subcellular localization prediction with other in silico analyses to gain insights into the function of mitochondrial proteins. Most importantly, this work proposes clear hypotheses that are easily testable, with great potential for advancing our knowledge of mitochondrial metabolism.

Le rôle important joué par la mitochondrie dans la cellule eucaryote est admis depuis longtemps. Cependant, la composition exacte des mitochondries, ainsi que les processus biologiques qui sy déroulent restent encore largement inconnus. Deux facteurs principaux permettent dexpliquer pourquoi létude des mitochondries progresse si lentement : le manque defficacité des méthodes didentification des protéines mitochondriales et le manque de précision dans lannotation de ces protéines. En conséquence, nous avons développé un nouvel outil informatique, YimLoc, qui permet de prédire avec succès les protéines mitochondriales à partir des séquences génomiques. Cet outil intègre plusieurs indicateurs existants, et sa performance est supérieure à celle des indicateurs considérés individuellement. Nous avons analysé environ 60 génomes fongiques avec YimLoc afin de lever la controverse concernant la localisation de la bêta-oxydation dans ces organismes. Contrairement à ce qui était généralement admis, nos résultats montrent que la plupart des groupes de Fungi possèdent une bêta-oxydation mitochondriale. Ce travail met également en évidence la diversité des processus de bêta-oxydation chez les champignons, en corrélation avec leur utilisation des acides gras comme source dénergie et de carbone. De plus, nous avons étudié le composant clef de la voie de bêta-oxydation mitochondriale, lacyl-CoA déshydrogénase (ACAD), dans 250 espèces, couvrant les 3 domaines de la vie, en combinant la prédiction de la localisation subcellulaire avec la classification en sous-familles et linférence phylogénétique. Notre étude suggère que les gènes ACAD font partie dune ancienne famille qui a adopté des stratégies évolutionnaires innovatrices afin de générer un large ensemble denzymes susceptibles dutiliser la plupart des acides gras et des acides aminés. Finalement, afin de permettre la prédiction de protéines mitochondriales à partir de données autres que les séquences génomiques, nous avons développé le logiciel TESTLoc qui utilise comme données des Expressed Sequence Tags (ESTs). La performance de TESTLoc est significativement supérieure à celle de tout autre outil de prédiction connu. En plus de fournir deux nouveaux outils de prédiction de la localisation subcellulaire utilisant différents types de données, nos travaux démontrent comment lassociation de la prédiction de la localisation subcellulaire à dautres méthodes danalyse in silico permet daméliorer la connaissance des protéines mitochondriales. De plus, ces travaux proposent des hypothèses claires et faciles à vérifier par des expériences, ce qui présente un grand potentiel pour faire progresser nos connaissances des métabolismes mitochondriaux. / The important role of mitochondria in the eukaryotic cell has long been appreciated, but their exact composition and the biological processes taking place in mitochondria are not yet fully understood. The two main factors that slow down the progress in this field are inefficient recognition and imprecise annotation of mitochondrial proteins. Therefore, we developed a new computational tool, YimLoc, which effectively predicts mitochondrial proteins from genomic sequences. This tool integrates the strengths of existing predictors and yields higher performance than any individual predictor. We applied YimLoc to ~60 fungal genomes in order to address the controversy about the localization of beta oxidation in these organisms. Our results show that in contrast to previous studies, most fungal groups do possess mitochondrial beta oxidation. This work also revealed the diversity of beta oxidation in fungi, which correlates with their utilization of fatty acids as energy and carbon sources. Further, we conducted an investigation of the key component of the mitochondrial beta oxidation pathway, the acyl-CoA dehydrogenase (ACAD). We combined subcellular localization prediction with subfamily classification and phylogenetic inference of ACAD enzymes from 250 species covering all three domains of life. Our study suggests that ACAD genes are an ancient family with innovative evolutionary strategies to generate a large enzyme toolset for utilizing most diverse fatty acids and amino acids. Finally, to enable the prediction of mitochondrial proteins from data beyond genome sequences, we designed the tool TESTLoc that uses expressed sequence tags (ESTs) as input. TESTLoc performs significantly better than known tools. In addition to providing two new tools for subcellular localization designed for different data, our studies demonstrate the power of combining subcellular localization prediction with other in silico analyses to gain insights into the function of mitochondrial proteins. Most importantly, this work proposes clear hypotheses that are easily testable, with great potential for advancing our knowledge of mitochondrial metabolism.