The master's thesis is focused on study of specific protective proteins from animal products. Two different types of antimicrobial egg white proteins were studied in detail - antimicrobial protein ovotransferrin (conalbumin) and enzyme lysozyme. Ovotransferrin belongs to transferrin group of proteins and exhibits activities similar to milk protective protein lactoferrin. The main effects of ovotransferrin are antiviral, anticancer and immunomodulatory. Antimicrobial activity of ovotransferrin based on the possibility to bind iron is still a subject of interest. For comparison the second egg protein lysozyme (N-acetyl muramidglycan hydrolase) was used. Lysozyme is a hydrolytic enzyme which primary attack cell wall of bacteria. In the theoretical part of the thesis an overview of the specific antimicrobial proteins in selected animal products was introduced mainly focused on ovotransferrin and lysozyme. The experimental part of this work was focused on optimization of methods for the determination of antimicrobial activity, protein concentration and purity. For quantitative analysis of total proteins, optimized Hartree – Lowry spectrophotometric method was used. For the determination of molecular weight and purity SDS-PAGE was used and stained by Coomassie Brilliant Blue G250 and silver. In experimental part the real sample of egg white was compared with samples of lyophilized antimicrobial proteins and therapeutical pills supplied by industrial partner. Protein composition and purity of these preparative has been determined. Antimicrobial activity of ovotransferrin was studied on cultures of G+ bacterium Bacillus subtilis and for comparison on G– E. coli. Ovotransferrin showed antimicrobial effect only at very high concentrations of about 75 mg/ml (Bacillus subtilis) and 50 mg/ml (E coli) even with addition of high amount (100 mM) of hydrogen carbonate ions. The inhibitory effect was most evident in liquid media. On the other hand, lysozyme exhibited significant inhibitory activity from 0.3 mg/ml on gram positive bacteria. Inhibitory effect on E. coli was not observed. Another part of study was focused on isolation of ovotransferrin from egg white using gel permeation chromatography on Sephadex G100. As mobile phases 0.1 M phosphate buffer and 0.05 M Tris-HCl buffer were tested. By SDS-PAGE the purity of ovotransferin comparing to standard was evaluated. Finally, the encapsulation of ovotransferrin and lysozyme was tested. Ovotransferrin and lysozyme was encapsulated into liposome and chitosan particles. Particles stability, distribution and average size distribution were studied by dynamic light scattering and zeta potential measurement. The stability of particles in the model physiological conditions was studied too.

The thesis deals with the testing of amyloidogenicity of various carbon nanoparticles and polymers. The first part of the thesis provides the theoretical background of amyloidoses, a group of diseases in which proteins are stored in the insoluble form of amyloid. In addition, the theoretical part also deals with a general overview of nanomaterials and the most important methods. Several types of nanomaterials were tested within the thesis, so the part Results and Discussion was divided into two subchapters: 1) Carbon nanospecies and amyloid fibril formation, and 2) Polysaccharides, glycogen modifications and amyloid fibril formation. The first subchapter concerns the testing of four types of carbon nanoparticles (single-walled carbon nanotubes (SWNT), fullerenes (C60), carbon quantum dots (CDs) and nanodiamonds (NDs)). These materials were tested on a model system hen egg white lysozyme (HEWL). Using fluorescence measurements and transmission electron microscopy (TEM), the nanoparticles were ranked from the most to the least amyloidogenic as follows: NDs> control> C60> CDs> SWNT. The second subchapter deals with the effect of selected polysaccharides (glycogen (GG), mannan (MAN), phytoglycogen (PG)) and modified GG on amyloid fibril formation. These materials were tested on the HEWL model system,...

The theoretical part of this diploma thesis deals with molecularly imprinted polymers. Properties of the monomers and templates used for the polymerization are described. Part is devoted to the preparation of molecularly imprinted polymers and interactions leading to the formation of imprinted polymers. Imprinting technologies and strategies, template removal methods, detection methods, and the advantages and disadvantages of the molecular imprinting are included. Also the applications in various fields, focusing mainly on the area of imprinting proteins and pathogens are discussed in details. The experimental part deals with optimization of the preparation of a molecularly imprinted polymer based on dopamine subsequently used especially for the isolation and detection of Staphylococcus aureus and Enterococcus faecalis. The polymer was coated over a microscope slide, into the 96-well microplate and on a surface of magnetic particles. Fluorescence spectrometry and fluorescence microscopy were used for analyte detection. The developed technique was capable of isolating the target (Staphylococcus aureus and Enterococcus faecalis) at relatively low concentrations (1.103 CFU.ml-1).

This diploma thesis was focused on the study of lysozyme and lysozyme-like proteins, either of similar function (antibacterial) or molecular weight (14 - 17 kDa), of synanthropic acaroid mites. In general, animals utilize lysozymes for defensive (antimicrobial) or digestive purposes but also as a digestive enzyme. Some chitinases or other enzymes that act similarly to lysozyme can be utilized for similar purposes. Chitinases belong to house dust mite allergens. One of major mite are historically named lysozyme-like proteins which name relates to their size similar to lysozyme. Bacteriolytic activity has also 14.5 kDa (UniprotKB Q8MWR6) protein. The species selected for the study were domestic mites Dermatophagoides farinae, D. pteronyssinus and Lepidoglyphus destructor. Presence of lysozyme was detected by direct detection with polyclonal antibody using immunohistochemistry and dot blots. Immunohistochemistry proved presence of lysozyme epitopes in the feces of D. farinae, D pteronyssinus a L. destructor. Dot blot analysis demonstrated the presence of imunoreactivity of antibody in spent growth medium extracts (SGME) of all three species. This implies that lysozyme is synthesized in the midgut. The presence of lysozyme and lysozyme-like proteins was proved using 2D electrophoresis and MALDI TOF/TOF...

Milch dient der Versorgung neugeborener Säugetiere mit allen lebensnotwendigen Nährstoffen, wie Proteinen, Fetten, Kohlenhydraten, Vitaminen und Mineralstoffen. Insbesondere die Proteingruppe der Caseine, die in der Milch zum Großteil zu Caseinmicellen assoziiert vorliegen, stellen essentielle Aminosäuren bereit und transportieren große Mengen Calcium und Phosphor (Fox, 2008; Horne, 2008). Neben der Bedeutung als erste Nahrungsquelle für Neugeborene haben sich Milch und Milchprodukte zu einem der wichtigsten Handels- und Verarbeitungsgüter entwickelt. In Deutschland ist vorrangig der Konsum von Kuhmilch verbreitet. Zunehmend wird aber auch die Milch von Büffel, Schaf und Ziege direkt oder verarbeitet konsumiert (Fox, 2008; Töpel, 2016). Dabei unterscheidet sich die Zusammensetzung der Milch zwischen den verschiedenen Tierarten zum Teil beträchtlich. Diese Unterschiede betreffen nicht nur die Anteile der Hauptnährstoffe, sondern auch die Eigenschaften und die Zusammensetzung der Caseinmicellen (CM) (Fox, 2008). Die Eigenschaften und die Stabilität gegenüber einer Calciumkomplexierung wurden für bovine Caseinmicellen in der Literatur bereits ausführlich diskutiert (Horne, 1984; Banon & Hardy, 1992; Needs et al., 2000; O’Connell et al., 2001; Huppertz et al., 2004). Über die Micellen anderer Tierarten lagen zu Beginn der Untersuchungen hingegen kaum Informationen vor. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es deshalb, die Caseinmicellen aus der Milch der wiederkäuenden Paarhufer Kuh, Büffel, Schaf, Ziege und Kamel und der nicht wiederkäuenden Unpaarhufer Pferd und Esel sowie aus Humanmilch bezüglich Größe, Struktur, Zusammensetzung und Stabilität zu charakterisieren und daraus Erkenntnisse zum tierartspezifischen Micellaufbau abzuleiten. Hierzu wurden die Caseinmicellen mit Hilfe der Ultrazentrifugation von der Molke abgetrennt und in tierartspezifischem, synthetischem Milchultrafiltrate (SMUF) resuspendiert. Untersuchungen der hydrodynamischen Durchmesser mittels dynamischer Lichtstreuung zeigten, dass die CM der Nicht-Wiederkäuer Stute und Esel sowie des Kamels deutlich größer waren als die der Wiederkäuer Kuh, Büffel, Schaf und Ziege, wohingegen sich die humanen CM als die kleinsten zeigten. Mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM) konnten aufgrund der beobachteten unterschiedlichen Oberflächenstrukturen für einige Tierarten Hinweise hinsichtlich einer größen- und κ-Casein-abhängigen Ausbildung von κ Casein ‚bunches‘ oder einer ‚hairy layer‘ an der Oberfläche der kolloidalen Partikel erhalten werden. Anhand der Aminosäurezusammensetzung der micellaren Proteine konnte abgeleitet werden, dass bei allen Tierarten vor allem Phosphoserin sowie die hydrophoben Aminosäuren maßgeblich am Aufbau der CM beteiligt sein dürften. Hierbei wurden jedoch tierartspezifische Unterschiede festgestellt. Bei den Wiederkäuern wurde eine besonders starke Assoziation der Caseinmonomere über Phosphoserincluster vermutet, während bei den Nicht-Wiederkäuern und insbesondere bei den humanen CM auch hydrophobe Wechselwirkungen eine entscheidende Rolle spielen. Calcium und anorganischer Phosphor konnten als die bedeutendsten micellaren Salze identifiziert werden, die in besonders hohen Gehalten in den CM von Stute und Esel vorkamen. Humane Micellen wiesen deutlich niedrigere Mineralstoffgehalte auf, weshalb die Bedeutung der elektrostatischen Wechselwirkungen für die Verknüpfung der Caseinmonomere geringer eingeschätzt wurde als bei den weiteren untersuchten Tierarten. In Bezug auf die Stabilität gegenüber einer Calciumkomplexierung mit Ethylenglycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N\',N\'-tetraessigsäure (EGTA) unterschieden sich die CM der Tiere sehr deutlich voneinander. Instabile Micellen zeichneten sich durch eine starke Abnahme der Trübung, eine Zunahme des extra-micellaren Caseins sowie eine schneller einsetzende Verkleinerung des hydrodynamischen Durchmessers aus. Für die Micellstabilität ergab sich die folgende Reihenfolge: Kuh << Büffel < Ziege < Schaf < Kamel = Stute < Esel < Mensch. Caseinmicellen eignen sich, neben dem natürlichen Transport von Aminosäuren und Mineralstoffen, als Nanotransporter für bioaktive Substanzen wie Vitamin D2 (Semo et al., 2007), β-Carotin (Sáiz-Abajo et al., 2013), Curcumin (Sahu et al., 2008), Triclosan (Roach et al., 2009) oder auch dem antibakteriellen Enzym Lysozym (de Roos et al., 1998; Anema & de Kruif, 2013). Da zu Beginn der Untersuchungen ausschließlich Daten zur Beladung boviner Caseinmicellen mit Hühnereiweißlysozym (HEWL) verfügbar waren, sollte zunächst die Stabilität der tierartspezifischen Micellen und die Effektivität der Beladung mit Lysozym beurteilt werden. Zusätzlich sollte die antibakterielle Wirksamkeit der mit Lysozym beladenen Caseinmicellen verschiedener Säugetiere sowohl in vitro als auch in orientierenden Untersuchungen gegenüber Bakterien erfasst werden. Dabei konnte gezeigt werden, dass die CM aller untersuchten Tierarten mit HEWL beladen werden können. Hinsichtlich der Stabilität der CM sowie der Aufnahmekapazität wurden jedoch tierartspezifische Unterschiede festgestellt. Allgemein konnten die CM aus Wiederkäuer- und aus Humanmilch als stabiler beschrieben werden, wobei die HEWL-Aufnahme bei den CM der Wiederkäuer höher war. Die lytische Enzymaktivität des HEWL in vitro veränderte sich infolge der Micellassoziation für die meisten untersuchten Tierarten im Vergleich zu frei vorliegendem HEWL nicht. Für die antibakterielle Wirksamkeit gegenüber Bacillus subtilis wurden hingegen Unterschiede zwischen den verschiedenen Tierarten beobachtet. Für die HEWL-haltigen CM von Büffel und Ziege ergaben sich die gleichen Wachstumsverzögerungen wie bei freiem HEWL in SMUF. Im Gegensatz dazu wurde die bakteriostatische Wirkung durch die HEWL-Micellen von Kuh, Kamel und Mensch inhibiert, durch die von Schaf, Stute und Esel hingegen verstärkt. Neben der Funktionalisierung der Caseinmicellen durch den Einbau bioaktiver Substanzen, können die Partikel auch chemisch modifiziert werden. Eine Möglichkeit stellt hierbei die Glykierung dar. Glykierungsreaktionen zwischen den Carbonylgruppen reduzierender Zucker und Aminosäureseitenketten wurden für nicht-micellare Caseine in einer Vielzahl an Studien untersucht (Zin El-Din & Aoki, 1993; Morales & van Boekel, 1996; Pellegrino et al., 1999; Lima et al., 2009; Akıllıoğlu & Gökmen, 2014). Über den Einfluss der micellaren Anordnung der Caseine auf die Glykierungsreaktionen war nur wenig bekannt. Erkenntnisse diesbezüglich könnten einen Beitrag zur Aufklärung des Aufbaus der Caseinmicellen leisten. Die Untersuchungen zeigten, dass bei der Erhitzung von micellaren und nicht-micellaren Caseinen für 0 - 4 h bei 100 °C in Gegenwart der reduzierenden Zucker Lactose und Glucose hauptsächlich die frühe Phase der Maillard Reaktion abläuft. Die Bildung der Amadori-Produkte erfolgte dabei in den CM und im nicht micellaren Natrium-Caseinat (NaCas) in gleichem Maße. Hieraus wurde eine ähnliche Zugänglichkeit der reaktiven Aminosäureseitenketten in den micellaren und nicht micellaren Caseinen geschlussfolgert. Signifikante Unterschiede konnten hinsichtlich der Produktbildung der späten Phase der Maillard-Reaktion beobachtet werden. Während Nε-Carboxymethyllysin (CML) im NaCas in höheren Gehalten detektiert wurde, trat in den CM eine verstärkte Pyrralin-Bildung auf. Zudem bewirkte eine Inkubation in Gegenwart von Lactose eine bevorzugte CML-Bildung, wohingegen mit Glucose Pyrralin in höheren Mengen gebildet wurde. Die Maillard-induzierten Proteinquervernetzungsprodukte Glyoxal-Lysin-Dimer und Pentosidin wurden im Vergleich zum zuckerunabhängig gebildeten Lysinoalanin in deutlich geringeren Gehalten erfasst. Hohe Oligomerisierungsgrade zwischen 50 und 84 % zeigten jedoch, dass die Proteinquer-vernetzungen, die im Zuge der Glykierung entstehen, quantitativ von größerer Bedeutung sind. Anhand der Bestimmung der hydrodynamischen Durchmesser und mit Hilfe von REM-Aufnahmen konnte eine weitgehend intra-micellare Proteinquervernetzung abgeleitet werden. Die Ausbildung intra-micellarer Oligomere bewirkte dabei eine höhere Micellstabilität gegenüber einem Calciumentzug durch EGTA. Die vorliegenden Untersuchungen deuten darauf hin, dass die hydrophilen Zuckermoleküle über die von Dalgleish (2011) vorgeschlagenen Wasserkanäle in die CM eindringen und die frühe Phase der Maillard-Reaktion anschließend vor allem in diesen Regionen erfolgt. Die weiteren Phasen der Maillard-Reaktion könnten dann, durch ein tieferes Eindringen der reaktiven Komponenten, zunehmend auch in dehydratisierteren Bereichen ablaufen. Bezüglich des Aufbaus der Caseinmicellen unterstützen die in dieser Arbeit gewonnen Ergebnisse die Vorstellungen des Internal Structure Modells.

Antimicrobial proteins contained in the albumen represent maternal effects, including the non- genetic component allocated into the egg during its oogenesis. Especially for species, whose broods are exposed to environmental influences until completation, these proteins play a crucial role in the viability of embryos due to their potential to influence the risk of microbial infection, which is considered one of the main causes of reduced hatchability. Also, it is assumed that these proteins, beacause of their specific traits, may influence phenotype of chicks, especially its size and immunity in the early postembryonal stage. In my thesis I focused on three antimicrobial proteins of avian egg white - avidin, lysozyme and ovotransferrin, which vary in their antimicrobial activity. For a better understanding of causal relationships between the concentrations of these proteins in the albumen and their effect on hatching success or offspring phenotype, a series of manipulation experiments and correlative measurements were performed. These experiments were held on the eggs of two precocial species - Japanese Quail (Coturnix japonica) and Mallard (Anas platyrhynchos). Our results indicate a crucial role of antimicrobial proteins in reducing the risk of bacterial infection and their natural concentration...

Milch dient der Versorgung neugeborener Säugetiere mit allen lebensnotwendigen Nährstoffen, wie Proteinen, Fetten, Kohlenhydraten, Vitaminen und Mineralstoffen. Insbesondere die Proteingruppe der Caseine, die in der Milch zum Großteil zu Caseinmicellen assoziiert vorliegen, stellen essentielle Aminosäuren bereit und transportieren große Mengen Calcium und Phosphor (Fox, 2008; Horne, 2008). Neben der Bedeutung als erste Nahrungsquelle für Neugeborene haben sich Milch und Milchprodukte zu einem der wichtigsten Handels- und Verarbeitungsgüter entwickelt. In Deutschland ist vorrangig der Konsum von Kuhmilch verbreitet. Zunehmend wird aber auch die Milch von Büffel, Schaf und Ziege direkt oder verarbeitet konsumiert (Fox, 2008; Töpel, 2016). Dabei unterscheidet sich die Zusammensetzung der Milch zwischen den verschiedenen Tierarten zum Teil beträchtlich. Diese Unterschiede betreffen nicht nur die Anteile der Hauptnährstoffe, sondern auch die Eigenschaften und die Zusammensetzung der Caseinmicellen (CM) (Fox, 2008). Die Eigenschaften und die Stabilität gegenüber einer Calciumkomplexierung wurden für bovine Caseinmicellen in der Literatur bereits ausführlich diskutiert (Horne, 1984; Banon & Hardy, 1992; Needs et al., 2000; O’Connell et al., 2001; Huppertz et al., 2004). Über die Micellen anderer Tierarten lagen zu Beginn der Untersuchungen hingegen kaum Informationen vor. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es deshalb, die Caseinmicellen aus der Milch der wiederkäuenden Paarhufer Kuh, Büffel, Schaf, Ziege und Kamel und der nicht wiederkäuenden Unpaarhufer Pferd und Esel sowie aus Humanmilch bezüglich Größe, Struktur, Zusammensetzung und Stabilität zu charakterisieren und daraus Erkenntnisse zum tierartspezifischen Micellaufbau abzuleiten. Hierzu wurden die Caseinmicellen mit Hilfe der Ultrazentrifugation von der Molke abgetrennt und in tierartspezifischem, synthetischem Milchultrafiltrate (SMUF) resuspendiert. Untersuchungen der hydrodynamischen Durchmesser mittels dynamischer Lichtstreuung zeigten, dass die CM der Nicht-Wiederkäuer Stute und Esel sowie des Kamels deutlich größer waren als die der Wiederkäuer Kuh, Büffel, Schaf und Ziege, wohingegen sich die humanen CM als die kleinsten zeigten. Mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM) konnten aufgrund der beobachteten unterschiedlichen Oberflächenstrukturen für einige Tierarten Hinweise hinsichtlich einer größen- und κ-Casein-abhängigen Ausbildung von κ Casein ‚bunches‘ oder einer ‚hairy layer‘ an der Oberfläche der kolloidalen Partikel erhalten werden. Anhand der Aminosäurezusammensetzung der micellaren Proteine konnte abgeleitet werden, dass bei allen Tierarten vor allem Phosphoserin sowie die hydrophoben Aminosäuren maßgeblich am Aufbau der CM beteiligt sein dürften. Hierbei wurden jedoch tierartspezifische Unterschiede festgestellt. Bei den Wiederkäuern wurde eine besonders starke Assoziation der Caseinmonomere über Phosphoserincluster vermutet, während bei den Nicht-Wiederkäuern und insbesondere bei den humanen CM auch hydrophobe Wechselwirkungen eine entscheidende Rolle spielen. Calcium und anorganischer Phosphor konnten als die bedeutendsten micellaren Salze identifiziert werden, die in besonders hohen Gehalten in den CM von Stute und Esel vorkamen. Humane Micellen wiesen deutlich niedrigere Mineralstoffgehalte auf, weshalb die Bedeutung der elektrostatischen Wechselwirkungen für die Verknüpfung der Caseinmonomere geringer eingeschätzt wurde als bei den weiteren untersuchten Tierarten. In Bezug auf die Stabilität gegenüber einer Calciumkomplexierung mit Ethylenglycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N\',N\'-tetraessigsäure (EGTA) unterschieden sich die CM der Tiere sehr deutlich voneinander. Instabile Micellen zeichneten sich durch eine starke Abnahme der Trübung, eine Zunahme des extra-micellaren Caseins sowie eine schneller einsetzende Verkleinerung des hydrodynamischen Durchmessers aus. Für die Micellstabilität ergab sich die folgende Reihenfolge: Kuh << Büffel < Ziege < Schaf < Kamel = Stute < Esel < Mensch. Caseinmicellen eignen sich, neben dem natürlichen Transport von Aminosäuren und Mineralstoffen, als Nanotransporter für bioaktive Substanzen wie Vitamin D2 (Semo et al., 2007), β-Carotin (Sáiz-Abajo et al., 2013), Curcumin (Sahu et al., 2008), Triclosan (Roach et al., 2009) oder auch dem antibakteriellen Enzym Lysozym (de Roos et al., 1998; Anema & de Kruif, 2013). Da zu Beginn der Untersuchungen ausschließlich Daten zur Beladung boviner Caseinmicellen mit Hühnereiweißlysozym (HEWL) verfügbar waren, sollte zunächst die Stabilität der tierartspezifischen Micellen und die Effektivität der Beladung mit Lysozym beurteilt werden. Zusätzlich sollte die antibakterielle Wirksamkeit der mit Lysozym beladenen Caseinmicellen verschiedener Säugetiere sowohl in vitro als auch in orientierenden Untersuchungen gegenüber Bakterien erfasst werden. Dabei konnte gezeigt werden, dass die CM aller untersuchten Tierarten mit HEWL beladen werden können. Hinsichtlich der Stabilität der CM sowie der Aufnahmekapazität wurden jedoch tierartspezifische Unterschiede festgestellt. Allgemein konnten die CM aus Wiederkäuer- und aus Humanmilch als stabiler beschrieben werden, wobei die HEWL-Aufnahme bei den CM der Wiederkäuer höher war. Die lytische Enzymaktivität des HEWL in vitro veränderte sich infolge der Micellassoziation für die meisten untersuchten Tierarten im Vergleich zu frei vorliegendem HEWL nicht. Für die antibakterielle Wirksamkeit gegenüber Bacillus subtilis wurden hingegen Unterschiede zwischen den verschiedenen Tierarten beobachtet. Für die HEWL-haltigen CM von Büffel und Ziege ergaben sich die gleichen Wachstumsverzögerungen wie bei freiem HEWL in SMUF. Im Gegensatz dazu wurde die bakteriostatische Wirkung durch die HEWL-Micellen von Kuh, Kamel und Mensch inhibiert, durch die von Schaf, Stute und Esel hingegen verstärkt. Neben der Funktionalisierung der Caseinmicellen durch den Einbau bioaktiver Substanzen, können die Partikel auch chemisch modifiziert werden. Eine Möglichkeit stellt hierbei die Glykierung dar. Glykierungsreaktionen zwischen den Carbonylgruppen reduzierender Zucker und Aminosäureseitenketten wurden für nicht-micellare Caseine in einer Vielzahl an Studien untersucht (Zin El-Din & Aoki, 1993; Morales & van Boekel, 1996; Pellegrino et al., 1999; Lima et al., 2009; Akıllıoğlu & Gökmen, 2014). Über den Einfluss der micellaren Anordnung der Caseine auf die Glykierungsreaktionen war nur wenig bekannt. Erkenntnisse diesbezüglich könnten einen Beitrag zur Aufklärung des Aufbaus der Caseinmicellen leisten. Die Untersuchungen zeigten, dass bei der Erhitzung von micellaren und nicht-micellaren Caseinen für 0 - 4 h bei 100 °C in Gegenwart der reduzierenden Zucker Lactose und Glucose hauptsächlich die frühe Phase der Maillard Reaktion abläuft. Die Bildung der Amadori-Produkte erfolgte dabei in den CM und im nicht micellaren Natrium-Caseinat (NaCas) in gleichem Maße. Hieraus wurde eine ähnliche Zugänglichkeit der reaktiven Aminosäureseitenketten in den micellaren und nicht micellaren Caseinen geschlussfolgert. Signifikante Unterschiede konnten hinsichtlich der Produktbildung der späten Phase der Maillard-Reaktion beobachtet werden. Während Nε-Carboxymethyllysin (CML) im NaCas in höheren Gehalten detektiert wurde, trat in den CM eine verstärkte Pyrralin-Bildung auf. Zudem bewirkte eine Inkubation in Gegenwart von Lactose eine bevorzugte CML-Bildung, wohingegen mit Glucose Pyrralin in höheren Mengen gebildet wurde. Die Maillard-induzierten Proteinquervernetzungsprodukte Glyoxal-Lysin-Dimer und Pentosidin wurden im Vergleich zum zuckerunabhängig gebildeten Lysinoalanin in deutlich geringeren Gehalten erfasst. Hohe Oligomerisierungsgrade zwischen 50 und 84 % zeigten jedoch, dass die Proteinquer-vernetzungen, die im Zuge der Glykierung entstehen, quantitativ von größerer Bedeutung sind. Anhand der Bestimmung der hydrodynamischen Durchmesser und mit Hilfe von REM-Aufnahmen konnte eine weitgehend intra-micellare Proteinquervernetzung abgeleitet werden. Die Ausbildung intra-micellarer Oligomere bewirkte dabei eine höhere Micellstabilität gegenüber einem Calciumentzug durch EGTA. Die vorliegenden Untersuchungen deuten darauf hin, dass die hydrophilen Zuckermoleküle über die von Dalgleish (2011) vorgeschlagenen Wasserkanäle in die CM eindringen und die frühe Phase der Maillard-Reaktion anschließend vor allem in diesen Regionen erfolgt. Die weiteren Phasen der Maillard-Reaktion könnten dann, durch ein tieferes Eindringen der reaktiven Komponenten, zunehmend auch in dehydratisierteren Bereichen ablaufen. Bezüglich des Aufbaus der Caseinmicellen unterstützen die in dieser Arbeit gewonnen Ergebnisse die Vorstellungen des Internal Structure Modells.

Aim: The present study aimed to evaluate the impact of caries activity on the key enzymes and the ultrastructure of the in situ pellicle. Methods: Pellicle formation was performed on bovine enamel slabs. Intraoral exposure (3, 30, and 120 min) was accomplished by 14 caries-active (DMFS: 22.7 ± 12.1) and 13 caries-inactive (DMFS: 1.5 ± 1.8) individuals. The enzyme activities (lysozyme, peroxidase, α-amylase, glycosyltransferase [GTF]) in the in situ pellicle and resting saliva of all participants were analyzed directly after oral exposure. In addition, a simultaneous visualization of these enzymes, extracellular glucans, and adherent bacteria was carried out. Fluorescent patterns were analyzed with fluorescence labeling and 4 ′ ,6-diamidino-2-phenylindole/concanavalin A staining. In addition, the distribution of GTF B, C, and D and the ultrastructure of the pellicle were examined by gold immunolabeling and transmission electron microscopy with selected samples. Results: Enzyme activities of amylase, peroxidase, lysozyme, and GTF were detected on all enamel slabs in an active conformation. Neither exposure time nor caries activity had an impact on the enzyme activities. Gold immunolabeling indicated that the pellicle of caries-active subjects tends to more GTF D molecules. The pellicles of caries-inactive and -active individuals revealed a similar ultrastructural pattern. Conclusion: The enzyme activities as well as the pellicle’s ultrastructure are of high similarity in cariesactive and -inactive subjects. Thereby, oral exposure time has no significant influence. This reflects a high uniformity during the initial phase of bioadhesion (3–120 min) concerning enzymatic functions. However, there is a tendency towards more GTF D in caries-active individuals.

Size exclusion chromatography (SEC) separates molecules based on their actual size rather than their molecular weight. This indicates that the smaller a molecule is, the longer it will be held in the column since it can penetrate the pores more effectively than a bigger molecule, resulting in a longer retention time, whereas the larger molecule has a shorter retention time. In order to achieve reliable and accurate results the asymmetry factor of the packed columns should be between 0.6-1.4. The aim for this project was to examine whether or not the batch variations of the base matrix used to derive WorkBeads™ 40S and 40Q displayed either hydrophobic or hydrophilic interactions by running different types of proteins through columns packed with the base matrices. The project was performed using an ÄKTA explorer equipped with an ultraviolet (UV) detector and a refractive index detector (RID). The data was gathered and analyzed with the Unicorn™ by Cytiva. The results from the first experiments showed that lysozyme did not elute as expected or not at all, thus leading to a concern that the there might be some hydrophobic interactions in the base matrix, which is a porous media in the form of spherical particles that have been selected for their physical stability and inertness (lack of reactivity and adsorptive properties), and lysozyme. With this suspicion in mind, the different batches of the base matrix underwent hydrophobic interaction chromatography (HIC), where the results may be interpreted in a way that there might electrostatic interactions instead of hydrophobic interactions. However, due to the gel not being suitable for HIC the results were unreliable. By subsequently running lysozyme and other proteins through the columns at different NaCl concentrations the results showed consistent elution at NaCl concentrations &gt; 150 mM, yet inconsistent at a concentration of 150 mM for lysozyme. The elution order by size showed that although lysozyme has a larger hydrodynamic radius (Rh) than cytochrome c it eluted later, which is theoretically incorrect, but it might be owing to some of the base matrix's characteristics or the lysozyme's dual nature of expressing both hydrophobic and hydrophilic interactions on the base matrix. Because of the inconsistent results from lysozyme, another experiment just at 150 mM was conducted where lysozyme did elute consistently with a KD value &lt; 1.  Lastly, a titration was performed on the base matrix where some of it was brominated and some of it was not, which was the reference. The results showed that there could be hydrophobic interactions on the brominated sample and hydrophilic interactions on the reference sample. However, what is more likely is that lysozyme is an unreliable protein to use to determine hydrophobicity on this type of gel. / Size exclusion chromatography (SEC) separerar molekyler baserat på deras faktiska storlek snarare än deras molekylvikt. Detta indikerar att ju mindre en molekyl är, desto längre kommer den att hållas i kolonnen eftersom den kan tränga sig in i porerna mer effektivt än en större molekyl, vilket resulterar i en längre retentionstid, medan den större molekylen har en kortare retentionstid. För att uppnå tillförlitliga och nogranna resultat bör asymmetrifaktorn hos de packade kolonnerna vara mellan 0.6-1.4. Syftet med detta projekt var att undersöka huruvida batchvariationerna av basmatrisen som användes för att ta fram WorkBeads™ 40S och 40Q uppvisade antingen hydrofoba eller hydrofila interaktioner genom att köra olika typer av proteiner genom kolumner packade med basmatriserna. Projektet utfördes med en ÄKTA explorer utrustad med en ultraviolett (UV) detektor och en refractive index detector (RID). Data samlades in och analyserades med Unicorn™ av Cytiva. Resultaten från de första experimenten visade att lysozym inte eluerade som förväntat eller inte alls, vilket ledde till en oro för att det kan finnas vissa hydrofoba interaktioner i basmatrisen, som är ett poröst medium i form av sfäriska partiklar som har har valts ut för deras fysikaliska stabilitet och inerthet (brist på reaktivitet och adsorptiva egenskaper), och lysozym. Med denna misstanke i åtanke genomgick de olika bactherna av basmatrisen hydrofob interaktionskromatografi (HIC), där resultaten kan tolkas på ett sätt att det kan förekomma elektrostatiska interaktioner istället för hydrofoba interaktioner. Men på grund av att gelen inte var lämplig för HIC var resultaten opålitliga. Genom att efteråt köra lysozym och andra proteiner genom kolonnerna vid olika NaCl-koncentrationer visade resultaten konsekvent eluering vid NaCl-koncentrationer &gt; 150 mM, men ändå inkonsekventa vid en koncentration av 150 mM för lysozym. Elueringsordningen efter storlek visade att även om lysozym har en större hydrodynamisk radie (Rh) än cytokrom c, eluerade det senare, vilket är teoretiskt inkorrekt, men det kan bero på några av basmatrisens egenskaper eller lysozymets dubbla natur att uttrycka både hydrofoba och hydrofila interaktioner på basmatrisen. På grund av de inkonsekventa resultaten från lysozym, utfördes ett annat experiment enbart vid 150 mM där lysozym eluerade konsekvent med ett KD-värde &lt; 1. Slutligen utfördes en titrering på basmatrisen där en del av den var bromerad och en del av den inte, vilket var referensen. Resultaten visade att det kunde finnas hydrofoba interaktioner på det bromerade provet och hydrofila interaktioner på referensprovet. Men vad som är mer troligt är att lysozym är ett opålitligt protein att använda för att bestämma hydrofobicitet på denna typ av gel.

Untersuchungen zur Reaktion von Proteinen während einer Hochdruckbehandlung (HD) ermöglichen ein besseres Verständnis der Reaktivität und Struktur auf molekularer Ebene. In der vorliegenden Arbeit wurde die enzymatische Oligomerisierung von Hühnereiweißlysozym (HEWL) mithilfe der druckstabilen mikrobiellen Transglutaminase (mTGase) unter HD untersucht. Die resultierenden Oligomere wurden anschließend hinsichtlich ihrer strukturellen und funktionellen Eigenschaften charakterisiert. Vergleichende Untersuchungen wurden mit dem evolutionsbiologisch verwandten Protein, dem α-Lactalbumin durchgeführt. Abschließend erfolgten orientierende Studien zur nicht-enzymatischen Vernetzung von HEWL und ausgewählten Milchproteinen, bei welchen eine kovalente Verknüpfung über vergleichbare Isopeptide nachgewiesen werden konnte. Kompakte, globuläre Proteine, wie das untersuchte HEWL stellten unter Normaldruck keine Substrate für die mTGase dar. Auch war eine enzymatische Vernetzung nach erfolgter Hochdruckbehandlung aufgrund der Reversibilität der druckinduzierten Auffaltung nicht möglich. So wurde HEWL nur bei simultaner Behandlung mit mTGase und hohem hydrostatischem Druck zu Homooligomeren vernetzt. Neben einem geeigneten Puffersystem wurden der pH-Wert, die Inkubationszeit, die Temperatur, der hydrostatische Druck, die Enzymaktivität der mTGase und die Proteinkonzentration des Lysozyms verändert. Abhängig von den Reaktionsbedingungen wurden Produkte mit stark variierenden Vernetzungsgraden erhalten, wobei eine maximale Oligomerisierung von zirka 75% aus einer 3%igen HEWL-Probe in Tris-HCl-Puffer bei pH 7,5 mit 160 U mTGase/g Protein über 30 min, 600 MPa und 40°C erreicht wurde. Zudem erfolgte eine Kategorisierung aller resultierenden Proben anhand ihres mittels Gelelektrophorese bestimmten Vernetzungsgrades in drei Untergruppen: LMW (niedrig vernetzt, 0 - 30%), MMW (mittel vernetzt, 30 - 60%) und HMW (hoch vernetzt, 60 - 100%). In den so vernetzten Proben wurden das reaktionsspezifisch gebildete Isopeptid N ε (γ L Glutamyl)-L-Lysin (Glu_Lys) nachgewiesen und die beteiligten reaktiven Aminosäuren identifiziert. Die Bestimmung von Glu_Lys, welches für die kovalenten Verknüpfungen verantwortlich ist, erfolgte nach enzymatischer Hydrolyse am Aminosäureanalysator mit Ninhydrin-Nachsäulen-Derivatisierung. Eine erste Abschätzung des Isopeptid¬gehaltes zeigte zudem, dass es bei der Oligomerisierung sowohl zu inter- als auch intra¬molekularer Vernetzung kam. Der minimal notwendige Gehalt an Cross-Link-Aminosäuren, [CLAA]min lag zum Teil um den Faktor zwei unter dem Gehalt des quantifizierten Glu_Lys. Anschließend konnte nach tryptischem Verdau über die RP-HPLC/ESI-TOF-MS für die gering vernetzten Proben (LMW) genau eine definierte kovalente Verknüpfungsstelle ermittelt werden. Für die MMW- und HMW-Proben wurden fünf bzw. sechs Peptidfragmente detektiert. Bei den LMW-Proben wurde Lys1 mit Gln121 vernetzt. Den höher oligomerisierten Proben konnten die Lysinreste Lys1, Lys13, Lys116 und die Glutaminreste Gln41, Gln57, Gln121 zugeordnet werden. Somit gelang eine erste strukturelle Aufklärung der Vernetzungsprodukte. Der Aufbau der Oligomere läuft demnach zuerst gerichtet und linear ab. Insbesondere bei höheren Temperaturen und Enzymaktivitäten werden jedoch ungeordnete Strukturen gebildet. Die einzelnen Vernetzungsprodukte scheinen aufgrund der Lage der reaktiven Aminosäuren im HEWL-Molekül über mehrere intermolekulare Bindungen eine variierende Struktur auszubilden. Eine Quantifizierung der einzelnen Isopeptide erfolgte nicht, orientierende MS-Untersuchungen lassen aber vermuten, dass auch hier bevorzugte Reaktionsorte existieren. Die vernetzten Proben wurden nachfolgend über Ammoniumsulfatfällung konzentriert und mittels Gelpermeationschromatographie (GPC) fraktioniert. Die Ausbeuten der GPC waren sehr gering. Eine Fraktionierung in einzelne, selektiv verknüpfte Oligomere wurde nicht erreicht. Die enzymatisch oligomerisierten Proben sowie ausgewählte GPC-Fraktionen mit höheren Oligomeren wurden hinsichtlich funktioneller und struktureller Konsequenzen untersucht. Begonnen wurde dabei mit der lytischen Enzymaktivität des HEWL gegen Zellwände des Micrococcus lysodeikticus. Eine abnehmende bzw. verbleibende Lyseaktivität korrelierte mit einer zunehmenden Oberflächen¬hydrophobität der Oligomerengemische. Beide Größen verhielten sich indirekt proportional zueinander. Während der hydrophobe Kern des Moleküls mit steigender Oligomerisierungsrate freigelegt wurde, senkte sich die Lyseaktivität bis auf null ab. Eine räumliche Deformation oder Barriere entstand mutmaßlich im oder in der Nähe des reaktiven Zentrums (Glu35 und Asp52) des Lysozyms, so dass der Enzym-Substrat-Komplex nicht mehr ausgebildet werden konnte. Die Untersuchung der Veränderung sekundärer und tertiärer Strukturbestandteilte erfolgte mithilfe der Zirkular-Dichroismus-Spektroskopie. Gleichwohl für die Tertiärstruktur keine großen Veränderungen aufgezeigt wurden, ist für die Sekundärstruktur mit zunehmendem Vernetzungsgrad eine Abnahme der α-Helices und eine Zunahme von ungeordneten und β Faltblatt-Bereichen detektiert worden. Es konnte daher die unter Hochdruck bekannte Auffaltung des HEWL über die enzymatische Vernetzung derart stabilisiert werden, dass eine vollständige Rückfaltung nicht mehr gegeben war. Das Fibrillierungsverhalten der oligomerisierten Proben im Sauren im Vergleich zum unbehandelten HEWL stellte eine weitere Charakterisierungsmöglichkeit dar. Die Analyse der inkubierten Proben erfolgte mithilfe dreier photometrischer Methoden (Umsetzung mit den Reagenzien 8-Anilino-1-naphtalinsulfonsäure, Kongorot oder Thioflavin T). Die fibrillierten Proben wurden zudem transmissionselektronenmikroskopisch (TEM) untersucht. Mit zunehmender Vernetzung war dabei eine abnehmende Fibrillierungsneigung zu beobachten, welche gut strukturell zu erklären ist, da die zusätzlichen, kovalenten Isopeptidbindungen die Proteinmoleküle gegen eine saure Auffaltung stabilisieren. Eine Auffaltung ist jedoch die Grundvoraussetzung für eine Assoziation und Bildung in-vitro-induzierter, amyloider Strukturen. Ferner wurde das antimikrobielle Verhalten der Präparate gegen grampositive und -negative Mikroorganismen getestet. Unbehandeltes Lysozym zeigt grundsätzlich gegenüber grampositiven Mikroorganismen eine gute antimikrobielle Aktivität. Eingesetzt wurden der Agardiffusions- und der bakterielle Hemmtest (Trübungsassay). Hierbei zeigten alle geprüften Proben keine Wirkung gegenüber gramnegativen Bakterien. Die antimikrobielle Wirkung gegenüber den grampositiven Mikroorganismen variierte stark. Das Phänomen der erhöhten Sensibilität gegenüber ausgewählten Bakterienstämmen im niederkonzentrierten Bereich wurde für Bacillus subtilis (grampositiv) und die mittel- bzw. hochvernetzten Proben im Vergleich zu unbehandelten HEWL (je 0,00625% Probe, w/v) reproduzierbar nachgewiesen. Auf die umfassende Charakterisierung der enzymatisch vernetzten HEWL-Proben folgten orientierende Vergleichsstudien mit dem evolutionsbiologisch verwandten α Lactalbumin (α-LA). Die enzymatische Oligomerisierung konnte für das Molkenprotein dabei im Gegensatz zum HEWL bereits unter Atmosphärendruck erzielt werden. Die Vernetzungsraten betrugen, unabhängig von den untersuchten Rahmenparametern aber abhängig vom Calciumgehalt, zirka 35% (mit Ca) bis 72% (ohne Ca). Das α-LA als Calcium-bindendes Protein wurde somit durch die Abwesenheit des Metallions derart destabilisiert, dass es für die mTGase besser umsetzbar wurde. Die im Vergleich zum Lysozym vermehrt enthaltenen potentiell reaktiven Aminosäuren (doppelt so viel Lys und Gln) trugen ebenfalls zu einer stärkeren Oligomerisierung bei. Abschließend erfolgten Studien zu nicht-enzymatischen, vakuuminduzierten Kondensations-reaktionen. Dabei wurde trockenes HEWL im Vakuum thermisch induziert vernetzt. Die Methode ist in der Literatur als Zero-Length-Cross-Linking (ZLCL) beschrieben. Die Untersuchung der Parameter Vakuum, Temperatur, pH-Wert und Zyklenzahl erfolgte an dem globulären Protein. Dieses konnte unter nicht denaturierenden Bedingungen bis zum Di- und Trimer vernetzt werden. Weitere Milchproteinproben (ein Molkenproteinisolat und β-Casein) wurden nur exemplarisch unter Standardbedingungen untersucht. Hierbei wurde das Molkenproteinisolat deutlich besser als HEWL und das β-Casein bei 85°C über je 24 h und Einsatz von Vakuum am stärksten oligomerisiert. Die gute Umsetzung des β-Caseins ist dabei auf die fehlende Tertiär- und Sekundärstruktur zurückzuführen. Zum Teil entstanden auch Casein-Polymere, welche nicht mehr elektrophoresegängig waren. Die beteiligten Isopeptide wurden analog zu den enzymatisch vernetzten Proben über die Aminosäureanalytik nachgewiesen. Es konnte das Isopeptid N-ε-(β-Aspartyl-)Lysin (Asp_Lys) neben Lysinoalanin (LAL), aber kein Glu_Lys in HEWL nachgewiesen werden. Beide Isopeptide (Asp_Lys und Glu_Lys) sowie LAL sind dagegen im β Casein gebildet worden. Der Einfluss struktureller Gegebenheiten auf die Reaktionsfähigkeit der Proteine konnte folglich eindeutig belegt werden.