Im Rahmen dieser Arbeit ist es durch die kombinierte Anwendung von P-31 Flüssigkeits (HR)- NMR-Spektroskopie sowie dynamischer Lichtstreuung (DLS) gelungen, die supramolekulare Struktur von mizellarem Casein aus ultrahocherhitzter (UHT) Milch unter dem Einfluss einer enzymatischen Vernetzung mittels mikrobieller Transglutaminase (mTG) zu charakterisieren. Die P-31 HR NMR-Spektroskopie erweist sich dabei als hervorragende Methode, um sowohl den Einbau von Casein aus dem Milchserum in die mizellaren Aggregate durch die enzymatische Reaktion als auch die bevorzugte mTG Vernetzung des beta-Caseins nachzuweisen. Durch die Kombination von P-31 HR NMR-Spektroskopie und Messungen der dynamischen Lichtstreuung war es weiterhin möglich, das Vorliegen vernetzter Caseinaggregate in Dispersionen mTG-behandelter Caseine zu belegen und besonders den Anteil an nicht vernetztem Casein „sichtbar“ zu machen, der durch EDTA-Zugabe aus den mTG-vernetzten Caseinnetzwerken freigesetzt wird. Es zeigt sich, dass die Caseinnetzwerke nach der EDTA-Behandlung eine geringere Proteindichte als mizellares Casein aufweisen, da sie nur ca. 20 % des Serinphosphats des mizellaren Caseins enthalten. P-31 Festkörper-NMR-spektroskopische Messungen legen außerdem nahe, dass die Beweglichkeit des phosphorylierten Ser149-Restes des kappa-Caseins in der äußeren Schicht der mizellaren Caseinaggregate durch die mTG-Behandlung nicht wesentlich verändert wird. Um die erhaltenen Caseinnetzwerke im Hinblick auf ihr Anwendungspotential zu untersuchen, wurden sie als Proteinkomponente bei der biomimetischen Calciumphosphatfällung sowie als Trägerstrukturen für bioaktives Lysozym verwendet. Durch den Einsatz von Caseinnetzwerken als Fällungsmedium während der Präzipitation von Calciumphosphat (CaP) ist es gelungen, eine hydratisierte, apatitische Phase zu stabilisieren, die sowohl ungeordnete als auch kristalline Bereiche enthält und damit strukturelle Ähnlichkeit zu biologisch und besonders biomimetisch gebildetem Apatit besitzt. Die in den Präzipitaten ebenfalls vorhandenen Phosphoratome in einer relativ ungeordneten OCP (Octacalciumphosphat)-ähnlichen Umgebung stehen höchstwahrscheinlich mit der apatitischen Phase in räumlich engem Kontakt und sind damit entweder Bestandteil dieser Phase oder befinden sich in einer getrennten Phase, die jedoch mit der apatitischen Phase in Form eines Nanokomposits mit sehr kleinen, eng benachbarten Kristalliten vorliegt. Bei der Fällung des Caseinnetzwerk/CaP-Präzipitats wird ebenfalls eine Dicalciumphosphat-Dihydrat (DCPD)-Phase gebildet. Diese ist separiert von den anderen CaP-Phasen und tritt in wesentlich geringerem Maße auf als in einem reinen CaP-Präzipitat, das ohne Proteinkomponente gefällt wurde. Damit konnte gezeigt werden, dass unter Bedingungen, bei denen ohne Proteinkomponente größtenteils DCPD entsteht, die Caseinnetzwerke eine apatitische Phase stabilisieren, die strukturelle Ähnlichkeit zu biologisch und biomimetisch gebildetem Apatit aufweist. Die qualitativ gleichen Ergebnisse konnten für vergleichsweise untersuchtes unvernetztes Casein gefunden werden. Die Caseinnetzwerke zeigen jedoch in Bezug auf die apatitische Phase einen stärkeren Stabilisierungseffekt als unvernetztes Casein. Es ist denkbar, dass dies unter anderem darauf zurückzuführen ist, dass die Phosphatzentren in den Caseinnetzwerken im Gegensatz zu Casein frei von CaP-Brücken sind, da diese durch die EDTA-Behandlung entfernt wurden. Da die Caseinnetzwerke zudem eine geringere Proteindichte und damit eine höhere „Porosität“ als die mizellaren Caseinaggregate aufweisen, kann sich die apatitische Phase möglicherweise auch innerhalb der Netzwerke bilden, während dies für die mizellaren Caseinaggregate wahrscheinlich nur begrenzt möglich ist. In der vorliegenden Arbeit konnte ebenfalls gezeigt werden, dass sich Caseinnetzwerke grundsätzlich als Transportsysteme für Lysozym eignen, da sie eine hohe Stabilität aufweisen und erfolgreich mit Lysozym beladen werden können. Während die Assoziation von Lysozym mit mizellaren Caseinaggregaten, die aus UHT-Milch gewonnenen wurden, zu einem fast vollständigen Verlust der Lysozymaktivität führt, bleibt die Aktivität des Enzyms bei der Bindung an Caseinnetzwerke erhalten. Das Anwendungspotential der Caseinnetzwerk/Lysozym-Assoziate wurde im Rahmen von zahnmedizinischen Versuchen in vitro und in situ untersucht. Es konnte nachgewiesen werden, dass die Caseinnetzwerk/Lysozym-Assoziate in vitro eine dauerhafte Immobilisierung des Lysozyms in der in situ gebildeten Pellikel bewirken. Eine deutliche Anreicherung des Enzyms in situ wird mithilfe der Caseinnetzwerke allerdings nicht beobachtet. Dies könnte darin begründet sein, dass die im Vergleich zu den in vitro vorgefundenen Verhältnissen deutlich komplexeren Bedingungen in situ zu einem selektiveren Anreicherungsprozess von Enzymen in der Pellikel führen.

In these days are probiotic lactic acid bacteria (LAB) very often used in food processing industry, such as milk products, cheese and fermented salami production. As well as the food conservation agent. Except of the industry usage of the LAB there are microbiological aspects. Identification of the bacterial species methods based on the isolation and amplification of DNA are very often used last few years. Diploma thesis deal with the bacterial cell of Lactobacillus species lysis and it´s optimalization. At first it was tested the optimal concentration of lysozyme (3mg/ml, 5mg/ml, 10mg/ml) and the exposure times (3, 5 a 10 hours). Another testing was aimed to the use and suitability of washing powder to the bacterial cell of Lactobacillus species lysis. I tested the Amway washing powder optimal concentration (1%, 2%, 3% a 4%). Four of another comercial washing powders were tested too. All these tests were performed at the pure Lactobacillus bacterial culture. To ensure the results I tested the washing powders at the real food matrix (Acidified milk, yogurt mango, yogurt white). All the methods were evaluated at the amplification method PCR with specific primers for the Lactobacillus genus. The DNA isolation was performed with the paramagnetic microsperes P(HEMA-co-GMA) and the amount of the DNA was quantified spectrophotometrically. The PCR products detection was performed with the agarose gel electrophoresis.

Im Rahmen dieser Arbeit ist es durch die kombinierte Anwendung von P-31 Flüssigkeits (HR)- NMR-Spektroskopie sowie dynamischer Lichtstreuung (DLS) gelungen, die supramolekulare Struktur von mizellarem Casein aus ultrahocherhitzter (UHT) Milch unter dem Einfluss einer enzymatischen Vernetzung mittels mikrobieller Transglutaminase (mTG) zu charakterisieren. Die P-31 HR NMR-Spektroskopie erweist sich dabei als hervorragende Methode, um sowohl den Einbau von Casein aus dem Milchserum in die mizellaren Aggregate durch die enzymatische Reaktion als auch die bevorzugte mTG Vernetzung des beta-Caseins nachzuweisen. Durch die Kombination von P-31 HR NMR-Spektroskopie und Messungen der dynamischen Lichtstreuung war es weiterhin möglich, das Vorliegen vernetzter Caseinaggregate in Dispersionen mTG-behandelter Caseine zu belegen und besonders den Anteil an nicht vernetztem Casein „sichtbar“ zu machen, der durch EDTA-Zugabe aus den mTG-vernetzten Caseinnetzwerken freigesetzt wird. Es zeigt sich, dass die Caseinnetzwerke nach der EDTA-Behandlung eine geringere Proteindichte als mizellares Casein aufweisen, da sie nur ca. 20 % des Serinphosphats des mizellaren Caseins enthalten. P-31 Festkörper-NMR-spektroskopische Messungen legen außerdem nahe, dass die Beweglichkeit des phosphorylierten Ser149-Restes des kappa-Caseins in der äußeren Schicht der mizellaren Caseinaggregate durch die mTG-Behandlung nicht wesentlich verändert wird. Um die erhaltenen Caseinnetzwerke im Hinblick auf ihr Anwendungspotential zu untersuchen, wurden sie als Proteinkomponente bei der biomimetischen Calciumphosphatfällung sowie als Trägerstrukturen für bioaktives Lysozym verwendet. Durch den Einsatz von Caseinnetzwerken als Fällungsmedium während der Präzipitation von Calciumphosphat (CaP) ist es gelungen, eine hydratisierte, apatitische Phase zu stabilisieren, die sowohl ungeordnete als auch kristalline Bereiche enthält und damit strukturelle Ähnlichkeit zu biologisch und besonders biomimetisch gebildetem Apatit besitzt. Die in den Präzipitaten ebenfalls vorhandenen Phosphoratome in einer relativ ungeordneten OCP (Octacalciumphosphat)-ähnlichen Umgebung stehen höchstwahrscheinlich mit der apatitischen Phase in räumlich engem Kontakt und sind damit entweder Bestandteil dieser Phase oder befinden sich in einer getrennten Phase, die jedoch mit der apatitischen Phase in Form eines Nanokomposits mit sehr kleinen, eng benachbarten Kristalliten vorliegt. Bei der Fällung des Caseinnetzwerk/CaP-Präzipitats wird ebenfalls eine Dicalciumphosphat-Dihydrat (DCPD)-Phase gebildet. Diese ist separiert von den anderen CaP-Phasen und tritt in wesentlich geringerem Maße auf als in einem reinen CaP-Präzipitat, das ohne Proteinkomponente gefällt wurde. Damit konnte gezeigt werden, dass unter Bedingungen, bei denen ohne Proteinkomponente größtenteils DCPD entsteht, die Caseinnetzwerke eine apatitische Phase stabilisieren, die strukturelle Ähnlichkeit zu biologisch und biomimetisch gebildetem Apatit aufweist. Die qualitativ gleichen Ergebnisse konnten für vergleichsweise untersuchtes unvernetztes Casein gefunden werden. Die Caseinnetzwerke zeigen jedoch in Bezug auf die apatitische Phase einen stärkeren Stabilisierungseffekt als unvernetztes Casein. Es ist denkbar, dass dies unter anderem darauf zurückzuführen ist, dass die Phosphatzentren in den Caseinnetzwerken im Gegensatz zu Casein frei von CaP-Brücken sind, da diese durch die EDTA-Behandlung entfernt wurden. Da die Caseinnetzwerke zudem eine geringere Proteindichte und damit eine höhere „Porosität“ als die mizellaren Caseinaggregate aufweisen, kann sich die apatitische Phase möglicherweise auch innerhalb der Netzwerke bilden, während dies für die mizellaren Caseinaggregate wahrscheinlich nur begrenzt möglich ist. In der vorliegenden Arbeit konnte ebenfalls gezeigt werden, dass sich Caseinnetzwerke grundsätzlich als Transportsysteme für Lysozym eignen, da sie eine hohe Stabilität aufweisen und erfolgreich mit Lysozym beladen werden können. Während die Assoziation von Lysozym mit mizellaren Caseinaggregaten, die aus UHT-Milch gewonnenen wurden, zu einem fast vollständigen Verlust der Lysozymaktivität führt, bleibt die Aktivität des Enzyms bei der Bindung an Caseinnetzwerke erhalten. Das Anwendungspotential der Caseinnetzwerk/Lysozym-Assoziate wurde im Rahmen von zahnmedizinischen Versuchen in vitro und in situ untersucht. Es konnte nachgewiesen werden, dass die Caseinnetzwerk/Lysozym-Assoziate in vitro eine dauerhafte Immobilisierung des Lysozyms in der in situ gebildeten Pellikel bewirken. Eine deutliche Anreicherung des Enzyms in situ wird mithilfe der Caseinnetzwerke allerdings nicht beobachtet. Dies könnte darin begründet sein, dass die im Vergleich zu den in vitro vorgefundenen Verhältnissen deutlich komplexeren Bedingungen in situ zu einem selektiveren Anreicherungsprozess von Enzymen in der Pellikel führen.

Untersuchungen zur Reaktion von Proteinen während einer Hochdruckbehandlung (HD) ermöglichen ein besseres Verständnis der Reaktivität und Struktur auf molekularer Ebene. In der vorliegenden Arbeit wurde die enzymatische Oligomerisierung von Hühnereiweißlysozym (HEWL) mithilfe der druckstabilen mikrobiellen Transglutaminase (mTGase) unter HD untersucht. Die resultierenden Oligomere wurden anschließend hinsichtlich ihrer strukturellen und funktionellen Eigenschaften charakterisiert. Vergleichende Untersuchungen wurden mit dem evolutionsbiologisch verwandten Protein, dem α-Lactalbumin durchgeführt. Abschließend erfolgten orientierende Studien zur nicht-enzymatischen Vernetzung von HEWL und ausgewählten Milchproteinen, bei welchen eine kovalente Verknüpfung über vergleichbare Isopeptide nachgewiesen werden konnte. Kompakte, globuläre Proteine, wie das untersuchte HEWL stellten unter Normaldruck keine Substrate für die mTGase dar. Auch war eine enzymatische Vernetzung nach erfolgter Hochdruckbehandlung aufgrund der Reversibilität der druckinduzierten Auffaltung nicht möglich. So wurde HEWL nur bei simultaner Behandlung mit mTGase und hohem hydrostatischem Druck zu Homooligomeren vernetzt. Neben einem geeigneten Puffersystem wurden der pH-Wert, die Inkubationszeit, die Temperatur, der hydrostatische Druck, die Enzymaktivität der mTGase und die Proteinkonzentration des Lysozyms verändert. Abhängig von den Reaktionsbedingungen wurden Produkte mit stark variierenden Vernetzungsgraden erhalten, wobei eine maximale Oligomerisierung von zirka 75% aus einer 3%igen HEWL-Probe in Tris-HCl-Puffer bei pH 7,5 mit 160 U mTGase/g Protein über 30 min, 600 MPa und 40°C erreicht wurde. Zudem erfolgte eine Kategorisierung aller resultierenden Proben anhand ihres mittels Gelelektrophorese bestimmten Vernetzungsgrades in drei Untergruppen: LMW (niedrig vernetzt, 0 - 30%), MMW (mittel vernetzt, 30 - 60%) und HMW (hoch vernetzt, 60 - 100%). In den so vernetzten Proben wurden das reaktionsspezifisch gebildete Isopeptid N ε (γ L Glutamyl)-L-Lysin (Glu_Lys) nachgewiesen und die beteiligten reaktiven Aminosäuren identifiziert. Die Bestimmung von Glu_Lys, welches für die kovalenten Verknüpfungen verantwortlich ist, erfolgte nach enzymatischer Hydrolyse am Aminosäureanalysator mit Ninhydrin-Nachsäulen-Derivatisierung. Eine erste Abschätzung des Isopeptid¬gehaltes zeigte zudem, dass es bei der Oligomerisierung sowohl zu inter- als auch intra¬molekularer Vernetzung kam. Der minimal notwendige Gehalt an Cross-Link-Aminosäuren, [CLAA]min lag zum Teil um den Faktor zwei unter dem Gehalt des quantifizierten Glu_Lys. Anschließend konnte nach tryptischem Verdau über die RP-HPLC/ESI-TOF-MS für die gering vernetzten Proben (LMW) genau eine definierte kovalente Verknüpfungsstelle ermittelt werden. Für die MMW- und HMW-Proben wurden fünf bzw. sechs Peptidfragmente detektiert. Bei den LMW-Proben wurde Lys1 mit Gln121 vernetzt. Den höher oligomerisierten Proben konnten die Lysinreste Lys1, Lys13, Lys116 und die Glutaminreste Gln41, Gln57, Gln121 zugeordnet werden. Somit gelang eine erste strukturelle Aufklärung der Vernetzungsprodukte. Der Aufbau der Oligomere läuft demnach zuerst gerichtet und linear ab. Insbesondere bei höheren Temperaturen und Enzymaktivitäten werden jedoch ungeordnete Strukturen gebildet. Die einzelnen Vernetzungsprodukte scheinen aufgrund der Lage der reaktiven Aminosäuren im HEWL-Molekül über mehrere intermolekulare Bindungen eine variierende Struktur auszubilden. Eine Quantifizierung der einzelnen Isopeptide erfolgte nicht, orientierende MS-Untersuchungen lassen aber vermuten, dass auch hier bevorzugte Reaktionsorte existieren. Die vernetzten Proben wurden nachfolgend über Ammoniumsulfatfällung konzentriert und mittels Gelpermeationschromatographie (GPC) fraktioniert. Die Ausbeuten der GPC waren sehr gering. Eine Fraktionierung in einzelne, selektiv verknüpfte Oligomere wurde nicht erreicht. Die enzymatisch oligomerisierten Proben sowie ausgewählte GPC-Fraktionen mit höheren Oligomeren wurden hinsichtlich funktioneller und struktureller Konsequenzen untersucht. Begonnen wurde dabei mit der lytischen Enzymaktivität des HEWL gegen Zellwände des Micrococcus lysodeikticus. Eine abnehmende bzw. verbleibende Lyseaktivität korrelierte mit einer zunehmenden Oberflächen¬hydrophobität der Oligomerengemische. Beide Größen verhielten sich indirekt proportional zueinander. Während der hydrophobe Kern des Moleküls mit steigender Oligomerisierungsrate freigelegt wurde, senkte sich die Lyseaktivität bis auf null ab. Eine räumliche Deformation oder Barriere entstand mutmaßlich im oder in der Nähe des reaktiven Zentrums (Glu35 und Asp52) des Lysozyms, so dass der Enzym-Substrat-Komplex nicht mehr ausgebildet werden konnte. Die Untersuchung der Veränderung sekundärer und tertiärer Strukturbestandteilte erfolgte mithilfe der Zirkular-Dichroismus-Spektroskopie. Gleichwohl für die Tertiärstruktur keine großen Veränderungen aufgezeigt wurden, ist für die Sekundärstruktur mit zunehmendem Vernetzungsgrad eine Abnahme der α-Helices und eine Zunahme von ungeordneten und β Faltblatt-Bereichen detektiert worden. Es konnte daher die unter Hochdruck bekannte Auffaltung des HEWL über die enzymatische Vernetzung derart stabilisiert werden, dass eine vollständige Rückfaltung nicht mehr gegeben war. Das Fibrillierungsverhalten der oligomerisierten Proben im Sauren im Vergleich zum unbehandelten HEWL stellte eine weitere Charakterisierungsmöglichkeit dar. Die Analyse der inkubierten Proben erfolgte mithilfe dreier photometrischer Methoden (Umsetzung mit den Reagenzien 8-Anilino-1-naphtalinsulfonsäure, Kongorot oder Thioflavin T). Die fibrillierten Proben wurden zudem transmissionselektronenmikroskopisch (TEM) untersucht. Mit zunehmender Vernetzung war dabei eine abnehmende Fibrillierungsneigung zu beobachten, welche gut strukturell zu erklären ist, da die zusätzlichen, kovalenten Isopeptidbindungen die Proteinmoleküle gegen eine saure Auffaltung stabilisieren. Eine Auffaltung ist jedoch die Grundvoraussetzung für eine Assoziation und Bildung in-vitro-induzierter, amyloider Strukturen. Ferner wurde das antimikrobielle Verhalten der Präparate gegen grampositive und -negative Mikroorganismen getestet. Unbehandeltes Lysozym zeigt grundsätzlich gegenüber grampositiven Mikroorganismen eine gute antimikrobielle Aktivität. Eingesetzt wurden der Agardiffusions- und der bakterielle Hemmtest (Trübungsassay). Hierbei zeigten alle geprüften Proben keine Wirkung gegenüber gramnegativen Bakterien. Die antimikrobielle Wirkung gegenüber den grampositiven Mikroorganismen variierte stark. Das Phänomen der erhöhten Sensibilität gegenüber ausgewählten Bakterienstämmen im niederkonzentrierten Bereich wurde für Bacillus subtilis (grampositiv) und die mittel- bzw. hochvernetzten Proben im Vergleich zu unbehandelten HEWL (je 0,00625% Probe, w/v) reproduzierbar nachgewiesen. Auf die umfassende Charakterisierung der enzymatisch vernetzten HEWL-Proben folgten orientierende Vergleichsstudien mit dem evolutionsbiologisch verwandten α Lactalbumin (α-LA). Die enzymatische Oligomerisierung konnte für das Molkenprotein dabei im Gegensatz zum HEWL bereits unter Atmosphärendruck erzielt werden. Die Vernetzungsraten betrugen, unabhängig von den untersuchten Rahmenparametern aber abhängig vom Calciumgehalt, zirka 35% (mit Ca) bis 72% (ohne Ca). Das α-LA als Calcium-bindendes Protein wurde somit durch die Abwesenheit des Metallions derart destabilisiert, dass es für die mTGase besser umsetzbar wurde. Die im Vergleich zum Lysozym vermehrt enthaltenen potentiell reaktiven Aminosäuren (doppelt so viel Lys und Gln) trugen ebenfalls zu einer stärkeren Oligomerisierung bei. Abschließend erfolgten Studien zu nicht-enzymatischen, vakuuminduzierten Kondensations-reaktionen. Dabei wurde trockenes HEWL im Vakuum thermisch induziert vernetzt. Die Methode ist in der Literatur als Zero-Length-Cross-Linking (ZLCL) beschrieben. Die Untersuchung der Parameter Vakuum, Temperatur, pH-Wert und Zyklenzahl erfolgte an dem globulären Protein. Dieses konnte unter nicht denaturierenden Bedingungen bis zum Di- und Trimer vernetzt werden. Weitere Milchproteinproben (ein Molkenproteinisolat und β-Casein) wurden nur exemplarisch unter Standardbedingungen untersucht. Hierbei wurde das Molkenproteinisolat deutlich besser als HEWL und das β-Casein bei 85°C über je 24 h und Einsatz von Vakuum am stärksten oligomerisiert. Die gute Umsetzung des β-Caseins ist dabei auf die fehlende Tertiär- und Sekundärstruktur zurückzuführen. Zum Teil entstanden auch Casein-Polymere, welche nicht mehr elektrophoresegängig waren. Die beteiligten Isopeptide wurden analog zu den enzymatisch vernetzten Proben über die Aminosäureanalytik nachgewiesen. Es konnte das Isopeptid N-ε-(β-Aspartyl-)Lysin (Asp_Lys) neben Lysinoalanin (LAL), aber kein Glu_Lys in HEWL nachgewiesen werden. Beide Isopeptide (Asp_Lys und Glu_Lys) sowie LAL sind dagegen im β Casein gebildet worden. Der Einfluss struktureller Gegebenheiten auf die Reaktionsfähigkeit der Proteine konnte folglich eindeutig belegt werden.:Abbildungsverzeichnis V Tabellenverzeichnis VIII Abkürzungsverzeichnis XI 1 Einleitung und Zielstellung 1 2 Theoretische Grundlagen 3 2.1 Lysozym 3 2.1.1 Wirkmechanismen des Lysozyms 4 2.1.2 Anwendungsmöglichkeiten von Lysozym 7 2.1.3 Modifizierung des Lysozyms 8 2.1.3.1 Fibrillen und amyloide Strukturen von HEWL 9 2.1.3.2 Neue biologische Funktionen durch Konformationsänderung 13 2.1.4 Evolutionäre Entwicklung und Verwandtschaft zu α-Lactalbumin 14 2.2 Die enzymatische Vernetzung 15 2.2.1 Mikrobielle Transglutaminase 15 2.2.1.1 TGase katalysierte Reaktionen und Reaktionsmechanismus 17 2.2.1.2 Analytische Aspekte 19 2.2.1.3 Einsatz in der Lebensmittelindustrie 19 2.3 Nicht-enzymatische Vernetzung 21 2.3.1 Thermisch induzierte Vernetzung 21 2.3.2 In-Vacuo Zero-Length Cross-Linking 23 2.3.3 Anwendungsmöglichkeiten nicht-enzymatisch vernetzter Proteine 23 2.4 Wirkung hoher hydrostatischer Drücke auf Proteine 24 2.4.1 Wirkung von Hochdruck auf Hühnereiweiß-Lysozym 26 2.4.2 Wirkung von Hochdruck auf die mikrobielle Transglutaminase 27 3 Experimenteller Teil 29 3.1 Chemikalien, Materialien, Geräte und Software 29 3.1.1 Chemikalien 29 3.1.2 Geräte und Verbrauchsmaterialien 31 3.1.3 Untersuchungsmaterialien 33 3.1.4 Software 33 3.2 Erzeugung modifizierter Proteine 34 3.2.1 Enzymatische Vernetzung von Proteinen 34 3.2.1.1 Erzeugung von Protein-Oligomeren unter Hochdruck 34 3.2.1.2 Reinigung mittels Gelpermeationschromatographie (GPC) 35 3.2.1.3 Konzentrierung durch Ammoniumsulfatfällung 35 3.2.2 Thermisches und Vakuum-induziertes Zero-length Cross-linking 36 3.3 Erzeugung von HEWL-Fibrillen 38 3.4 Isolierung von α-Lactalbumin 38 3.5 Dialyse der Proteinlösungen 39 3.6 Aktivität der Transglutaminase 39 3.7 Analytische Verfahren zur Strukturuntersuchung und Charakterisierung der Proteinproben 41 3.7.1 Restwasserbestimmung mittels Karl-Fischer-Titration 41 3.7.2 Proteinbestimmung mittels Lowry 42 3.7.3 Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) 44 3.7.4 Aminosäureanalytik (ASA) 47 3.7.4.1 Saure Hydrolyse 49 3.7.4.2 Enzymatische Hydrolyse 49 3.7.5 Hochdruckflüssigchromatographie mit anschließender Massenspektroskopie (RP-HPLC/ESI-TOF-MS) 51 3.7.5.1 Probenvorbereitung - Tryptischer Verdau 51 3.7.5.2 RP-HPLC/ESI-TOF-MS-Messung 51 3.7.6 Aktivitätsbestimmung für HEWL und HEWL-haltige Proben 52 3.7.6.1 Klassische Methode - Trübungsassay 52 3.7.6.2 Modifizierte Methode der Aktivitätsermittlung mit Blue-ML 53 3.7.7 Methode zur Oberflächenhydrophobitätsermittlung 54 3.7.8 Bestimmung der Sekundär- und Tertiärstruktur mittels Zirkulardichroismus Spektroskopie (CD-Spektroskopie) 56 3.7.9 Charakterisierung der HEWL-Fibrillen 57 3.7.9.1 8-Anilino-1-naphthalinsulfonsäure-Assay (ANS-Assay) 57 3.7.9.2 Kongorot-Assay 58 3.7.9.3 Thioflavin-T-Assay 59 3.7.9.4 Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) 61 3.7.10 Bestimmung der antimikrobiellen Wirksamkeit 62 3.7.10.1 Agardiffusionstest 62 3.7.10.2 Bakterieller Hemmtest 63 4 Ergebnisse und Diskussion 64 4.1 Enzymatische Vernetzung von HEWL mittels mTGase und Einfluss verschiedener Reaktionsparameter 64 4.1.1 Geeignete Puffersysteme und pH-Werte 67 4.1.2 Einfluss variierender Inkubationsdauer und unterschiedlicher Drücke 68 4.1.3 Einfluss der Lysozymkonzentration 70 4.1.4 Einfluss der mTGase-Aktivität 71 4.1.5 Temperatur 73 4.1.6 Optimierte Parameter für den höchstmöglichen Vernetzungsgrad 74 4.2 Analytik der Isopeptide 76 4.2.1 Identifizierung des N-ε-(γ-L-Glutamyl)-L-Lysin-Isopeptids (Glu_Lys) 76 4.2.2 Beurteilung einer intra- und intermolekularen Vernetzung 79 4.2.3 Lokalisierung der reaktiven Lysin- und Glutaminreste mittels HPLC/MS 80 4.2.4 Strukturvorschlag 88 4.3 Isolierung und Konzentrierung enzymatisch vernetzter Lysozym-Oligomere 89 4.3.1 Ammoniumsulfatfällung 89 4.3.2 Ergebnisse der Gelpermeationschromatographie 91 4.4 Funktionelle Charakterisierung der LMW-, MMW- und HMW-Proben des HEWL 96 4.4.1 Vergleichende Untersuchungen der verbleibenden Enzymaktivität 97 4.4.2 Beurteilung der Oberflächenhydrophobität 100 4.4.3 Veränderung der Sekundär- und Tertiärstruktur 104 4.4.4 Fibrillbildung und -eigenschaften von HEWL 109 4.4.4.1 Etablierung der Charakterisierungmethoden für HEWL-Fibrillen 110 4.4.4.2 Fibrillinduktion an HEWL-Präparaten ausgewählter Vernetzungsgrade 118 4.4.5 Antimikrobielle Wirksamkeit gegenüber grampositiven und gramnegativen Mikroorganismen 126 4.5 Vergleichende Untersuchungen an dem strukturanalogen Protein α-Lactalbumin 137 4.6 Orientierende Untersuchungen zur nicht-enzymatischen In-Vakuo-Thermo-Vernetzung von HEWL und ausgesuchten Proteinen 142 4.6.1 Einfluss verschiedener Reaktionsparameter auf die Vernetzung von HEWL 143 4.6.2 Identifizierung der gebildeten Isopeptide 145 4.6.3 Vergleich der nicht-enzymatischen und enzymatischen Vernetzung von HEWL 146 4.6.4 Vergleich der In-Vakuo-Thermo-Vernetzung an HEWL mit β-Casein und erste Untersuchungen an einem Molkenproteinisolat 149 4.7 Fazit der Untersuchungen zur enzymatischen und der nicht-enzymatischen Vernetzung verschiedener Proteine 152 5 Zusammenfassung 154 6 Literaturverzeichnis 157 Veröffentlichungen 172 Danksagung 173 Versicherung 174

Es ist eine allgemein akzeptierte Tatsache, dass der Kontakt von Proteinen mit synthetischen Materialien üblicherweise zur Proteinadsorption an der Materialoberfläche führt. Über den stattfindenden Prozess, insbesondere das Zusammenspiel zwischen Protein-Oberflächen-Wechselwirkungen und konformellen Änderungen der adsorbierten Proteine ist jedoch bisher nur wenig bekannt. In dieser Arbeit wird die ortsgerichtete Spinmarkierungstechnik (SDSL) auf die Strukturuntersuchung adsorbierter Proteine ausgeweitet. Diese nutzt das spezifische Einbringen einer spinmarkierte Seitenkette an gewünschte Positionen der Primärstruktur zur Analyse der Struktur und Dynamik diamagnetischer Proteine mittels der Elektronenspinresonanz(ESR)-Spektroskopie. Das globuläre Protein T4 Lysozym (T4L) wurde auf planare Modelloberflächen adsorbiert und strukturelle Änderungen in Abhängigkeit der physikalischen und chemischen Eigenschaften der Oberfläche verfolgt. Die spezifische Anbindung von T4L auf quarzgestützten zwitterionische Lipiddoppelschichten führt nur zu geringfügigen strukturellen Veränderungen des Proteins. Allerdings bildet sich eine makroskopisch geordnete Proteinschicht aus. Die Vorzugsrichtung der Proteine auf der Oberfläche kann durch Analyse der winkelabhängigen ESR-Spektren bestimmt werden. Die Wechselwirkung negativ geladener Oberflächen mit dem positiv geladenen T4L führt zu drastischeren Störungen der Proteinstruktur. Hierbei wird die Reaktion des Proteins auf den Kontakt mit einer fluiden quarzgestützten Lipiddoppelschicht, die das negativ geladenen Lipid Phosphatidylserin enthält, mit derer bei Adsorption auf einer ebenfalls negativ geladenen, jedoch rigiden Quarzoberfläche verglichen. Dass der Adsorptionsprozess auch das Substrat selbst beeinflussen kann, wird durch die Beobachtung einer Phasentrennung bei Proteinadsorption des Lipidgemischs aufgezeigt, das negativ geladene Lipide enthält. / Although it is commonly accepted that the exposition of proteins to man-made materials typically results in protein adsorption on the material surface, little is known about the interplay between the protein-surface interactions involved and the resulting conformational changes of the adsorbing protein. In this study the site-directed spin labeling (SDSL) approach has been extended to the investigation of proteins adsorbed to planar surfaces. The method involves the selective introduction of an artificial spin-labeled side-chain to a predefined residue of the amino acid sequence and allows the determination of the structure and dynamics of proteins by analysis of the electron paramagnetic resonance (EPR) spectra. The globular protein T4 Lysozyme (T4L) has been adsorbed to planar model surfaces to study the correlation between conformational changes of the protein and the physical and chemical properties of the surfaces. Tethering T4L to a planar quartz-supported zwitterionic lipid bilayer shows only minor changes in the structure of the protein. Furthermore, a macroscopic order of the adsorbed protein layer is proven by angular-dependent EPR spectra which allow the determination of the protein orientation. Offering surfaces that are net negatively charged to the highly positively charged T4L leads to the observation of more drastic conformational changes. Here, the conformation of T4L adsorbing to a fluid quartz-supported lipid bilayer containing negatively charged lipids is compared to the structure of T4L adsorbed to the negatively charged but rigid quartz surface. The adsorption process may also influence the substrate itself. This can be shown by the phase separation of the negatively charged lipid bilayer upon protein adsorption.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Herstellung von funktionellen Magnetit-Nanokompositen durch Sprühtrocknung für die Anwendung in der Bioseparation. Dabei liegen die Schwerpunkte auf der Anwendung von Polyelektrolyten als Ionenaustauscher sowie auf der Nachhaltigkeit des Herstellungsprozesses. Basierend auf einem existierenden Herstellungsprozess wurde die Aufgabenstellung konkretisiert. Es wurden Möglichkeiten zur nachhaltigen Prozessgestaltung der Synthese von kationischen bzw. anionischen magnetischen Funktionspartikeln zur Proteinabtrennung vorgestellt. Als magnetische Komponente wurde Magnetit verwendet. Aufgrund seines pseudo-amphiphilen Charakters und seiner besonderen Eigenschaften in Bezug auf die Stabilisierung von Magnetit-Kolloiden wurde Polyvinylbutyral (Mowital B 30T) als Matrixpolymer bei der Sprühtrocknung benutzt. Für die nachhaltige Prozessgestaltung wurden Isopropanol und Tetrahydrofuran als Dichlormethan-Ersatz bei der Sprühtrocknung verwendet. Bei der Synthese kationischer Magnetic Beads wurden verzweigtes Polyethylenimin und lineares Poly(Allyamin) als Anionenaustauscher verwendet. Beide Polykationen sind schwache Polyelektrolyte mit Aminogruppen. Für die Verarbeitung der Polykationen als funktionelle Liganden in magnetischen Funktionspartikeln wurde zwei Herstellungsmethoden vorgestellt: eine Synthese ohne Oberflächenmodifizierung, wobei die mechanische und chemische Stabilität der Funktionspartikeln einzig von der chemischen Struktur der eingesetzten Materialien bzw. vom Matrixpolymer abhängt, und eine Synthese mit Oberflächenmodifizierung. Die Synthese mit Oberflächenmodifizierung ist gekennzeichnet durch die kovalente Bindung von Polyethylenimin bzw. Poly(Allyamin) an der Oberfläche der Funktionspartikeln (Polyvinylbutyral). Dafür wurde 1,1’-Carbonyldiimidazol als „zero length“-Crosslinker benutzt. Die nach beiden Methoden hergestellten Funktionspartikeln wurden charakterisiert, um ihre technische Eignung beurteilen zu können. Für die Charakterisierung der sorptiven Eigenschaften wurde unter anderem der Bowman-Birk Inhibitor (BBI) verwendet. Das Protein ist ein Sojaprodukt und für seine krebsvorbeugende Wirkung bekannt. Um die Selektivität der Abtrennung zu untersuchen, wurden BBI-Produkte mit unterschiedlichen Reinheitsgraden benutzt. Durch die zwei vorgestellten Methoden konnten kationische magnetische Funktionspartikeln erfolgreich hergestellt werden. Alle Funktionspartikeln sind superparamagnetisch, und der Medianwert ihrer Partikelgrößenverteilung liegt im einstelligen Mikrometerbereich. Aufgrund eines höheren Polykationanteils ist die Bindungskapazität der Funktionspartikeln ohne Oberflächenmodifizierung um den Faktor 2,4 größer als die BBI-Bindungskapazität der Funktionspartikeln mit Oberflächenmodifizierung (Qmax=322 mg/g). Das Fehlen eine feste Anbindung des funktionellen Liganden an den Funktionspartikeln ohne Oberflächenmodifizierung verleiht jedoch diesen eine sehr schlechte chemische Stabilität in Lösungen. Es wurde auch gezeigt, dass oberflächenmodifizierte Funktionspartikeln mit ähnlichen Eigenschaften durch den Einsatz von Dichlormethan bzw. Tetrahydrofuran als Lösungsmittelersatz während der Sprühtrocknung hergestellt werden können. Durch den Einsatz von mit Poly(allylamin) oberflächenmodifizierten Funktionspartikeln konnte BBI von technischen Sojamolken unterschiedlicher Reinheitsgrade erfolgreich abgetrennt werden. Anionische Magnetic Beads wurden mit Kationenaustauscherharz als funktionellem Ligand hergestellt. Dabei wurde Isopropanol als organisches Lösungsmittel während der Sprühtrocknung verwendet. Die Synthese wurde analog zur Synthese der kationischen Magnetic Beads ohne Oberflächenmodifizierung durchgeführt. Es wurde auch hier gezeigt, dass anionische magnetische Funktionspartikeln mit guten sorptiven Eigenschaften durch den Einsatz von Isopropanol als organisches Lösungsmittel hergestellt werden können. Die anionischen Funktionspartikeln besitzen im Vergleich zu Literaturwerten höhere Bindungskapazitäten (bis 280 mg/g; ermittelt mit Lysozym). Im letzten Kapitel wird der kritische Prozessschritt des Lösungsmittelaustausches behandelt. Nach dem Lösungsmittelaustausch sollten die Magnetitnanopartikeln in der organischen Phase stabil sein. Dies ermöglicht sowohl eine homogene Verteilung der Nanopartikeln in der Matrix als auch deren bessere Verkapselung während der Sprühtrocknung. Es wurde festgestellt, dass sich eine vollständige Abtrennung von Dichlormethan durch die angewendete Destillationsmethode nicht erreichen lässt. Anhand von zwei Modellsystemen — Rizinolsäure- und Ölsäure-beschichteten Magnetitnanopartikeln — und Lösungsmittelgemischen wurde die Stabilität von sterisch stabilisierten Magnetitpartikeln in binären Lösungsmittelgemischen untersucht. Der Fokus bei dieser Untersuchung lag auf der Untersuchung der Stabilität der beschichteten Magnetitnanopartikeln in einer möglichst Dichlormethan- bzw. Isooktan-freien organischen Phase. Als zweites Lösungsmittel (als Lösungsmittelersatz betrachtet) wurden neben Tetrahydrofuran und Isopropanol technisch verbreitete Lösungsmittel wie Isooktan und 1-Butanol eingesetzt. Die Untersuchungsergebnisse zeigen, dass die Anwendung der technischen Rizinolsäure bzw. Ölsäure einen zusätzlichen Einfluss auf die Stabilität der Magnetitpartikeln hat, da diese aus anderen Fettsäuren mit unterschiedlichen chemischen Strukturen bestehen. Die Diskrepanz zwischen der berechneten HANSEN-Distanzen und der Stabilität der Magnetitnanopartikeln mit reinen Fettsäuren lässt vermutet, dass die Zusammensetzung der Lösungsmittelgemische an der fest/flüssig-Grenzfläche anders ist als im freien Volumen. Ein Modell zur Beschreibung der Stabilität der Nanopartikeln, das auf einer Anreicherung des Ausgangslösungsmittels an der Grenzfläche basiert, wurde postuliert. Solange die Diffusion des zweiten Lösungsmittels in die Adsorptionsschicht nicht ausreichend genug ist, um die Löslichkeit der Fettsäureketten entscheidend zu reduzieren und somit einen Abfall der Abstoßungskräfte zwischen der Partikeln hervorzurufen, bleiben alle beschichteten Magnetitnanopartikeln stabil im Lösungsmittelgemisch. Dies ist der Fall für die mit der reinen Rizinolsäure beschichteten Magnetitnanopartikeln in allen verwendeten Lösungsmittelgemischen mit 0,5 Vol. % DCM in der kontinuierlichen Phase. Durch die vorgestellten Herstellungsmethoden wurde gezeigt, dass magnetische Funktionspartikeln sowohl mit festen partikelförmigen Ionenaustauschern als auch mit flüssigen schwachen Polyelektrolyten erfolgreich synthetisiert werden können. Eine nachhaltige Prozessgestaltung durch die Reduzierung der Dichlormethanmenge im Sprühtrocknungsprozess ist auch möglich. Für eine erfolgreiche industrielle Anwendung der Funktionspartikeln müssen aber ihre chemischen sowie mechanischen Eigenschaften deutlich verbessert werden. Dies könnte z.B. durch die Verwendung eines anderen Matrixpolymers oder durch die Entfernung von nicht gebundenen Bestandteilen durch gezielte Waschung der Funktionspartikeln erfolgen. Die Bindungskapazität sowie die Selektivität der oberflächenmodifizierten Funktionspartikeln sollte ebenfalls verbessert werden. Dafür wurde einen Ansatz durch die Quaternisierung der Aminogruppen präsentiert. Schließlich würde die Untersuchung der Stabilität der beschichteten Magnetitnanopartikeln in einphasigen reinen Lösungsmitteln nähere Erkenntnisse über das postulierte Modell der Anreicherung von Dichlormethan in der Adsorptionsschicht erbringen. Dabei könnte die Dichlormethanmenge durch mehrstufige Destillation bzw. Rektifikation beim Lösungsmittelaustausch entfernt werden. Eine vollständige Untersuchung dieses Effekts würde zusätzlich eine Antwort auf zahlreiche Fragestellungen der Kolloidchemie in Bezug auf das Stabilitätsverhalten von Pigmentdispersionen (Lacke) oder von beschichteten Nanopartikeln in Polymerlösungen erbringen.

The presented doctoral thesis is focused on preparation, characterization and application of organic micro- and nanoparticles as transport systems for active components and some their complex natural sources. Active component were packed into liposomes and polysaccharide particles. As active components were used caffeine, some drugs – clotrimazole and ibuprofen, further antioxidants and vitamins. Antimicrobial herbs and spices extract, antimicrobial peptides lysozyme, nisin and other antimicrobial ingredients were encapsulated too. Encapsulation of selected hydrolytic enzymes was tested, too. Particles were also used for encapsulation of probiotic strains Bifidobacterium breve and Lactobacillus acidophilus and prebiotic components. These prebiotics were co-encapsulated into capsules with probiotic cells. Natural extracts were encapsulated e.g. extracts of guarana, ginseng, goji, green barley, propolis, black, green and white tea, coffee, fruit and vegetable extracts. The efficiency of encapsulation was determined by HPLC/PDA and by spectrophotometry. Long-term stability of particles and amount of released component in model/real foods, in model cosmetic conditions and in a model physiological environment were monitored too. Size of prepared liposomes and polysaccharide particles was determined by dynamic light scattering and by light microscopy and electron microscopy, respectively. Stability of the particles was measured using a zeta potential. Also, analytical centrifugation was used to measurement of sedimentation velocity and stability of the prepared particles. The antimicrobial activity were tested using two Gram-positive (Bacillus subtilis, Micrococcus luteus), two Gram-negative (Escherichia coli, Serratia marcescens) bacteria and one fungal strains (Candida glabrata). For determining the antimicrobial properties of active component and prepared particles two the most widely used methods were used - agar diffusion method and broth dilution method. The viability of probiotic strains were performed using flow cytometry and fluorescence microscopy. Encapsulation of active component was successful in all types of particles. Liposome showed a very good long-term stability mainly in water conditions with neutral pH and polysaccharide particles were stable in acidic conditions. Prepared particles showed a very good stability in model stomach environment, while in model intestines environments particles were disintegrated and active component were released. Prepared particles with encapsulated caffeine as well as other tested antioxidants and vitamins could be used to modern types of energy drinks, food supplements and also for some cosmetics applications. Encapsulated antimicrobial components could be used for food application as well as for cosmetics and pharmaceutical application like antimicrobial wound formulation. Encapsulated enzymes can be used for controlled release of proteases in wound healing, as delivery systems in digestive tract and as a part of pharmaceutical preparative and food supplements for enzyme therapy. The study revealed that encapsulation of probiotics and also co-encapsulation of probiotics with prebiotics exhibited longer stability of particles and survival bacterial cells. So, prepared particles are suitable for use to food product with beneficial effects on the human body.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Herstellung von funktionellen Magnetit-Nanokompositen durch Sprühtrocknung für die Anwendung in der Bioseparation. Dabei liegen die Schwerpunkte auf der Anwendung von Polyelektrolyten als Ionenaustauscher sowie auf der Nachhaltigkeit des Herstellungsprozesses. Basierend auf einem existierenden Herstellungsprozess wurde die Aufgabenstellung konkretisiert. Es wurden Möglichkeiten zur nachhaltigen Prozessgestaltung der Synthese von kationischen bzw. anionischen magnetischen Funktionspartikeln zur Proteinabtrennung vorgestellt. Als magnetische Komponente wurde Magnetit verwendet. Aufgrund seines pseudo-amphiphilen Charakters und seiner besonderen Eigenschaften in Bezug auf die Stabilisierung von Magnetit-Kolloiden wurde Polyvinylbutyral (Mowital B 30T) als Matrixpolymer bei der Sprühtrocknung benutzt. Für die nachhaltige Prozessgestaltung wurden Isopropanol und Tetrahydrofuran als Dichlormethan-Ersatz bei der Sprühtrocknung verwendet. Bei der Synthese kationischer Magnetic Beads wurden verzweigtes Polyethylenimin und lineares Poly(Allyamin) als Anionenaustauscher verwendet. Beide Polykationen sind schwache Polyelektrolyte mit Aminogruppen. Für die Verarbeitung der Polykationen als funktionelle Liganden in magnetischen Funktionspartikeln wurde zwei Herstellungsmethoden vorgestellt: eine Synthese ohne Oberflächenmodifizierung, wobei die mechanische und chemische Stabilität der Funktionspartikeln einzig von der chemischen Struktur der eingesetzten Materialien bzw. vom Matrixpolymer abhängt, und eine Synthese mit Oberflächenmodifizierung. Die Synthese mit Oberflächenmodifizierung ist gekennzeichnet durch die kovalente Bindung von Polyethylenimin bzw. Poly(Allyamin) an der Oberfläche der Funktionspartikeln (Polyvinylbutyral). Dafür wurde 1,1’-Carbonyldiimidazol als „zero length“-Crosslinker benutzt. Die nach beiden Methoden hergestellten Funktionspartikeln wurden charakterisiert, um ihre technische Eignung beurteilen zu können. Für die Charakterisierung der sorptiven Eigenschaften wurde unter anderem der Bowman-Birk Inhibitor (BBI) verwendet. Das Protein ist ein Sojaprodukt und für seine krebsvorbeugende Wirkung bekannt. Um die Selektivität der Abtrennung zu untersuchen, wurden BBI-Produkte mit unterschiedlichen Reinheitsgraden benutzt. Durch die zwei vorgestellten Methoden konnten kationische magnetische Funktionspartikeln erfolgreich hergestellt werden. Alle Funktionspartikeln sind superparamagnetisch, und der Medianwert ihrer Partikelgrößenverteilung liegt im einstelligen Mikrometerbereich. Aufgrund eines höheren Polykationanteils ist die Bindungskapazität der Funktionspartikeln ohne Oberflächenmodifizierung um den Faktor 2,4 größer als die BBI-Bindungskapazität der Funktionspartikeln mit Oberflächenmodifizierung (Qmax=322 mg/g). Das Fehlen eine feste Anbindung des funktionellen Liganden an den Funktionspartikeln ohne Oberflächenmodifizierung verleiht jedoch diesen eine sehr schlechte chemische Stabilität in Lösungen. Es wurde auch gezeigt, dass oberflächenmodifizierte Funktionspartikeln mit ähnlichen Eigenschaften durch den Einsatz von Dichlormethan bzw. Tetrahydrofuran als Lösungsmittelersatz während der Sprühtrocknung hergestellt werden können. Durch den Einsatz von mit Poly(allylamin) oberflächenmodifizierten Funktionspartikeln konnte BBI von technischen Sojamolken unterschiedlicher Reinheitsgrade erfolgreich abgetrennt werden. Anionische Magnetic Beads wurden mit Kationenaustauscherharz als funktionellem Ligand hergestellt. Dabei wurde Isopropanol als organisches Lösungsmittel während der Sprühtrocknung verwendet. Die Synthese wurde analog zur Synthese der kationischen Magnetic Beads ohne Oberflächenmodifizierung durchgeführt. Es wurde auch hier gezeigt, dass anionische magnetische Funktionspartikeln mit guten sorptiven Eigenschaften durch den Einsatz von Isopropanol als organisches Lösungsmittel hergestellt werden können. Die anionischen Funktionspartikeln besitzen im Vergleich zu Literaturwerten höhere Bindungskapazitäten (bis 280 mg/g; ermittelt mit Lysozym). Im letzten Kapitel wird der kritische Prozessschritt des Lösungsmittelaustausches behandelt. Nach dem Lösungsmittelaustausch sollten die Magnetitnanopartikeln in der organischen Phase stabil sein. Dies ermöglicht sowohl eine homogene Verteilung der Nanopartikeln in der Matrix als auch deren bessere Verkapselung während der Sprühtrocknung. Es wurde festgestellt, dass sich eine vollständige Abtrennung von Dichlormethan durch die angewendete Destillationsmethode nicht erreichen lässt. Anhand von zwei Modellsystemen — Rizinolsäure- und Ölsäure-beschichteten Magnetitnanopartikeln — und Lösungsmittelgemischen wurde die Stabilität von sterisch stabilisierten Magnetitpartikeln in binären Lösungsmittelgemischen untersucht. Der Fokus bei dieser Untersuchung lag auf der Untersuchung der Stabilität der beschichteten Magnetitnanopartikeln in einer möglichst Dichlormethan- bzw. Isooktan-freien organischen Phase. Als zweites Lösungsmittel (als Lösungsmittelersatz betrachtet) wurden neben Tetrahydrofuran und Isopropanol technisch verbreitete Lösungsmittel wie Isooktan und 1-Butanol eingesetzt. Die Untersuchungsergebnisse zeigen, dass die Anwendung der technischen Rizinolsäure bzw. Ölsäure einen zusätzlichen Einfluss auf die Stabilität der Magnetitpartikeln hat, da diese aus anderen Fettsäuren mit unterschiedlichen chemischen Strukturen bestehen. Die Diskrepanz zwischen der berechneten HANSEN-Distanzen und der Stabilität der Magnetitnanopartikeln mit reinen Fettsäuren lässt vermutet, dass die Zusammensetzung der Lösungsmittelgemische an der fest/flüssig-Grenzfläche anders ist als im freien Volumen. Ein Modell zur Beschreibung der Stabilität der Nanopartikeln, das auf einer Anreicherung des Ausgangslösungsmittels an der Grenzfläche basiert, wurde postuliert. Solange die Diffusion des zweiten Lösungsmittels in die Adsorptionsschicht nicht ausreichend genug ist, um die Löslichkeit der Fettsäureketten entscheidend zu reduzieren und somit einen Abfall der Abstoßungskräfte zwischen der Partikeln hervorzurufen, bleiben alle beschichteten Magnetitnanopartikeln stabil im Lösungsmittelgemisch. Dies ist der Fall für die mit der reinen Rizinolsäure beschichteten Magnetitnanopartikeln in allen verwendeten Lösungsmittelgemischen mit 0,5 Vol. % DCM in der kontinuierlichen Phase. Durch die vorgestellten Herstellungsmethoden wurde gezeigt, dass magnetische Funktionspartikeln sowohl mit festen partikelförmigen Ionenaustauschern als auch mit flüssigen schwachen Polyelektrolyten erfolgreich synthetisiert werden können. Eine nachhaltige Prozessgestaltung durch die Reduzierung der Dichlormethanmenge im Sprühtrocknungsprozess ist auch möglich. Für eine erfolgreiche industrielle Anwendung der Funktionspartikeln müssen aber ihre chemischen sowie mechanischen Eigenschaften deutlich verbessert werden. Dies könnte z.B. durch die Verwendung eines anderen Matrixpolymers oder durch die Entfernung von nicht gebundenen Bestandteilen durch gezielte Waschung der Funktionspartikeln erfolgen. Die Bindungskapazität sowie die Selektivität der oberflächenmodifizierten Funktionspartikeln sollte ebenfalls verbessert werden. Dafür wurde einen Ansatz durch die Quaternisierung der Aminogruppen präsentiert. Schließlich würde die Untersuchung der Stabilität der beschichteten Magnetitnanopartikeln in einphasigen reinen Lösungsmitteln nähere Erkenntnisse über das postulierte Modell der Anreicherung von Dichlormethan in der Adsorptionsschicht erbringen. Dabei könnte die Dichlormethanmenge durch mehrstufige Destillation bzw. Rektifikation beim Lösungsmittelaustausch entfernt werden. Eine vollständige Untersuchung dieses Effekts würde zusätzlich eine Antwort auf zahlreiche Fragestellungen der Kolloidchemie in Bezug auf das Stabilitätsverhalten von Pigmentdispersionen (Lacke) oder von beschichteten Nanopartikeln in Polymerlösungen erbringen.