The topic of the thesis is the mechanisms of cellular volume regulation in the rat retina. Müller cells as main macroglial cells of the retina are supposed to play important roles in the regulation of the retinal ion- and osmohomeostasis and, thus, in the regulation of the extracellular space volume. In the first part of the thesis, signaling pathways were determined which are involved in the regulation of the volume of Müller glial cells and bipolar cells, the main second-order cells of the retina, in the healthy rat retina. The topic of the second part of the thesis is the evaluation of gliotic alterations of Müller cells in a transgenic rat model of retinal degeneration (CMV-PKD21/703 HA rats), in order to obtain indications for a pathogenic role of reactive glial cells in the development of retinal degeneration and edema. Various methods were used including immunohistochemical stainings, real-time RT-PCR, patch-clamp recordings, and cell swelling experiments. The data suggest that both neurons and reactive Müller cells may contribute to formation of retinal edema. In contrast to Müller cells, bipolar cells are apparently not capable to regulate the extracellular space volume in the healthy retina. However, reactive Müller cells are impaired in their capability to regulate retinal water and ion homeostasis. Impaired regulation of the extracellular space volume may result in neuronal hyperexcitation and degeneration.

The topic of the thesis is the mechanisms of cellular volume regulation in the rat retina. Müller cells as main macroglial cells of the retina are supposed to play important roles in the regulation of the retinal ion- and osmohomeostasis and, thus, in the regulation of the extracellular space volume. In the first part of the thesis, signaling pathways were determined which are involved in the regulation of the volume of Müller glial cells and bipolar cells, the main second-order cells of the retina, in the healthy rat retina. The topic of the second part of the thesis is the evaluation of gliotic alterations of Müller cells in a transgenic rat model of retinal degeneration (CMV-PKD21/703 HA rats), in order to obtain indications for a pathogenic role of reactive glial cells in the development of retinal degeneration and edema. Various methods were used including immunohistochemical stainings, real-time RT-PCR, patch-clamp recordings, and cell swelling experiments. The data suggest that both neurons and reactive Müller cells may contribute to formation of retinal edema. In contrast to Müller cells, bipolar cells are apparently not capable to regulate the extracellular space volume in the healthy retina. However, reactive Müller cells are impaired in their capability to regulate retinal water and ion homeostasis. Impaired regulation of the extracellular space volume may result in neuronal hyperexcitation and degeneration.

La manière dont la diversité neuronale du système nerveux central est établie au cours du développement est une question d'un grand intérêt depuis plus d'un siècle. Les progéniteurs neuronaux sont contrôlés dans l'espace et dans le temps afin de générer un ensemble diversifié de neurones. Les composants moléculaires du contrôle spatial chez les vertébrés soient bien compris, mais le cadre moléculaire du contrôle temporel chez les vertébrés n’a été que peu exploré. Les travaux réalisés, au cours de la dernière décennie, sur le développement de la rétine chez la souris ont révélé l'existence de deux importants facteurs de transcription temporels (tTF). Ikzf1 confère une compétence temporelle précoce alors que Casz1 confère une compétence temporelle tardive aux cellules progénitrices de la rétine (RPC) des mammifères. Cependant, sur les sept types cellulaires présents dans la rétine, ces tTFs ne régulent pas la capacité de générer les cônes nés précocement ni pour les cellules gliales de Müller nées tardivement, suggérant la présence d'autres tTFs non identifiés. L'objectif principal de cette thèse a été de découvrir les mécanismes moléculaires contrôlant la production des cônes au cours de la rétinogenèse précoce ainsi que la production tardive des cellules gliales de Müller. Dans cette thèse, Pou2f1 a été découvert comme un tTF qui confère aux RPCs une compétence temporelle à générer des cônes. Pou2f1 active l'expression de Pou2f2, qui permet ensuite de favoriser la production de cônes en réprimant l’expression du facteur de transcription Nrl. Ikzf1 active l'expression de Pou2f1 dans les RPC alors que Pou2f1 réprime le tTF tardif Casz1, suggérant une boucle d'autorégulation transcriptionnelle entre ces différents tTF. De plus, Ikzf4, un autre membre de la famille Ikzf, s'est avéré important pour la spécification des cônes et des cellules gliales de Müller. Ikzf4 active l’expression de Pou2f1/Pou2f2 lorsqu'il est surexprimé dans des RPC tardifs, suggérant qu’il permet la production de cônes en activant directement l’expression de Pou2f1/Pou2f2. Ikzf4 était également lié à de nombreux gènes de la voie de signalisation de Notch, qui sont impliqués dans la production de cellules gliales de Müller au cours de la rétinogenèse. Ce travail établi des bases pouvant inspirer de futures études dans d'autres parties du SNC, où des tTF similaires pourraient aussi contrôler la production de différents types cellulaires en fonction du temps. Enfin, cette thèse propose de nouveaux tTF comme outils thérapeutiques pour améliorer l’efficacité de production des cônes à partir de cellules souches. / How neural diversity is established in the developing central nervous system has been a question of great interest for more than a century. Neural progenitors are spatially and temporally patterned to generate a diverse set of neurons. Although molecular components of spatial patterning in vertebrates are well understood, the molecular framework behind temporal patterning in vertebrates has been largely unexplored. Work done in the past decade on mouse retinal development has revealed insights on how temporal patterning could be established in the CNS. Retinal neurons and glia are born in a sequential but overlapping manner from a pool of multipotent retinal progenitor cells (RPCs), consisting of an early embryonic and late post-natal window of cell birth. Two temporal transcription factors (tTFs), Ikzf1 and Casz1, confer early and late temporal competence to retinal progenitor cells (RPCs), respectively. However, out of the seven cell types in the retina, these tTFs do not regulate the competence for early born cones and late born Müller glia, suggesting the presence of other unidentified tTFs. The prime goal of this thesis was to uncover the molecular mechanisms controlling cone specification during early, and Müller glia specification during late retinal development. In this thesis, Pou2f1 was discovered as a novel tTF that confers temporal competence to RPCs to generate cones. Pou2f1 activates Pou2f2, which binds to the promoter of Nrl, a key rod specification gene, and represses its expression. Early tTF Ikzf1 activates Pou2f1, whereas Pou2f1 represses late tTF Casz1 in RPCs. Additionally, Ikzf4 was discovered as an important regulator of cone specification early, and Müller glia specification late during retinal development. Ikzf4 binds to genomic regions near Pou2f1/Pou2f2 gene bodies and activates their expression during early retinogenesis. During late retinogenesis, Ikzf4 binds to promoters of Notch signaling genes and activates their expression to promote Müller glia differentiation. Taken together, these results reveal important insights on how cone and Müller glia production is temporally controlled during early and late retinogenesis. This work lays the groundwork for future studies in other parts of the developing CNS that could employ similar tTFs for temporal patterning. Finally, this thesis proposes novel tTFs as therapeutic tools to efficiently generate cones from ESC-derived retinal organoids and sheets.

Les altérations de la barrière hémato-rétinienne (BRB) sont associées à des maladies rétiniennes telles que la rétinopathie diabétique et la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA). L’intégrité de la BRB est cruciale pour maintenir un microenvironnement rétinien en homéostasie et est étroitement régulé grâce à la régulation du transport transcellulaire et paracellulaire. Ici, nous décrirons brièvement la BRB interne, en mettant davantage l’accent sur la structure et la fonction de la BRB externe dans les états sains et malades. Nous avons hypothétisé que le dysfonctionnement des aquaporines exprimées dans des composantes de la BRB est suffisant pour générer un oedème diabétique dans une rétine diabétique. Bien que les résultats indiquent qu’aucune des aquaporines ciblées n’est suffisante pour générer un oedème cystoïde dans un modèle murin - et ce même en l’exacerbant en augmentant la perméabilité vasculaire rétinienne, nous mettons à l’avant un outil de segmentation semi-automatisé ainsi que deux modèles de recherches engageants. Le modèle murin de DT1 induit via STZ a été étudié de façon longitudinale sur un intervalle de temps modéré et pourra être ajusté pour des expériences futures en mettant à profit un outil de quantification semi-automatique performant. D’autre part, le modèle in vitro de la sénescence de l’ÉPR est conceptuellement établi et partiellement mis sur pied. Finalement, les résultats sont prometteurs et incitent à approfondir des cibles alternatives dans un modèle conceptuellement similaire, mais soit exacerbé ou plus anatomiquement près de l’humain. / Alterations in the blood-retina barrier (BRB) are associated with retinal diseases such as diabetic retinopathy and age-related macular degeneration (AMD). The integrity of the BRB is crucial for maintaining a tightly regulated and retinal microenvironment in homeostasis through the regulation of transcellular and paracellular transport. Here, we will briefly describe the inner BRB, with a greater emphasis on the structure and function of the outer BRB in both healthy and diseased states. We hypothesized that dysfunction of aquaporins expressed in components of the BRB is sufficient to generate diabetic edema in a diabetic retina. Although the results indicate that none of the targeted aquaporin are sufficient to generate a cystoid edema in a murine model, even when exacerbated by increasing retinal vascular permeability, we present a semi-automated segmentation tool and two engaging research models. A murine model and a programmation tool were developped to efficiently assess semi-automated quantitation of retinal edema. On the other hand, the in vitro model of RPE senescence is conceptually established and partially implemented. Ultimately, the results are promising and encourage further exploration of alternative targets in a conceptually similar model, either exacerbated or more anatomically close to humans.

Die Dissertation befasst sich mit der Untersuchung der Ko-Expression des GFAP- und des PLP-Promotors in Müllerzellen der Netzhaut transgener Mäuse. Die verwendete Mauslinie ist tripel-transgen für den GFAP- und den PLP-Promotor sowie für einen ROSA26-Reporter. Durch die Quantifizierung der EYFP-Expression in Müllerzellen konnte gezeigt werden, dass es nach akuter ischämischer Schädigung sowie einer angeborenen retinalen Degeneration in Müllerzellen zu einer Aktivierung des oligodendrozytären PLP-Promotors kommt. Weiterhin wurde festgestellt, dass die Aktivierung des Transkriptionsfaktors Sox-9, der sowohl für die Entwicklung der Müllerzellen als auch für die Oligodendrogenese von entscheidender Rolle ist, mit dieser Promotoraktivierung korreliert. Diese Ergebnisse implizieren, dass Müllerzellen im Rahmen ihrer Stammzelleigenschaften in der Lage sind, auf embryonale Entwicklungsprozesse, die auch die oligodendrozytäre Zellreihe beinhalten, zurückgreifen zu können.

Die Dissertation befasst sich mit der Untersuchung der Ko-Expression des GFAP- und des PLP-Promotors in Müllerzellen der Netzhaut transgener Mäuse. Die verwendete Mauslinie ist tripel-transgen für den GFAP- und den PLP-Promotor sowie für einen ROSA26-Reporter. Durch die Quantifizierung der EYFP-Expression in Müllerzellen konnte gezeigt werden, dass es nach akuter ischämischer Schädigung sowie einer angeborenen retinalen Degeneration in Müllerzellen zu einer Aktivierung des oligodendrozytären PLP-Promotors kommt. Weiterhin wurde festgestellt, dass die Aktivierung des Transkriptionsfaktors Sox-9, der sowohl für die Entwicklung der Müllerzellen als auch für die Oligodendrogenese von entscheidender Rolle ist, mit dieser Promotoraktivierung korreliert. Diese Ergebnisse implizieren, dass Müllerzellen im Rahmen ihrer Stammzelleigenschaften in der Lage sind, auf embryonale Entwicklungsprozesse, die auch die oligodendrozytäre Zellreihe beinhalten, zurückgreifen zu können.:Inhaltsverzeichnis ....................................................................................................................... 3 Bibliographische Darstellung ..................................................................................................... 5 Abkürzungsverzeichnis und Erläuterungen ................................................................................ 6 1 Einleitung ............................................................................................................................ 8 1.1 Die Retina als Teil des Auges ................................................................................................. 8 1.1.1 Aufbau .............................................................................................................................. 8 1.2 Die gliale Müllerzelle ............................................................................................................ 12 1.2.1 Definition und Morphologie der Müllerzellen ............................................................... 12 1.2.2 Funktion .......................................................................................................................... 13 1.2.3 Ursprung und Ontogenese der Müllerzelle ..................................................................... 14 1.3 Erkrankungen der Netzhaut .................................................................................................. 15 1.3.1 Akute Läsionen ............................................................................................................... 15 1.3.2 Chronische Erkrankungen der Netzhaut ......................................................................... 15 1.3.3 Die Rolle der Müllerzelle in der erkrankten Retina ....................................................... 16 1.4 Mausgenetik .......................................................................................................................... 18 1.4.1 Das Cre-loxP-System ..................................................................................................... 18 1.5 Pax-6 und Sox-9: Transkriptionsfaktoren spezifizieren das Zellschicksal ........................... 24 1.5.1 Die PAX-Familie ............................................................................................................ 24 1.5.2 SOX-9-Gene ................................................................................................................... 25 2 Ziele .................................................................................................................................. 26 3 Material und Methoden ..................................................................................................... 27 3.1 Material ................................................................................................................................. 27 3.1.1 Chemikalien .................................................................................................................... 27 3.1.2 Antikörper ....................................................................................................................... 27 3.1.3 Größenstandards ............................................................................................................. 28 3.1.4 Mauslinien ...................................................................................................................... 29 3.1.5 Geräte ............................................................................................................................. 31 3.2 Methoden .............................................................................................................................. 31 3.2.1 Genotypisierung transgener Mäuse ................................................................................ 31 3.2.2 Akute retinale Läsion durch Anlegen eines erhöhten Augeninnendrucks („high intraocular pressure“, HIOP) .......................................................................................... 37 3.2.3 Herstellung und Fixierung der retinalen Gewebsproben ................................................ 37 3.2.4 Immunhistochemische Färbungen .................................................................................. 38 3.2.5 Mikroskopische Auswertung .......................................................................................... 39 3.2.6 Datenverarbeitung und Statistik ..................................................................................... 41 4 Ergebnisse ......................................................................................................................... 42 4.1 Technische Aspekte: Vergleich der Quantifizierung in Ganzpräparate und Querschnitte ... 42 4.1.1 Vergleich der Abbildungen ............................................................................................ 42 4.1.2 Auszählung Retina-Ganzpräparate ................................................................................. 43 4.1.3 Auszählung der Zellen in Querschnitten der Netzhaut ................................................... 45 4.1.4 Vergleich der Quantifizierung von Ganzpräparaten und Querschnitten ........................ 46 4.1.5 Quantifizierung ............................................................................................................... 48 4.2 Analyse der Reporterexpression in der Retina tripel-transgener Mäuse ............................... 49 4.2.1 Quantitative Auswertung GS-positiver Müllerzellen ..................................................... 49 4.2.2 Quantitative Auswertung EYFP-positiver Müllerzellen ................................................ 51 4.2.3 Auswertung des prozentualen Anteils der EYFP-positiven Müllerzellen ...................... 53 4.3 Auswertung der Transkriptionsfaktorexpression von Pax-6 und Sox-9 ............................... 56 4.3.1 Auswertung der Pax-6-positiven Müllerzellen ............................................................... 57 4.3.2 Auswertung der Sox-9-positiven Müllerzellen .............................................................. 60 5 Diskussion ......................................................................................................................... 63 5.1 Die GFAP-Expression in der Müllerzellgliose ..................................................................... 63 5.2 Auswertung und Vergleich der retinalen Ganzpräparate und Querschnitte ......................... 64 5.3 Die Untersuchung der Promotoraktivität nach retinaler Ischämie ........................................ 65 5.4 Die Untersuchung der Promotoraktivität bei angeborener retinaler Degeneration ............... 66 5.5 Die Rolle der Transkriptionsfaktoren Pax-6 und Sox-9 ........................................................ 68 5.5.1 Pax-6 ............................................................................................................................... 68 5.5.2 Sox-9 ............................................................................................................................... 69 5.6 Einordnung der Ergebnisse in die Zellbiologie der Müllerzelle ........................................... 72 6 Zusammenfassung ............................................................................................................. 74 7 Literaturverzeichnis .......................................................................................................... 77 8 Lebenslauf ......................................................................................................................... 83 9 Danksagung ....................................................................................................................... 84 10 Eigenständigkeitserklärung ............................................................................................... 85