Es wird angenommen, dass die invasiven Stadien parasitärer Helminthen zur Organfindung und zur Weiterentwicklung auf die Sensierung spezifischer Wirts-Signale angewiesen sind, wobei die molekulare Natur dieser Signale bislang weitgehend ungeklärt ist. Vorangegangene Untersuchungen am Fuchsbandwurm Echinococcus multilocularis, dem Erreger der alveolären Echinokokkose, hatten bereits ergeben, dass dessen Metacestoden-Larvenstadium zur Weiterentwicklung kleine, lösliche Wirtsmoleküle benötigt. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals ein axenisches (Wirtszell-freies) Kultursystem für das Metacestoden-Stadium entwickelt, mittels dessen sich diese Fragestellungen in vitro angehen lassen. Mit Hilfe dieses Kultursystems konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass die drei Wirts-Hormone/Zytokine, Insulin, epidermal growth factor (EGF) und bone morphogeneic protein 2 (BMP2), einen Einfluss auf die Proliferation und die Differenzierung von E. multilocularis haben. Während für Insulin und EGF Wachstums-stimulierende Effekte gezeigt werden konnten, förderte BMP2 die Differenzierung des Metacestoden zum nächsten Larvenstadium, dem Protoscolex. In Modellorganismen wie Säugern, Drosophila und Caenorhabditis elegans verlaufen die durch Insulin- und EGF-ähnlichen Zytokine induzierten Signalmechanismen über die sogenannte mitogen activated protein (MAP)-Kinase-Kaskade. Um zu untersuchen, ob die externe Zugabe von Wirts-Insulin bzw. -EGF in einer Stimulierung der MAPK-Kaskade des Parasiten führt, wurden in dieser Arbeit zunächst die Komponenten dieses Signalweges bei E. multilocularis auf molekulargenetischer und biochemischer Ebene charakterisiert. Die Arbeiten umfassten Studien zu kleinen GTPasen des Parasiten (EmRas, EmRap1, EmRap2, EmRal), zu einem Orthologen der Kinase Raf (EmRaf), sowie Orthologen der Kinasen MEK (EmMKK) und ERK (EmERK). Es konnte gezeigt werden, dass diese Faktoren in E. multilocularis Teil einer MAP-Kinase-Kaskade sind. Zudem wurde nachgewiesen, dass diese Faktoren stromabwärts eines EGF-Rezeptor-Orthologen (EmER) des Parasiten fungieren, welches ebenfalls in der vorliegenden Arbeit analysiert wurde. Damit wurden die Voraussetzungen geschaffen, den Einfluss exogen zugegebenen Insulins bzw. EGFs auf die Aktivierung der MAP-Kinase-Kaskade im Parasiten zu untersuchen. Erste Analysen zeigten bereits, dass die zentrale Komponente dieser Kaskade, EmERK, durch die genannten Wirts-Zytokine aktiviert wird. Dies legt nahe, dass Wirt-Parasit-Kommunikationsmechanismen über evolutionsgeschichtlich konservierte Signalsysteme eine wichtige Rolle im Infektionsgeschehen der alveolären Echinokokkose spielen. Aufbauend auf dem axenischen Kultursystem ist es in dieser Arbeit auch erstmals gelungen, Primärzellkulturen für E. multilocularis anzulegen und die Parasitenzellen zur in vitro Neubildung von Metacestoden-Vesikeln anzuregen. Erste Experimente zur genetischen Manipulation dieser Primärzellen konnten erfolgreich durchgeführt werden. Aufbauend auf der hier vorgestellten Methodik sollte es in künftigen Untersuchungen möglich sein, stabil transfizierte Echinococcus-Zellen zu generieren und diese zur Herstellung vollständig transgener Parasiten-Stadien zu nutzen. Dies würde die zur Untersuchung der E. multilocularis-Entwicklung und der Wirt-Parasit-Interaktionsmechanismen bei einer Infektion zur Verfügung stehenden Methoden entscheidend erweitern und könnte u.a. zur weiteren biochemischen Analyse der in dieser Arbeit dargestellten Signalmechanismen des Parasiten herangezogen werden. / It is assumed that the invasive stages of parasitary helminths are reliant on the sensing of specific host signals for organ targeting and development. The molecular nature of these signals is still mostly unsettled. Previous studies on the fox tapeworm Echinococcus multilocularis, the causative organism of alveolar echinococcosis showed that the metacestode larval stage requires small, soluble host molecules to develop further. For the first time, in this study an axenic (without host cells) culture system for the metacestode stage was developed which allows to address these questions in vitro. Using this culture system it could be shown that the three host hormomes/zytokines, insulin, epidermal growth factor (EGF) and bone morphogeneic protein 2 (BMP2) have influence on proliferation and differentiation of E. multilocularis. While insulin and EGF had growth-stimulating effects, BMP2 results in metacestode differentiation to the next larval stage, the protoscolex. In model organisms such as mammals, Drosophila und Caenorhabditis elegans the signals induced by insulin and EGF-related zytokines are transferred by the so-called mitogen activated protein (MAP) kinase cascade. In order to determine whether external addition of host insuline or host EGF leads to a stimulation of the MAPK cascade of the parasite, initially the components of the signal path of E. multilocularis were characterized on the moleculargenetic and biochemical level. The research comprised studies on small GTPases of the parasite (EmRas, EmRap1, EmRap2, EmRal) and an orthologue of the Raf Kinase (EmRaf) as well as orthologues of the MEK kinase (EmMKK) and ERK kinase (EmERK). It could be shown that the mentioned factors are part of a MAP kinase cascade in E. multilocularis. Furthermore it could be demonstrated that these factors act downstream of an EGF-receptor orthologue (EmER) of the parasite, which was also analysed in this study. Thereby a base was provided to investigate the influence of exogenic added insulin or EGF on the activation of the MAP kinase cascade in the parasite.First analyses showed that the mentioned host cytokines activate EmERK, the central component of this cascade. This suggests that host-parasite communication via evolutionary conserved signal systems play an important role in the infection scenario of the alveolar echinococcosis. Based on the axenic culture system, for the first time primary cells for E. multilocularis could be cultured and in vitro regeneration of metacestode vesicles could be excited in the parasite cells. First experiments on genetic manipulation on the primary cells were effected successfully. On this basis it should be possible to generate stable transfected Echinococcus cells and use these to generate completely transgenic parasite stages in future studies. This would be a critical extension of the set of methods available for research of the development of E. multilocularis and the host-parasite interaction mechanisms in an infection and could be drawn on for further biochemical analyses of the signal mechanisms of the parasites presented in this study.

Bei c-Jun N-terminalen Kinasen (JNKs) (auch als Stress-aktivierte Proteinkinasen SAPKs bezeichnet), handelt es sich um Mitglieder der Mitogen-aktivierten Proteinkinase Familie (MAPK), die die Genexpression als eine Antwort auf eine Vielzahl von physiologischen und nicht-physiologischen Stimuli regulieren. Gendeletionsexperimente (knockout) und der Einsatz von dominant-negativen Mutanten wiesen auf eine Funktion von SAPK/JNKs bei Prozessen der zellulären Differenzierung, dem Überleben und/oder Apoptose sowie onkogener Transformation hin. Direkte Analysen des transformierenden Potentials von SAPK/JNKs wurden bislang durch das Fehlen von konstitutiv-aktiven Mutanten verhindert. Erst unlängst konnte durch die Fusion der MAP Kinase mit seiner direkten, in der Kaskade vorgeschalteten, Aktivatorkinase solche Mutanten bereitgestellt werden. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde ein SAPKb-MKK7 Hybridprotein generiert, mit dessen Hilfe das transformierende Potential von aktiviertem SAPKb charakterisiert werden konnte. Die induzierte Expression von SAPKb-MKK7 führte zur morphologischen Transformation von NIH 3T3 Fibroblasten. Darüber hinaus bildeten diese Zellen kleine Foci aus transformierten Zellen, wuchsen in Soft-Agar und vergleichbar mit onkogenem Ras oder Raf, resultierte auch die Expression von aktiviertem SAPKb in der Zerstörung des F-Aktins. Des Weiteren steigerte die Expression von SAPKb-MKK7 die Proliferationsraten von NIH 3T3 Zellen. Im Gegensatz zu den akut transformierenden Onkogenen wie ras oder raf, ist SAPKb-MKK7 jedoch nicht in der Lage, das Überleben der transformierten Zellen zu bewirken. Unsere Daten schlagen daher vor, das konstitutiv-aktives SAPK/JNK zwar die Hauptaspekte zellulärer Transformation verursacht, aber nicht imstande ist, alle Veränderungen zu induzieren, die benötigt werden, um einen vollständig transformierten Phänotypen zu etablieren, weshalb insgesamt gesehen, sein transformierendes Potential deutlich schwächer ausgeprägt ist. Wir haben zusätzlich damit begonnen, dass tumorgene Potential von SAPKb-MKK7 direkt im Nacktmausmodell zu verifizieren. Die Injektion von SAPKb-MKK7 exprimierenden Fibroblasten resultierte in der Etablierung eines gut definierten Fibrosarkoms, wobei die Latenzzeit länger war als bei v-Raf transformierten Zellen. Somit ist die Expression von aktiviertem SAPK/JNK ausreichend, um die Tumorentwicklung in vivo zu initieren, auch wenn die lange Latenzzeit auf die Notwendigkeit zusätzlicher genetischer Veränderungen hinweist. / The c-Jun N-terminal kinases (JNKs) (also known as stress-activated protein kinases, SAPKs), members of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) family, regulate gene expression in response to a variety of physiological and environmental stimuli. Gene knockout experiments and the use of dominant interfering mutants have pointed to a role of SAPK/JNKs in the processes of cell differentiation, survival and/or apoptosis as well as oncogenic transformation. Direct analysis of the transforming potential of JNKs has been hampered so far by the lack of constitutively active forms of these kinases. Recently such mutants have become available by fusion of the MAPK with its direct upstream activator kinase. In the context of this PhD thesis a constitutively active SAPKb-MKK7 hybrid protein was generated and used to characterize the transforming potential of activated SAPKb. Inducible expression of SAPKb-MKK7 caused morphological transformation of NIH 3T3 fibroblasts. Additionally, these cells formed small foci of transformed cells, grew anchorage-independent in soft agar and similar to oncogenic Ras and Raf, expression of activated SAPKb resulted in the degradation of F-actin stress fibers. Furthermore, expression of SAPKb-MKK7 increased proliferation rates of NIH 3T3 cells. However, in contrast to the classical oncogenes like ras and raf, SAPKb-MKK7 is not able to selectively support the survival of the transformed cells. Therefore, our data suggest that constitutive SAPK/JNK activation elicits major aspects of cellular transformation, but is unable to induce the complete set of changes which are required to establish the fully transformed phenotype. We have also begun to directly determine the tumorigenic potential of SAPKb-MKK7 in the nude mouse. Injection of SAPKb-MKK7 expressing fibroblasts resulted in the establishement of a well defined fibrosarcoma, albeit at much later timepoints than in the case of v-Raf transformed cells. The long latency with which they develop tumors suggests the requirement of further genetic alterations. Thus expression of activated SAPK/JNK is sufficient to initiate tumor development in vivo.

MAP kinases and transcription factors homologous to Saccharomyces cerevisiae Fus3p/Kss1p and Ste12p have been identified in several plant pathogenic fungi and found to be required for pathogenicity and sexual reproduction. A gene encoding the homolog of Fus3p/Kss1p in Neurospora crassa was isolated previously and named mak- 2 (mitogen activated kinase -2). This dissertation describes the isolation of the Ste12p homolog, pp-1 (protoperithecia-1) and the comparison of the phenotypes of the mak-2 and pp-1 mutants. The similar phenotypes of the mak-2 and pp-1 null mutants suggest that these proteins are part of the same MAP kinase signaling cascade in N. crassa. In addition to reduced growth rate, the phenotypes of the mutants demonstrate that this pathway is required for female fertility, contributes to aerial hyphal development and repression of conidiophore development. The mak-2 MAP kinase pathway also regulates several genes putatively involved in secondary metabolism during the mating process. Among these is a gene cluster that is likely to be involved in the production of a polyketide secondary metabolite. An orthologous gene cluster was also identified in M. grisea, and the structural and functional homology of these two related gene clusters was characterized. Microarray analysis was used to extend the analysis of gene expression in mak-2 and pp-1 mutants, and a number of downstream target genes of the MAP kinase pathway were identified and called mak-2 kinase-regulated genes (mkr). A model of this MAP kinase pathway in N. crassa was developed. Since N. crassa is a saprophytic fungus but closely related to several plant pathogens, this research may provide an important perspective on the evolution of a major regulatory pathway governing fungal pathogenesis.

Thesis (Ph. D.)--University of Missouri--Columbia, 2001. / "December 2001." Typescript. Vita. Includes bibliographical references (leaves 181-193). Also available on the Internet.

Univ., Diss., 2009--Marburg.

Würzburg, Univ., Diss., 2009. / Zsfassung in dt. Sprache.

Techn. Universiẗat, Diss., 2006--München.

Die alveoläre Echinokokkose (AE), verursacht durch das Metacestoden- Larvenstadium des Fuchsbandwurms Echinococcus multilocularis (E. multilocularis), ist eine lebensbedrohliche Zoonose der nördlichen Hemisphäre mit eingeschränkten therapeutischen Möglichkeiten. Bei der Suche nach neuen Therapeutika haben Mitogen-activated Proteinkinase (MAPK) -Kaskaden als pharmakologische Zielstrukturen aufgrund ihrer essentiellen Rolle bei der Zellproliferation und -differenzierung ein großes Potenzial. In der vorliegenden Arbeit wurden durch BLAST- und reziproke BLAST-Analysen elf potenzielle MAPK Kinase Kinasen (MAP3K), fünf potenzielle MAPK Kinasen (MAP2K) und sechs potenzielle MAPK im E. multilocularis-Genom identifiziert, die teils hoch konserviert sind und in nahezu allen Entwicklungsstadien des Parasiten exprimiert werden. Diese Erkenntnisse lassen auf ein komplexes MAPK-Signaltransduktions- system in E. multilocularis mit großer Bedeutung für den Parasiten schließen. Transkriptomdatenanalysen und Whole Mount in Situ Hybridisierung (WMISH) zeigten, dass emmkkk1 (EmuJ_000389600) als einzige MAP3K neben der Expression in postmitotischen Zellen in besonderem Maße in proliferativen Stammzellen des Parasiten exprimiert wird und somit eine wichtige Rolle bei der Differenzierung von Stammzellen spielen könnte. In Yeast-Two-Hybrid (Y2H) -Wechselwirkungsassays wurden Interaktionen von mehreren upstream- (EmGRB2) und downstream- wirkenden Signalkaskadekomponenten des JNK (EmMKK3, EmMPK3) und ERK (EmMKK3, EmMPK4) -Signalwegs gefunden. Daraus lässt sich schließen, dass EmMKKK1, analog zu seinem humanen Homolog HsM3K1, eine zentrale Rolle bei der Echinococcus-Wachstumsregulation durch Rezeptortyrosinkinasen und vielfältige weitere Funktionen im Parasiten besitzt. Anhand von Erkenntnissen an Platyhelminthes kann daher von einem großen Potenzial dieser neu charakterisierten Signalwege als chemotherapeutische Angriffspunkte ausgegangen werden, wenngleich erste RNA-Interferenz (RNAi)- und Inhibitorstudien an emmkkk1, emmpk1 und emmpk4 keine durchschlagenden Effekte auf das Überleben von Primärzellkulturen und die Bildung von Metacestodenvesikeln zeigten. Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit mit EmMKKK1 und neuen ERK- und JNK-Signalwegen zentrale Komponenten der komplexen MAPK-Signalkaskaden in E. multilocularis identifiziert werden, die höchstwahrscheinlich einen großen Beitrag zur enormen Regenerationsfähigkeit der Echinococcus-Stammzellen leisten und vom Wirt abgeleitete Signale wie Insulin, Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) und Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) über EmGRB2 in Proliferationsnetzwerke des Parasiten integrieren. Arzneimittel-Screening-Assays, die auf diese Signalwege abzielen, könnten daher zu alternativen Arzneimitteln führen, die alleine oder in Kombination mit einer bestehenden Chemotherapie (Benzimidazol) die Prognose von für AE-Patienten verbessern könnten. / Alveolar echinococcosis (AE), caused by the metacestode larval stage of the fox tapeworm Echinococcus multilocularis (E. multilocularis), is a life-threatening zoonosis of the Northern Hemisphere with limited therapeutic options. In searches for a new chemotherapy, mitogen-activated protein kinase (MAPK) cascades are of great potential as new drug targets due to their essential role in cell proliferation and differentiation. In this work eleven potential MAPK kinase kinases (MAP3K), five potential MAPK kinases (MAP2K) and six potential MAPK were identified in the E. multilocularis genome by BLAST and reciprocal BLAST analyses, of which some are highly conserved and expressed in almost all developmental stages of the parasite. These findings suggest a complex MAPK signal transduction system in E. multilocularis with major importance for the parasite. Transcriptome data analysis and Whole Mount in Situ Hybridization (WMISH) showed that emmkkk1 (EmuJ_000389600) is the only MAP3K being decisively expressed in the proliferative parasite in addition to expression in postmitotic cells, and thus could play an important role in the differentiation of stem cells. In Yeast-Two-Hybrid (Y2H) interaction assays, interactions between several upstream (EmGRB2) and downstream signaling cascade components of JNK (EmMKK3, EmMPK3) and ERK (EmMKK3, EmMPK4) signaling pathways were detected. Thus, EmMKKK1, like its human homologue HsM3K1, appears to play a central role in Echinococcus growth regulation by receptor tyrosine kinases and seems to have diverse other functions in the parasite. Based on findings on other platyhelminths it can be expected that these newly characterized signaling pathways are of great potential as drug target, although first RNA interference (RNAi) and inhibitor studies on emmkkk1, emmpk1 and emmpk4 revealed no substantive effects on the survival of primary cell cultures and the formation of metacestode vesicles. In conclusion, the present work identified with EmMKKK1 and new ERK and JNK signaling pathways central components of the complex MAPK signaling cascades in E. multilocularis, which most likely contribute to the enormous regenerative capacity of Echinococcus stem cells and integrate host derived signals such as insulin, epidermal growth factor (EGF), and fibroblast growth factor (FGF) via EmGBR2 into proliferative networks of the parasite. Targeting these signaling pathways in drug screening assays might thus lead to alternative drugs that alone, or in combination with existing chemotherapy (benzimidazole), could improve the prognose of AE patients.

In dieser Dissertation wird der MEK5/ERK5- Signalweg als möglicher Angriffspunkt in der zielgerichteten Melanomtherapie identifiziert. Die Adressierung von ERK5 bietet eine Alternative, um einer Resistenzentwicklung gegenüber Inhibitoren des MAPK- Signalwegs entgegenzuwirken. Das maligne Melanom ist ein hochaggressiver Tumor mit steigender Inzidenz. Zunehmende Sonnenstunden im Rahmen des Klimawandels mit erhöhter Belastung der Haut durch UV-Strahlung werden die Problematik des malignen Melanoms für den Menschen in den nächsten Jahren weiter zunehmen lassen. Die Aktivierung des MEK5/ERK5- Signalwegs scheint eine Reaktion von Tumorzellen auf Therapiestress zu sein. Diese Aktivierung liefert den Melanomzellen einen Überlebensvorteil und verhindert ein langfristiges Therapieansprechen. ERK5 beeinflusst den Zellzyklus von Melanomzellen und ist somit möglicherweise von wichtiger Bedeutung in der Tumorgenese des malignen Melanoms. Patienten mit NRAS- Mutation profitieren auffallend weniger von einer gezielten MEKi-Therapie als solche mit BRAF Mutation. Für ersteres Patientenkollektiv steht aktuell lediglich die Immuntherapie zur Verfügung, wodurch oft nur ein kurzes, progressionsfreies Intervall erreicht werden kann und die Patienten häufig unter schweren Nebenwirkungen leiden. Grund für die problematische Behandlung könnte das häufige Auftreten einer basalen ERK5- Aktivierung in NRAS- mutierten Melanomen sein. Diese Arbeit liefert eine positive Prognose über den Nutzen einer ERK5- Inhibition als Erweiterung des Therapieschemas. Diese These gilt auch für Melanompatienten mit einer BRAF- Mutation. Patienten, die an einem malignen Melanom erkrankt sind, weisen zu 80% eine Mutation in einem dieser beschriebenen Onkogene auf. Die Arbeit lässt darauf schließen, dass eine ERK5- Inhibition in der Therapie von beiden Gruppen erfolgreich sein könnte und somit das Leben nahezu aller Melanompatienten betrifft. / In this thesis, targeting the MEK5/ERK5- pathway is identified as a possible treatment option for maligant melanoma in order to prevent the development of resistances against inhibitors of the MAPK- pathway. The malignant melanoma is a highly aggressive tumor with an increasing incidence. A rising amount of sun exposure due to climate change will lead to increasing skin damage among the population and thus the malignant melanoma may emerge as an important medical problem throughout the following decade. The activation of the MEK5/ERK5 pathway seems to be a cellular response to therapeutic stress. It therefore results in sustained proliferation and survival in melanoma cells and prevents an efficiant therapy in the longterm. ERK5 has influence on the cell cycle progression of melanoma cells and could be of utmost importance for the tumorigenesis in malignant melanoma. Patients suffering from NRAS- mutant melanoma benefit remarkably less from MAPK-pathway targeting regimens than those with BRAF- mutation. In these cases immunotharpy remains as the only valuable treatment option yet barely achieving a short progression free survival with severe side effects. The obstacle of effective therapy could be the frequently found occurrence of a basal ERK5- activity especially observed in NRAS- mutant melanoma cells. Our data imply that MEKi/ERK5i co-treatment could provide a new therapeutic approach as an adjunct to targeted therapy of malignant melanoma improving its overall effectiveness. This discovery does not only apply for NRAS- mutant melanoma but also for patients with BRAF- mutation. In 80% of malignant melanoma the driver mutation can be found in one of these two oncogenes suggesting the majoryty of melanoma patients might benefit from MEK5/ERK5- Inhibition.

La fonction barrière de la peau dépend en grande partie d’une différenciation appropriée des kératinocytes épidermiques. Au cours de ce processus, de nombreux changements ont lieu dans ces cellules tels que la diminution de la prolifération, le remodelage du cytosquelette, des changements dans l’expression génique, la dégradation du noyau et des organites de même que la formation d’une structure bien particulière : l’enveloppe cornée. Il est important que de tels évènements soient régulés de façon adéquate puisqu’un débalancement au sein de ces derniers peut mener à l’apparition de conditions pathologiques. La Dual Leucine zipper-bearing Kinase (DLK) est une Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase Kinase dont l’expression est très forte au niveau de la couche granuleuse, soit la dernière couche de cellules vivantes avant la couche cornée de l’épiderme. Des études précédentes ont révélé que la surexpression de la DLK dans des kératinocytes en culture avait pour effet d’induire la différenciation terminale. Toutefois, les mécanismes par lesquels la DLK régule ce processus restent encore méconnus faisant en sorte que l’objectif général de cette thèse consiste à mieux les définir. L’hypothèse à la base de ces travaux est que la DLK est requise pour la différenciation des kératinocytes et que celle-ci y participe en favorisant la stabilisation des microtubules de même que l’expression ou l’activité de facteurs de transcription impliqués dans ce processus. Dans un premier temps, un modèle de peau reconstruite in vitro dans lequel l’expression de la DLK a été réduite par interférence à l’ARN a été développé. Il a été noté que la diminution de la DLK avait pour effets d’affecter la distribution de protéines de l’enveloppe cornée telles que la filaggrine et la transglutaminase 1 de même que d’inhiber la formation des couches granuleuse et cornée. Des analyses en immunofluorescence et en microscopie électronique ont permis d’observer des défauts au niveau des jonctions serrées et des desmosomes dans les peaux sous-exprimant la DLK révélant un rôle de cette kinase dans le bon maintien de ces deux types de jonctions cellulaires. L’impact de la DLK sur les microtubules a été étudié dans des kératinocytes en culture transduits à l’aide de vecteurs adénoviraux menant à la surexpression de la DLK de même que dans les peaux reconstruites présentant une expression réduite de cette kinase. Ces études ont permis de conclure que la DLK était non seulement en mesure d’induire la réorganisation et la stabilisation des microtubules en périphérie cellulaire, mais que celle-ci était également requise à la réalisation de ces processus. Afin de mieux décrire les mécanismes par lesquels la DLK assure la réorganisation des microtubules en périphérie cellulaire, les effets de la surexpression ou de la sous-expression de la DLK sur les protéines LIS1 et HSP27 (pour Heat shock protein 27 kDa), des régulateurs de la distribution des microtubules, ont été étudiés. Ces analyses ont permis de définir la DLK en tant qu’élément nécessaire à la bonne distribution en périphérie cellulaire de LIS1 et HSP27. Des études plus poussées ont révélé que l’expression de la DLK dans des kératinocytes en culture était non seulement en mesure d’induire la redistribution en périphérie cellulaire d’HSP27, mais également l’insolubilisation et la phosphorylation de cette protéine de choc thermique. Il a également été démontré que l’ensemble de ces processus dépendaient de l’activité de ERK (pour Extracellular-signal Regulated Kinase). Dans le but de définir l’importance des microtubules dans le processus de différenciation des kératinocytes, des peaux reconstruites ont été traitées avec un agent induisant la dépolymérisation de cette composante cytosquelettique soit plus précisément le nocodazole. Un tel traitement produit un phénotype similaire à celui des peaux reconstruites sous-exprimant la DLK suggérant les microtubules comme d’importants effecteurs de la différenciation induite par la DLK. Dans la perspective de mieux définir les effets de la DLK sur la signalisation cellulaire et l’expression génique globale, nous avons eu recours à l’étude de la phosphorylation d’importants médiateurs de la signalisation moléculaire intracellulaire de même qu’à des analyses en micropuce à ADN d’échantillons provenant de peaux reconstruites sous-exprimant la DLK. Cette démarche a permis de révéler une hausse de la phosphorylation de ERK1/2, de JNK1/2/3, de GSK3 (pour Glycogene Synthase Kinase 1) et du récepteur à l’EGF (pour Epidermal Growth Factor). Les analyses en micropuce à ADN ont permis de révéler une réduction dans l’expression de nombreux gènes impliqués dans la formation de l’enveloppe cornée. Finalement, la réduction de c-Jun et de C/EBPα a pu être observée dans les noyaux de peaux reconstruites sous-exprimant la DLK révélant ainsi l’importance de cette kinase dans la régulation de ces facteurs de transcription dans un contexte de différenciation des kératinocytes. Globalement, nos travaux montrent que la DLK est requise pour la différenciation des kératinocytes et que celle-ci y contribue en assurant la réorganisation des microtubules en périphérie cellulaire, la consolidation des desmosomes et des jonctions serrées de même la régulation positive des facteurs c-Jun et C/EBPα. / Skin barrier function greatly depends on proper keratinocyte differentiation in the epidermis. During this process, many changes occur within the cell such as decrease in cell proliferation, cytoskeleton reorganization, changes in gene expression, nucleus and organelles elimination as well as cornified envelope formation. Keratinocyte differentiation must be finely orchestrated since misregulation of this process may lead to pathological conditions. The Dual Leucine zipper-bearing Kinase (DLK) is a Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase Kinase showing a strong expression in the granular layer, the last layer composed of living cells before reaching the cornified layer. Previous studies revealed DLK capacity to induce keratinocyte terminal differentiation process. However, how DLK promotes such an event remains unknown. The main objective of this thesis is to identify mechanisms and potential effectors of the DLK-induced keratinocyte differentiation. Our hypothesis is that DLK is required for keratinocyte differentiation by promoting microtubule stabilization as well as the expression or the activity of transcription factors involved in this process. In order to test our hypothesis, a tissue-engineered skin (TES) model with a reduced DLK expression was produced using a RNA interference approach. Impaired distribution of cornified envelope proteins such as filaggrin and transglutaminase 1 as well as reduced granular and cornified layers were observed in TES with reduced DLK expression. In those samples, immunofluorescence and electron microscopy analyses pointed out desmosomal and tight junctional defects suggesting a role for DLK in the maintenance of these types of cell junctions. The impact of DLK expression on microtubules was also studied in TES with reduced DLK expression and in keratinocytes in culture overexpressing DLK following gene transduction using adenoviral vectors. These studies led to the conclusion that DLK not only promotes but is also required for microtubules reorganization and stabilization to cell periphery. To explain DLK capacity to induce such a process, effects of DLK depletion or overexpression on microtubule regulators such as LIS1 and HSP27 were investigated by immunofluorescence staining. These analyses revealed that DLK induces and is required for LIS1 and HSP27 relocalization to cell periphery. In additional studies, our results show that DLK expression in normal human keratinocytes in culture not only promotes HSP27 distribution to cell periphery but also induces HSP27 insolubilization and phosphorylation in an ERK-dependent manner. In order to more precisely define the role of microtubules in keratinocyte differentiation process, TES were treated with nocodazole, a microtubule depolymerizing agent. The effect of such a treatment was to reproduce the phenotype of DLK-depleted TES suggesting that microtubules are important effectors of DLK-induced keratinocyte differentiation. In an attempt to describe the impact of DLK on global gene expression, RNA samples of DLK-depleted TES were studied using microarray analyses. This approach revealed a reduction in the expression of many genes coding for cornified envelope proteins. Reductions of c-Jun and C/EBPα immunofluorescence staining were also noted in TES with a reduced DLK expression suggesting this kinase as a c-Jun and C/EBPα regulator in the context of keratinocyte differentiation. Globally, our works show that DLK is required for keratinocyte differentiation since it promotes microtubule reorganization to cell periphery, desmosomes and tight junction consolidation as well as c-Jun and C/EBPα localization to the nucleus.