O camundongo mdx, modelo murino para a Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) possui uma mutação de ponto no gene da distrofina que resulta na ausência da proteína no músculo, porém seu fenótipo é brando o que o torna um bom modelo genético e molecular, mas não um bom modelo funcional. Esperando obter um modelo para DMD que tivesse um fenótipo mais fiel ao apresentado pelos pacientes humanos, optou-se por transferir a mutação mdx para o background 129/Sv. Através de cruzamentos sucessivos foram obtidas 3 gerações de animais mdx com background 129/Sv (mdx129) e cada geração foi avaliada funcionalmente por 6 meses. Desde a primeira geração é possível observar que os animais mdx129 são mais fortes do que os mdx originais em background C57BL (mdxC57BL), sendo o oposto do esperado no início dos experimentos. O estudo então foi redirecionado para tentar entender o motivo dessa melhora. Em relação ao padrão histológico, em geral há diferenças entre o mdxC57BL e mdx129. Observa-se também que os animais mdx129 entram no processo de degeneração mais tardiamente que os animais mdxC57BL e seu processo de regeneração se estende por mais tempo. Através de estudos de microarray foi possível observar que os animais 129/Sv apresentam poucos genes diferencialmente expressos (GDEs) em relação aos animais C57BL, portanto os dois backgrounds são muito semelhantes. O mdxC57BL apresenta muito mais GDEs em relação ao seu selvagem (C57BL) do que o mdx129 em relação ao 129/Sv, entretanto, ambos os modelos apresentam mais genes superexpressos do que subexpressos, indicando que as alterações distróficas e regenerativas estão mais associadas com a ativação do que a repressão de genes. Quando os GDEs de ambos os modelos de mdx são distribuídos em categorias funcionais, há o predomínio de genes ligados ao sistema imune e quando essa categoria é omitida para melhor visualização das restantes, observa se que ambos os modelos apresentam categorias funcionais semelhantes, porém com proporções diferentes. No modelo mdx129 se destaca a diminuição da participação da categoria de rota endo/exocítica (tráfego de vesículas) e homeostase e aumento da participação das categorias de matiz extracelular e atividade enzimática. Cada modelo apresenta genes exclusivos, destacando os genes SPP1 e IL1RN na comparação 129/Sv x mdx129F3. O gene SPP1 codifica a proteína osteopontina (OPN) e o polimorfismo rs28357094 neste gene é utilizado como biomarcador de prognóstico para DMD. O papel da OPN na progressão da distrofia não é bem conhecido. Alguns estudos afirmam que a ausência dessa proteína melhora a força muscular de camundongos mdx, enquanto outros apontam que sua participação é necessária para a regeneração muscular. Assim sendo, mais estudos serão necessários para verificar qual seria a via responsável pela melhora fenotípica do modelo mdx129. Já o gene IL1RN codifica a proteína IL-1Ra, a qual é um antagonista de interleucina 1 (citocina pró-inflamatória e pró fibrótica). Portanto o aumento da expressão do gene de seu antagonista sugere que os animais mdx129F3 podem estar mais protegidos do processo inflamatório causado por essas moléculas. Quando analisadas as listas filtradas para músculo esquelético das comparações C57BL x mdxC57BL e 129/Sv x mdx129F3 para a formação de vias metabólicas, foi gerada apenas uma via em ambas as comparações com número relevante de moléculas. A via gerada pela análise da lista C57BL x mdxC57BL possui mais moléculas do que a via gerada pela analise da lista 129/Sv x mdx129F3, porém, todas as moléculas presentes nesta via, estão presentes na via C57BL x mdxC57BL, indicando que mesmo com número diferente de moléculas envolvidas, os genes participam das mesmas vias. Tanto a comparação de cada geração de mdx129 com o 129/Sv como a comparação das gerações entre si mostram que os efeitos da mudança de background estão presentes desde a primeira geração e não se alteram significativamente com os cruzamentos sucessivos. / The mdx mouse, murine model for Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) has a point mutation in the dystrophin gene that results in the absence of the protein in the muscle, however its phenotype is mild, which makes it a good genetic and molecular model, but not a good functional model. Hoping to obtain a model for DMD with a phenotype that is more similar the patients\', it was chosen to transfer the mdx mutation to the 129/Sv background. Through successive breedings, 3 generations of mdx animals with 129/Sv background were obtained and each generation was functionally evaluated for 6 months. Since the first generation it is possible to observe that the mdx129 animals are stronger than the original mdx with C57BL background. The results were the opposite of what was expected in the beginning of the experiments, therefore the study was redirectioned to try to understand the reason of the improved phenotype. About the general histological pattern, there are differences between mdxC57BL and mdx129. It can be observed that the mdx129 animals enter the degenerative process later than the mdxC57BL animals and the regenerative process lasts longer. Through microarray studies it was possible to observe that the 129/Sv animals present few differentially expressed genes (DEGs) in comparison to the C57BL animals; therefore both backgrounds are very similar. The mdxC57BL presents many more DEGs in comparison to C57BL than mdx129 in comparison to 129/Sv, however both models present more super expressed genes than sub expressed, indicating that the dystrophic and regenerative alterations are more associated to the activation rather than the repression of genes. When the DEGs of both mdx models are distributed in functional categories, there is the predominance of genes related to the immune system and when this category is omitted for the better visualization of the remaining, it can be observed that both models present similar functional categories, but with different proportions. In the mdx129 model we can highlight the decrease in participation of the endo/exocytic pathway (vesicle traffic) and homeostasis categories, and increase in participation of the extracellular matrix and enzymatic activity categories. Each model presents exclusive genes, highlighting SPP1 and IL1RN in the comparison 129/Sv x mdx129F3. SPP1 encodes the protein osteopontina (OPN) and the polymorphism rs28357094 in this gene is used as a DMD prognostic biomarker. The role of OPN in the dystrophy progression is not well known. Some studies claim that the absence of OPN increases the muscle strength of the mdx mouse, while others indicate that its participation is necessary to muscle regeneration. More studies are needed to ascertain what pathway is responsible for the phenotypic improvement of the mdx129 model. The IL1RN gene encodes the protein IL-1Ra, and interleukin 1 antagonist, which is a pro-inflammatory and pro-fibrotic cytokine. Therefore, the increase in the expression of its antagonist suggests that the mdx129F3 animals may be more protected from the inflammatory process caused by these molecules. When the filtered lists for skeletal muscle of the comparisons C57BL x mdxC57BL e 129/Sv x mdx129F3 were analyzed for the formation of metabolic pathways, only one pathway was generated in both comparisons. The pathway generated in the analysis C57BL x mdxC57BL has more molecules that the one generated by the 129/Sv x mdx129F3 list, but all molecules present in the latter are also present in the former, indicating that even with different numbers of molecules involved, the genes participate in the same pathways. The comparisons of each generation of mdx129 with the 129/Sv and the comparison of the generations among each other show that the effects of the background change are present since the first generation and are not altered with the successive breedings.

O camundongo mdx é um modelo animal muito utilizado para estudar a distrofia muscular degenerativa de Duchenne (DMD) e apesar de o modelo apresentar uma degeneração mais branda, inúmeras pesquisas com este animal são realizadas devido à alta reprodutibilidade de fenótipos, obtenção comercial de várias linhagens e baixo custo de manutenção. A degeneração muscular progressiva ocorre devido a uma mutação genética que culmina na ausência ou diminuição da produção da proteína distrofina. Esta alteração gera uma cascata de eventos que pioram a degeneração muscular. Atualmente, a terapia preconizada é o uso de corticóide, que visa modular a inflamação muscular e possui uma série de efeitos colaterais, por isso uma série de estudos propondo outras formas de tratamento vem sendo desenvolvidos. Um tratamento promissor parece ser a terapia celular com células-tronco mesenquimais, a qual pode interferir no processo degenerativo por imunomodulação celular. Como a acupuntura pode controlar o processo inflamatório de doenças degenerativas, tal qual na doença de Parkinson, acredita-se que o uso consorciado das duas terapias possa diminuir o efeito degenerativo da DMD. Nesta pesquisa foram avaliados 22 camundongos mdx, machos, 4 a 6 semanas de idade. As células-tronco utilizadas para a aplicação foram de polpa dentária humana carregando a proteína verde fluorescente (EGFP) e a quantidade aplicada em cada acuponto foi de 1x104 células. Os acupontos selecionados foram B47 (Hunmen), B49 (Yishe) e B52 (Zhishi). Os animais foram distribuídos aleatoriamente em quatro tratamentos (A) células-tronco em acupontos falsos, (B) solução fisiológica em acupontos verdadeiros, (C) células-tronco em acupontos verdadeiros e (D) controle, sem nenhum tratamento. No total três injeções foram realizados em um período de 56 dias de estudo. As avaliações do tratamento foram feitas através das análises da força de tração dos músculos, da creatinofosfoquinase sérica (CPK), histológica através da estruturação das miofibrilas e morfometria do colágeno e imuno-histoquímica pela expressão da proteína distrofina. Ao décimo dia após a terceira aplicação de células-tronco observa-se uma diferença somente no grupo controle, a qual manifestou um aumento da CPK em relação aos outros tratamentos e sem diferença estatística para força de tração pelos membros torácicos. Na histologia dos músculos tibial cranial e diafragma foram observou-se infiltrados inflamatórios, regeneração tecidual e diminuição do colágeno nos grupos tratados p<0,05. Na imuno-histoquímica verificou-se uma melhora da quantidade de distrofina nos animais tratados principalmente no tratamento células-tronco em acupontos verdadeiros p< 0,05 e, pela análise do rastreamento das células-tronco com EGFP não se pode determinar o seu caminho uma vez que não observamos imunorreatividade nas análises utilizando o anti-GFP. Conclui-se que os tratamentos com terapia celular nos acupontos verdadeiros, acupontos falsos e solução fisiológica nos acupontos podem melhorar a doença degenerativa muscular no mdx pelo aumento da expressão da proteína distrofina. / Muscular dystrophy in mdx mouse is an animal model used to study Duchenne muscular dystrophy (DMD) in humans. Although this model presents a milder degeneration, there are several studies with this animal due to the high reproducibility of phenotypes, obtaining various lines available and low maintenance cost. It is known that progressive muscle degeneration occurs due to a genetic mutation that culminates in the absence or decreased production of dystrophin protein. This change generates a cascade of events which aggravate the muscle degeneration. Currently, the recommended therapy is the use of corticosteroids to modulate muscle inflammation; however, there are a number of collateral effects, so a series of studies suggesting other forms of treatment have been developed. A promising treatment seems to be a therapy with mesenchymal stem cells, which can interfere with the degenerative process by cellular immunomodulation. As acupuncture can control the inflammatory process of degenerative diseases such as Parkinson\'s disease, the use of both syndication therapies may reduce the DMD degenerative effect. In this study 22 mdx mice, males, 4-6 weeks of age were evaluated. Stem cells were used for the application of human dental pulp carrying the green fluorescent protein (EGFP) and the quantity applied to each acupoint was 1x104 cells. The acupoints selected were B47 (Hunmen), B49 (Yishe) and B52 (Zhishi). The animals were randomly assigned to four treatments groups: (A) stem cells in false acupoints, (B) saline in true acupoints, (C) stem cells in true acupoints and (D) control without any treatment. In total, three injections were performed over a period of 56 days of study. Evaluations of treatment were made by analyzing the tensile strength of muscles, measuring the serum creatine phosphokinase (CPK), structuring of myofibrils by histology and morphometry of collagen immunohistochemistry and by the amount of dystrophin protein. At day ten after the third application of stem cells there is a difference only in the control group, which manifests an increase in CPK compared to other treatments and no statistical difference in tensile strength. In the histology of cranial tibial muscles and diaphragm, inflammatory infiltrates were observed, as well as tissue regeneration and decreased collagen in the treated groups (p <0.05). On immunohistochemistry there was an improvement in the amount of dystrophin in animals treated mainly in acupoints true (p <0.05) and through analysis and tracking of stem cells with EGFP it was not possible to determine its path once immunoreactivity was not observed in analyzes using anti-GFP. We conclude that treatment with stem cell therapy on true and false acupoints and with saline solution on acupoints can improve muscular degenerative disease in mdx by increased expression of dystrophin protein.

O camundongo mdx é um modelo animal muito utilizado para estudar a distrofia muscular degenerativa de Duchenne (DMD) e apesar de o modelo apresentar uma degeneração mais branda, inúmeras pesquisas com este animal são realizadas devido à alta reprodutibilidade de fenótipos, obtenção comercial de várias linhagens e baixo custo de manutenção. A degeneração muscular progressiva ocorre devido a uma mutação genética que culmina na ausência ou diminuição da produção da proteína distrofina. Esta alteração gera uma cascata de eventos que pioram a degeneração muscular. Atualmente, a terapia preconizada é o uso de corticóide, que visa modular a inflamação muscular e possui uma série de efeitos colaterais, por isso uma série de estudos propondo outras formas de tratamento vem sendo desenvolvidos. Um tratamento promissor parece ser a terapia celular com células-tronco mesenquimais, a qual pode interferir no processo degenerativo por imunomodulação celular. Como a acupuntura pode controlar o processo inflamatório de doenças degenerativas, tal qual na doença de Parkinson, acredita-se que o uso consorciado das duas terapias possa diminuir o efeito degenerativo da DMD. Nesta pesquisa foram avaliados 22 camundongos mdx, machos, 4 a 6 semanas de idade. As células-tronco utilizadas para a aplicação foram de polpa dentária humana carregando a proteína verde fluorescente (EGFP) e a quantidade aplicada em cada acuponto foi de 1x104 células. Os acupontos selecionados foram B47 (Hunmen), B49 (Yishe) e B52 (Zhishi). Os animais foram distribuídos aleatoriamente em quatro tratamentos (A) células-tronco em acupontos falsos, (B) solução fisiológica em acupontos verdadeiros, (C) células-tronco em acupontos verdadeiros e (D) controle, sem nenhum tratamento. No total três injeções foram realizados em um período de 56 dias de estudo. As avaliações do tratamento foram feitas através das análises da força de tração dos músculos, da creatinofosfoquinase sérica (CPK), histológica através da estruturação das miofibrilas e morfometria do colágeno e imuno-histoquímica pela expressão da proteína distrofina. Ao décimo dia após a terceira aplicação de células-tronco observa-se uma diferença somente no grupo controle, a qual manifestou um aumento da CPK em relação aos outros tratamentos e sem diferença estatística para força de tração pelos membros torácicos. Na histologia dos músculos tibial cranial e diafragma foram observou-se infiltrados inflamatórios, regeneração tecidual e diminuição do colágeno nos grupos tratados p<0,05. Na imuno-histoquímica verificou-se uma melhora da quantidade de distrofina nos animais tratados principalmente no tratamento células-tronco em acupontos verdadeiros p< 0,05 e, pela análise do rastreamento das células-tronco com EGFP não se pode determinar o seu caminho uma vez que não observamos imunorreatividade nas análises utilizando o anti-GFP. Conclui-se que os tratamentos com terapia celular nos acupontos verdadeiros, acupontos falsos e solução fisiológica nos acupontos podem melhorar a doença degenerativa muscular no mdx pelo aumento da expressão da proteína distrofina. / Muscular dystrophy in mdx mouse is an animal model used to study Duchenne muscular dystrophy (DMD) in humans. Although this model presents a milder degeneration, there are several studies with this animal due to the high reproducibility of phenotypes, obtaining various lines available and low maintenance cost. It is known that progressive muscle degeneration occurs due to a genetic mutation that culminates in the absence or decreased production of dystrophin protein. This change generates a cascade of events which aggravate the muscle degeneration. Currently, the recommended therapy is the use of corticosteroids to modulate muscle inflammation; however, there are a number of collateral effects, so a series of studies suggesting other forms of treatment have been developed. A promising treatment seems to be a therapy with mesenchymal stem cells, which can interfere with the degenerative process by cellular immunomodulation. As acupuncture can control the inflammatory process of degenerative diseases such as Parkinson\'s disease, the use of both syndication therapies may reduce the DMD degenerative effect. In this study 22 mdx mice, males, 4-6 weeks of age were evaluated. Stem cells were used for the application of human dental pulp carrying the green fluorescent protein (EGFP) and the quantity applied to each acupoint was 1x104 cells. The acupoints selected were B47 (Hunmen), B49 (Yishe) and B52 (Zhishi). The animals were randomly assigned to four treatments groups: (A) stem cells in false acupoints, (B) saline in true acupoints, (C) stem cells in true acupoints and (D) control without any treatment. In total, three injections were performed over a period of 56 days of study. Evaluations of treatment were made by analyzing the tensile strength of muscles, measuring the serum creatine phosphokinase (CPK), structuring of myofibrils by histology and morphometry of collagen immunohistochemistry and by the amount of dystrophin protein. At day ten after the third application of stem cells there is a difference only in the control group, which manifests an increase in CPK compared to other treatments and no statistical difference in tensile strength. In the histology of cranial tibial muscles and diaphragm, inflammatory infiltrates were observed, as well as tissue regeneration and decreased collagen in the treated groups (p <0.05). On immunohistochemistry there was an improvement in the amount of dystrophin in animals treated mainly in acupoints true (p <0.05) and through analysis and tracking of stem cells with EGFP it was not possible to determine its path once immunoreactivity was not observed in analyzes using anti-GFP. We conclude that treatment with stem cell therapy on true and false acupoints and with saline solution on acupoints can improve muscular degenerative disease in mdx by increased expression of dystrophin protein.

Orientador: Valeria Helena Alves Cagnon Quitete / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T16:32:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pinto_LeslieCristina_M.pdf: 6161359 bytes, checksum: e53c13123d8d830910aa70a9f89b179c (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A distroglicana (DG) é uma importante proteína estrutural a qual está envolvida no desenvolvimento celular epitelial, formação de membrana basal e manutenção da integridade de diferentes tecidos. Estudos indicaram que a alteração na expressão da DG é um evento freqüente nas malignecências humanas e sugerem que esta molécula tem um papel importante no desenvolvimento de tumor. No câncer de próstata, verificou-se expressiva redução das distroglicanas, especialmente da _-DG, acarretando em progressão tumoral e ocorrência de metástases. Desta maneira, alterações na expressão das distroglicanas podem ser relevantes na patogênese das doenças prostáticas. Além disto, estas moléculas fazem parte de um complexo glicoproteíco e estão relacionadas a uma série de proteínas tais como, agrinas, lamininas e a distrofina. Devido à deficiência de distrofina, este complexo está desestruturado na distrofia muscular de Duchenne e, no camundongo mdx. Este trabalho teve como objetivos caracterizar a estrutura epitelial e estromal do lobo ventral da próstata do camundongo mdx, identificar a ocorrência de receptores para distroglicanas _ e _, IGF-1, laminina _-3, estabelecer correlações entre os processos de proliferação e morte celular e analisar a viabilidade do camundongo mdx como modelo experimental no estudo de patologias prostáticas. Um total de 30 animais (15 C57BL10 e 15 mdx) foi dividido em 2 grupos experimentais: controle e mdx. Amostras do lobo ventral da próstata foram coletadas para análises macroscópicas, imunohistoquímicas, microscopias de luz e eletrônica de transmissão e análises morfométricas. Dosagens sorológicas de estradiol e testosterona foram realizadas. Os resultados mostraram que os níveis séricos de testosterona foram significativamente diminuídos nos camundongos mdx em relação aos controles. Em contraste, os níveis séricos de estradiol do grupo mdx mostraram-se significativamente aumentados em relação ao controle. Acentuada atrofia celular, ocorrência de neoplasia intraepitelial prostática, hipertrofia estromal, presença de células inflamatórias e hipertrofia estromal foram evidenciadas nos animais mdx. A intensidade da reação de imunolocalização da distroglicana foi de fraca expressão em relação ao controle, assim como a da laminina. Já a imunolocalização do IGF foi intensa em relação ao controle. Conclui-se que os animais mdx apresentaram alterações significativas na integridade estrutural e molecular prostática, com sinais de aumento do processo proliferativo, comprometendo a homeostase glandular e o processo reprodutivo destes animais. / Abstract: The prostate is a fundamental accessory sex gland for the male reproductive process and the stroma-epithelium interaction has an important role in prostate structural maintenance and function. The basal membrane is an interaction link, offering mechanical and physiological support. Nowadays, different studies suggest that dystroglycan (DG), which is an adhesion protein, plays a role in different types of cancer development and progression, including that of the prostate. Thus, the aims of this work were to characterize structural, ultrastructural and proliferative features of the prostatic stroma and epithelium of mdx mice; to verify the immunolocalization of the _ and ß dystroglycan, IGF-I and laminin _3 receptors; and to relate those structural and molecular events to prostate pathogenesis as well as to verify the viability of this experimental model in prostate disease studies. Thirty male mice (mdx and C57BL10/Uni) were divided into two groups: control and mdx. Samples from the ventral prostate were collected for immunological, Western Blotting, transmission electron and light microscopies and morphometrical analyses. Estradiol and testosterone measurements were verified. The results showed diminished testosterone and increased estradiol levels in the mdx group. Atrophied cells, stromal hypertrophy and prostatic intraepithelial were verified in the mdx mice. Weak _ and ß dystroglycan and laminin _3 immunolocalization was verified in the mdx group. However, intense IGF-I receptor localization was identified in the mdx animals. Thus, it was concluded that mdx animals presented changes in the molecular and structural integrity and proliferation signals, leading to glandular pathogenesis, compromising prostate homeostasis and the reproductive process. Apart from this, the destructuring of the dystroglycandystrophin complex can be considered a trigger factor for prostate pathogenesis. It can also point towards that the steroid-hormone and IGF relationship can be an alternative towards new therapies to treat prostatic diseases. / Mestrado / Anatomia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

O camundongo mdx, modelo murino para a Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) possui uma mutação de ponto no gene da distrofina que resulta na ausência da proteína no músculo, porém seu fenótipo é brando o que o torna um bom modelo genético e molecular, mas não um bom modelo funcional. Esperando obter um modelo para DMD que tivesse um fenótipo mais fiel ao apresentado pelos pacientes humanos, optou-se por transferir a mutação mdx para o background 129/Sv. Através de cruzamentos sucessivos foram obtidas 3 gerações de animais mdx com background 129/Sv (mdx129) e cada geração foi avaliada funcionalmente por 6 meses. Desde a primeira geração é possível observar que os animais mdx129 são mais fortes do que os mdx originais em background C57BL (mdxC57BL), sendo o oposto do esperado no início dos experimentos. O estudo então foi redirecionado para tentar entender o motivo dessa melhora. Em relação ao padrão histológico, em geral há diferenças entre o mdxC57BL e mdx129. Observa-se também que os animais mdx129 entram no processo de degeneração mais tardiamente que os animais mdxC57BL e seu processo de regeneração se estende por mais tempo. Através de estudos de microarray foi possível observar que os animais 129/Sv apresentam poucos genes diferencialmente expressos (GDEs) em relação aos animais C57BL, portanto os dois backgrounds são muito semelhantes. O mdxC57BL apresenta muito mais GDEs em relação ao seu selvagem (C57BL) do que o mdx129 em relação ao 129/Sv, entretanto, ambos os modelos apresentam mais genes superexpressos do que subexpressos, indicando que as alterações distróficas e regenerativas estão mais associadas com a ativação do que a repressão de genes. Quando os GDEs de ambos os modelos de mdx são distribuídos em categorias funcionais, há o predomínio de genes ligados ao sistema imune e quando essa categoria é omitida para melhor visualização das restantes, observa se que ambos os modelos apresentam categorias funcionais semelhantes, porém com proporções diferentes. No modelo mdx129 se destaca a diminuição da participação da categoria de rota endo/exocítica (tráfego de vesículas) e homeostase e aumento da participação das categorias de matiz extracelular e atividade enzimática. Cada modelo apresenta genes exclusivos, destacando os genes SPP1 e IL1RN na comparação 129/Sv x mdx129F3. O gene SPP1 codifica a proteína osteopontina (OPN) e o polimorfismo rs28357094 neste gene é utilizado como biomarcador de prognóstico para DMD. O papel da OPN na progressão da distrofia não é bem conhecido. Alguns estudos afirmam que a ausência dessa proteína melhora a força muscular de camundongos mdx, enquanto outros apontam que sua participação é necessária para a regeneração muscular. Assim sendo, mais estudos serão necessários para verificar qual seria a via responsável pela melhora fenotípica do modelo mdx129. Já o gene IL1RN codifica a proteína IL-1Ra, a qual é um antagonista de interleucina 1 (citocina pró-inflamatória e pró fibrótica). Portanto o aumento da expressão do gene de seu antagonista sugere que os animais mdx129F3 podem estar mais protegidos do processo inflamatório causado por essas moléculas. Quando analisadas as listas filtradas para músculo esquelético das comparações C57BL x mdxC57BL e 129/Sv x mdx129F3 para a formação de vias metabólicas, foi gerada apenas uma via em ambas as comparações com número relevante de moléculas. A via gerada pela análise da lista C57BL x mdxC57BL possui mais moléculas do que a via gerada pela analise da lista 129/Sv x mdx129F3, porém, todas as moléculas presentes nesta via, estão presentes na via C57BL x mdxC57BL, indicando que mesmo com número diferente de moléculas envolvidas, os genes participam das mesmas vias. Tanto a comparação de cada geração de mdx129 com o 129/Sv como a comparação das gerações entre si mostram que os efeitos da mudança de background estão presentes desde a primeira geração e não se alteram significativamente com os cruzamentos sucessivos. / The mdx mouse, murine model for Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) has a point mutation in the dystrophin gene that results in the absence of the protein in the muscle, however its phenotype is mild, which makes it a good genetic and molecular model, but not a good functional model. Hoping to obtain a model for DMD with a phenotype that is more similar the patients\', it was chosen to transfer the mdx mutation to the 129/Sv background. Through successive breedings, 3 generations of mdx animals with 129/Sv background were obtained and each generation was functionally evaluated for 6 months. Since the first generation it is possible to observe that the mdx129 animals are stronger than the original mdx with C57BL background. The results were the opposite of what was expected in the beginning of the experiments, therefore the study was redirectioned to try to understand the reason of the improved phenotype. About the general histological pattern, there are differences between mdxC57BL and mdx129. It can be observed that the mdx129 animals enter the degenerative process later than the mdxC57BL animals and the regenerative process lasts longer. Through microarray studies it was possible to observe that the 129/Sv animals present few differentially expressed genes (DEGs) in comparison to the C57BL animals; therefore both backgrounds are very similar. The mdxC57BL presents many more DEGs in comparison to C57BL than mdx129 in comparison to 129/Sv, however both models present more super expressed genes than sub expressed, indicating that the dystrophic and regenerative alterations are more associated to the activation rather than the repression of genes. When the DEGs of both mdx models are distributed in functional categories, there is the predominance of genes related to the immune system and when this category is omitted for the better visualization of the remaining, it can be observed that both models present similar functional categories, but with different proportions. In the mdx129 model we can highlight the decrease in participation of the endo/exocytic pathway (vesicle traffic) and homeostasis categories, and increase in participation of the extracellular matrix and enzymatic activity categories. Each model presents exclusive genes, highlighting SPP1 and IL1RN in the comparison 129/Sv x mdx129F3. SPP1 encodes the protein osteopontina (OPN) and the polymorphism rs28357094 in this gene is used as a DMD prognostic biomarker. The role of OPN in the dystrophy progression is not well known. Some studies claim that the absence of OPN increases the muscle strength of the mdx mouse, while others indicate that its participation is necessary to muscle regeneration. More studies are needed to ascertain what pathway is responsible for the phenotypic improvement of the mdx129 model. The IL1RN gene encodes the protein IL-1Ra, and interleukin 1 antagonist, which is a pro-inflammatory and pro-fibrotic cytokine. Therefore, the increase in the expression of its antagonist suggests that the mdx129F3 animals may be more protected from the inflammatory process caused by these molecules. When the filtered lists for skeletal muscle of the comparisons C57BL x mdxC57BL e 129/Sv x mdx129F3 were analyzed for the formation of metabolic pathways, only one pathway was generated in both comparisons. The pathway generated in the analysis C57BL x mdxC57BL has more molecules that the one generated by the 129/Sv x mdx129F3 list, but all molecules present in the latter are also present in the former, indicating that even with different numbers of molecules involved, the genes participate in the same pathways. The comparisons of each generation of mdx129 with the 129/Sv and the comparison of the generations among each other show that the effects of the background change are present since the first generation and are not altered with the successive breedings.

Submitted by Daniella Sodre (daniella.sodre@ufpe.br) on 2015-03-10T14:34:52Z No. of bitstreams: 2 Dissertação Erivam Albuquerque.pdf: 3919411 bytes, checksum: 7328a5604bc62ceab8398911b9c1b0a3 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-11T17:33:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação Erivam Albuquerque.pdf: 3919411 bytes, checksum: 7328a5604bc62ceab8398911b9c1b0a3 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013-04-22 / A MultiDimensional eXpression (MDX) é uma linguagem de consulta para processamento analítico de dados ou On-line Analytical Processing (OLAP). Apesar de esta linguagem ser usada pela maioria dos servidores OLAP, esta não é um padrão de direito. Portanto, tem-se pouca (ou nenhuma) garantia de que as funções MDX usadas por um servidor OLAP também possam ser usadas em outros servidores. Neste contexto, de forma a comparar as funções MDX de um servidor OLAP de código aberto e outro de código fechado, os servidores Mondrian e Analysis Services, por serem bem aceitos tanto pela academia quanto pela indústria, foram respectivamente escolhidos. Para realizar este estudo comparativo, o qual consiste em examinar se existe diferença entre as gramáticas da linguagem MDX usadas por estes servidores, será utilizada a seguinte estratégia: identificar quais funções são específicas de um servidor, quais funções são comuns aos servidores e, dentre as funções comuns (i.e., com o mesmo nome), se existe diferença de sintaxe entre elas. De forma a executar este estudo, será apresentado o cenário de testes aplicados, bem como a ferramenta TestMDX que foi desenvolvida para automatizar a execução dos testes. Por fim, será apresentada uma análise dos resultados obtidos.

Submitted by João Arthur Martins (joao.arthur@ufpe.br) on 2015-03-10T17:47:24Z No. of bitstreams: 2 Dissertação Erivam Albuquerque.pdf: 3919411 bytes, checksum: 7328a5604bc62ceab8398911b9c1b0a3 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-11T17:28:46Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação Erivam Albuquerque.pdf: 3919411 bytes, checksum: 7328a5604bc62ceab8398911b9c1b0a3 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013-04-22 / A MultiDimensional eXpression (MDX) é uma linguagem de consulta para processamento analítico de dados ou On-line Analytical Processing (OLAP). Apesar de esta linguagem ser usada pela maioria dos servidores OLAP, esta não é um padrão de direito. Portanto, tem-se pouca (ou nenhuma) garantia de que as funções MDX usadas por um servidor OLAP também possam ser usadas em outros servidores. Neste contexto, de forma a comparar as funções MDX de um servidor OLAP de código aberto e outro de código fechado, os servidores Mondrian e Analysis Services, por serem bem aceitos tanto pela academia quanto pela indústria, foram respectivamente escolhidos. Para realizar este estudo comparativo, o qual consiste em examinar se existe diferença entre as gramáticas da linguagem MDX usadas por estes servidores, será utilizada a seguinte estratégia: identificar quais funções são específicas de um servidor, quais funções são comuns aos servidores e, dentre as funções comuns (i.e., com o mesmo nome), se existe diferença de sintaxe entre elas. De forma a executar este estudo, será apresentado o cenário de testes aplicados, bem como a ferramenta TestMDX que foi desenvolvida para automatizar a execução dos testes. Por fim, será apresentada uma análise dos resultados obtidos.

The American Cancer Society predicted that 230,480 women would be diagnosed with, and 39,520 women would die from breast cancer (BC) in the United States in 2011. While the incidence of female BC has been decreasing, BC remains the second leading cause of cancer death among women in the United States. Cancer cachexia, the cancer-related loss of muscle, affects up to 25% of BC patients and is associated with poor prognosis and decreased quality of life. Alterations to the dystrophin glycoprotein complex (DGC), a transmembrane, multi-subunit protein complex with structural and signaling roles, have been reported in mammary tumors of BC patients and skeletal muscles of cachectic cancer patients. However, this complex is most frequently studied for its role in Duchenne muscular dystrophy (DMD), a severe, progressive muscle wasting disease. Despite the similar alterations reported in these diseases, it is unclear whether alterations in the DGC in one tissue can impact the progression of disease in another. Purpose: The purpose of the studies described in this dissertation was to identify differences in body composition, energy expenditure and plasma cytokine content between the C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J (mdx) mouse model of DMD and C57BL/10ScSnJ (BL/10) control mice and to determine whether systemic alteration of the DGC (as observed in the mdx mouse) alters the growth of E0771 murine mammary tumors. Results: There were differences in body composition and plasma cytokine profiles between mdx and BL/10 mice. We also found that, relative to controls, the tumor–induced increase in cytokines that promote invasion and metastasis was not as severe in mdx mice. Conclusions: This study revealed several differences between mdx and BL/10 mice and provides support for the suggestion that the mdx mouse may not be an accurate model of DMD. In addition, the improved cytokine profile of tumor-bearing mdx mice suggests that the acute phase of DMD may be protective against BC invasion and metastasis. Further research should confirm this effect and determine whether alterations in the DGC of the mdx mouse are directly or indirectly responsible. / Ph. D.

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La distròfia muscular de Duchenne (DMD) és una de les malalaties recessives lligades al cromosoma X més comuns essent la seva causa primària el dèficit de distrofina, proteïna localitzada en la cara interna del sarcolema. La soca de ratolí mdx també presenta un dèficit total de distrofina i és el model animal més àmpliament utilitzat per aquesta malaltia. Malgrat el seu dèficit de distrofina, el ratolí mdx no presenta un fenotip distròfic tan sever com l'observat en la DMD humana. S'han apuntat dues hipòtesis per tractar d'explicar aquestes diferències entre la malaltia humana i el model murí. La primera atribuirïa al ratolí capacitat regenerativa més gran, mentre que la segona li atribuirïa un descens del seu ritme de necrosi a partir de cert moment de la seva vida. En aquest treball intentem clarificar aquest aspecte mitjançant diferents aproximacions: i) caracterizació morfològica de la patologia muscular durant tota la vida del ratolí mdx i estudi de marcadors de necrosi-regeneració, ii) estudi de la expressió de utrofina (proteïna que presenta elevada homologia amb la distrofina) i b-distroglicà (el lligand natural de la distrofina), iii) caracterització del paper de la proteasa uPA en la regeneració muscular, iv) el doble mutant mdx/uPA-/- com model de necrosi espontània i capacitat regenerativa disminuïda i finalment v) identificació i caracterització de noves proteïnes implicades en el procés de regeneració muscular i/o protecció enfront de la necrosi. Els resultats derivats de la caracterització morfològica apunten que el ratolí mdx no presenta necrosi durant les seves dues primers setmanes de vida, moment a partir del qual comença un increment d'aquest fenòmen arribant a un màxim al voltant dels dos mesos per a, posteriorment experimentar un descens gradual però important de l'activitat necròtica. L'anàlisi evolutiu de marcadors de necrosi-regeneració també comfirma aquesta aparició i posterior decrement de la necrosi muscular. L'estudi evolutiu de l'expressió de utrofina, ens ha permès observar com aquesta preoteïna despareix a les dues setmanes de vida, coincidint amb l'inici del descens de la necrosi muscular en els ratolins mdx, mentre que el seu posterior increment en aquests ratolins coincideix amb l'inici de la fase en que la necrosis es mostra molt més lleu. A més, els nivells de utrofina presenten una bona correlació amb els nivells b-distroglicà, comfirmant la capacitat de la utrofina per unir-se amb el que és el lligand natural de la distrofina. Aquests resultats atribueixen a la utrofina un paper com a substituta de al distrofina en el ratolí carent de distrofina.Per altre banda, el ratolí carent de uPA (uPA-/-) presenta una important reducció de la capacitat regenerativa muscular, presentant un retard temporal important en el procés regeneratiu, una acumulació de fibrina en el teixit necròtic i una disminució del reclutament de macròfags en la zona lesionada respecte els ratolins control. El tractament amb Ancrod (una toxina fibrinolítica) restaura sensiblement la seva su capacitat de regeneració. Per la seva banda, el múscul del ratolí doble mutant mdx/uPA-/- presenta un aspecte més distròfic, destacant importants acumulacions de fibres necròtiques calcificades, un augment de grups necròtics deguts a una disminució de la seva capacitat regenerativa, un pes corporal menor que les soques mdx i uPA-/- així com una mortalitat propera al 80% tot i que aquesta es concentra exclusivament en el periode de necrosi màxima. Aquests resultats confirmen la importància que té la proteasa uPA en el procés de la regeneració muscular i ens mostren com la capacitat regenerativa només només és limitant en el ratolí mdx durant el periode de màxima necrosi.Finalment, mitjançant un estudi d'expressió diferencial de gens entre ratolins controls i mdx hem pogut identificar 9 seqüències clarament sobreexpressades en ratolins mdx, essent les més interessants la tetraspanina CD63 i la seqüència anomenada B2. Experiments destinats a analitzar l'expressió d'aquestes dues seqüències ens indiquen que CD63 és també expressada en els ratolins control tot i que a nivells lleugerament inferiors que els mdx i que la seva expressió és elevada però constant durant la diferenciació de la línia mioblàstica murina C2C12 in vitro. La B2 es clarament diferencial, essent expressada per ratolins mdx i no expressada o a nivells molt baixos en controls, presentant un pic d'expressió als 3 i 6 dies de diferenciació en la línia mioblàstica murina C2C12 in vitro. / Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is one of the most common X-linked diseases. DMD is due to mutations in the DMD gene, which results in lack or dysfunction of dystrophin, a 427 KDa protein localised at the inner face of the sarcolemma. The mdx mice, the most useful animal model for DMD, carry a nonsense mutation in exon 23 of the dystrophin gene that causes lack of dystrophin. Despite some genetic, biochemical and histological similarities between DMD and mdx mice, clinical manifestations are less severe in mdx mice than humans. To explain these differences, some authors proposed that mdx mice have greater regenerative capacity than humans, thus allowing them to repair the continuous necrotic events of their skeletal muscle fibres. On the other hand, it has been suggested that a decreased necrosis in mid-age and old mdx mice may underlie the clinical differences between mdx mice and DMD patients. In this work we clarify these questions using different approximations: i) morphologic characterisation of the muscular pathology during mdx mice lifespan and study of the evolution of necrosis-regeneration markers, ii) evolutive utrophin (dystrophin high-homology protein) expression study and b-dystroglycan (the natural ligand of dystrophin), iii) characterisation of the role of urokinase type plasminogen activator (uPA) during muscular regeneration, iv) the double mutant mdx/uPA-/- as both spontaneous necrosis and impaired regeneration model and finally v) identification and characterisation of new sequences implicated in the muscular regeneration process and or in the protection against necrosis. The results obtained in the morphologic characterisation indicate that necrosis in mdx mice is scarce during first two weeks, become very active with a peak at two months and then progressively fade, remaining at very low levels. The evolutive analysis of the necrosis-regeneration markers also confirms its apparition and posterior decrement. The evolutive study of utrophin expression shows that this protein practically disappear at two weeks of age, coinciding with the onset of necrosis and its posterior increase in mdx mice is concomitant with the decrease of the muscular necrosis. Furthermore, utrophin levels show a consistent correlation with b-dystroglycan levels, confirming that utrophin is able to bind and stabilise b-dystroglycan in the sarcolemma. These results confirm a role of utrophin as a substitute of dystrophin in the mdx mice sarcolemma.The uPA deficient mice (uPA-/-) suffer an important muscular regenerative capacity reduction, showing a severe delay in the regeneration process, an abnormal fibrin accumulation in the necrotic tissue and a reduction of macrophage recruitment in the zone of injury. Ancrod treatment (fibrinolitic toxin) restores significantly its regenerative capacity. Interestingly, the double mutant mdx/uPA-/- muscle shows a more severe phenotype than mdx, with important accumulation of necrotic fibbers with calcium depositions, an increment of degenerative-regenerative groups due to the reduction of its regenerative capacity, a reductions on its corporal weight compared to mdx and uPA -/- strains and the mortality of the strain is near the 80% but concentrated exclusively in the maximal necrosis period. These results demonstrate the critical importance of uPA in the muscular regeneration process and show that, in a mdx background, the regenerative capacity is only limiting during the maximal necrosis period.Finally, using a differential expression study comparing mdx and control mice we have identified 9 sequences overexpressed in mdx mice, being the more interesting ones the tetraspanin CD63 and an unknown sequence named B2. The characterisation of its expression shows that CD63 is expressed in control mice but in the mdx mice its expression is slightly higher and that its expression is high and constant during the differentiation of the murine mioblastic line C2C12 in vitro. B2 expression is clearly differential, induced in mdx mice and not expressed or expressed at a very low levels in controls, and shows a peak of expression at days 3 and 6 days of differentiation in the murine mioblastic line C2C12 in vitro.