O objetivo deste trabalho foi buscar genes MHC classe I em bovinos expressos durante o desenvolvimento embrionário e gestação que apresentassem similaridade ao gene Ped murino. Para tanto, embriões de PIV e placentas de fetos produzidos por monta natural ou clonados tiveram seu RNA extraído. A partir do RNA extraído foi realizada a produção de cDNA para tentar o isolamento de fragmentos com similaridade ao gene descrito em murinos. Uma vez isolados, os fragmentos foram purificados ou clonados em plasmídeo. As amostras foram seqüenciadas e as seqüências obtidas foram avaliadas, editadas e comparadas a outras seqüências pelo programa BLAST. A expressão de proteína MHC-Ib foi verificada em embriões (D7) e nas amostras de placenta utilizando anticorpo monoclonal de camundongo anti-Qa-2 marcado com FITC. A seqüência consenso obtida produziu alinhamentos significantes com os genes do complexo Bola que faz parte do MHC classe I bovino. O alinhamento entre a seqüência consenso e as seqüências de Q7 (Ped) e HLA-G publicados anteriormente demonstrou poucas variações de nucleotídeos entre as seqüências. As amplificações de cDNA de embriões que atingiram o quarto ciclo celular em até 48 hpi (R8) e em 48-90 hpi (L8) e de embriões que atingiram o estádio de blastocisto expandido em 7 dias de cultivo (RR) e em 9 dias de cultivo (RL) mostraram que o fragmento cuja seqüência apresenta alta similaridade ao gene Ped, está presente em embriões RR e RL, mas não em embriões no estádio de 8 células. Em placentas, o resultado da PCR mostrou a amplificação de oito fragmentos em diferentes fases da gestação. O sequenciamento dos fragmentos gerou nove seqüências consenso similares ao gene Ped e também a seqüências obtidas a partir de embriões bovinos. O alinhamento das seqüências mostrou a existência de duas isoformas contendo edição alternativa no exon 2 ou no exon 3. O resultado indicou a existência de polimorfismo ou mais de um gene com alta similaridade ao gene Q7 sendo transcritos durante o período gestacional. A expressão de proteína MHC-Ib foi verificada na membrana de células do trofoblasto e da MCI de embriões e na porção materno fetal de placentas, com uma maior expressão na porção fetal. Placentas oriundas de fetos clonados apresentam maior fluorescência comparada àquelas oriundas de monta natural. Este trabalho identificou, em embriões bovinos, um possível gene homólogo ao Ped murino e a expressão de proteína semelhante àquela codificada por este gene e conclui que existem vários transcritos com similaridade ao gene Q7 sendo expressos na região materno-fetal da placenta, durante a gestação em bovinos, assim como nos embriões / The aim of the present work was to identify bovine MHC class I genes similar to the murine Ped gene expressing during embryonic development and pregnancy. Bovine in vitro produced embryos and placentas obtained from natural mating or cloning-derived fetuses had their RNA extracted. cDNA was synthesized to isolate fragments showing similarity with the gene described in mice. Once isolated the fragments were purified or cloned into plasmids. The samples were sequenced and obtained sequences edited and compared to other sequences by means of the BLAST software. The expression of MHC-Ib protein was evaluated in embryos (D7) and in placentas using a FITC conjugated mouse monoclonal antibody anti-Qa-2. The consensus sequence amplified from blastocyst cDNA produced significant alignments with genes of the Bola complex, which is part of the bovine MHC class I. The alignment between the consensus sequence and the previously published Q7 and HLA-G sequences demonstrated little nucleotide variations among the sequences. The cDNA amplifications of embryos at the fourth cellular cicle in 48hpi (F8); 48-90hpi (S8) and embryos that reached blastocyst expanded stage in 7 days (FF); in 9 days (FS) showed that the Ped candidate gene is present in FF and FS but not in 8-cell embryos. In placentas, the PCR resulted in amplification of eight fragments at different pregnancy stages. Sequencing of the fragments generated nine consensus sequences, similar to the Ped gene and also to sequences obtained from bovine embryos. The alignment of the sequences showed the existence of two isoforms containing an alternative splicing on exon 2 or 3. This result indicates the existence of polymorphisms or that more than one gene with high similarity to the Q7 gene are transcribed during pregnancy. Expression of MHC-Ib protein was verified in trophoblast membrane and embryos inner cell mass cells and in the maternal-fetal portion in placentas, with a greater expression in the fetal portion. Cloned fetuses placentas presented grater fluorescence compared to natural mated. Overall this work identified in bovine embryos a possible gene homologous to the murine Ped and the expression of protein similar to that coded by this gene and concluded that there are many transcripts similar to the Q7 gene being expressed in the maternal-fetal region of the placenta during pregnancy in bovine and such as in embryos

O objetivo deste trabalho foi buscar genes MHC classe I em bovinos expressos durante o desenvolvimento embrionário e gestação que apresentassem similaridade ao gene Ped murino. Para tanto, embriões de PIV e placentas de fetos produzidos por monta natural ou clonados tiveram seu RNA extraído. A partir do RNA extraído foi realizada a produção de cDNA para tentar o isolamento de fragmentos com similaridade ao gene descrito em murinos. Uma vez isolados, os fragmentos foram purificados ou clonados em plasmídeo. As amostras foram seqüenciadas e as seqüências obtidas foram avaliadas, editadas e comparadas a outras seqüências pelo programa BLAST. A expressão de proteína MHC-Ib foi verificada em embriões (D7) e nas amostras de placenta utilizando anticorpo monoclonal de camundongo anti-Qa-2 marcado com FITC. A seqüência consenso obtida produziu alinhamentos significantes com os genes do complexo Bola que faz parte do MHC classe I bovino. O alinhamento entre a seqüência consenso e as seqüências de Q7 (Ped) e HLA-G publicados anteriormente demonstrou poucas variações de nucleotídeos entre as seqüências. As amplificações de cDNA de embriões que atingiram o quarto ciclo celular em até 48 hpi (R8) e em 48-90 hpi (L8) e de embriões que atingiram o estádio de blastocisto expandido em 7 dias de cultivo (RR) e em 9 dias de cultivo (RL) mostraram que o fragmento cuja seqüência apresenta alta similaridade ao gene Ped, está presente em embriões RR e RL, mas não em embriões no estádio de 8 células. Em placentas, o resultado da PCR mostrou a amplificação de oito fragmentos em diferentes fases da gestação. O sequenciamento dos fragmentos gerou nove seqüências consenso similares ao gene Ped e também a seqüências obtidas a partir de embriões bovinos. O alinhamento das seqüências mostrou a existência de duas isoformas contendo edição alternativa no exon 2 ou no exon 3. O resultado indicou a existência de polimorfismo ou mais de um gene com alta similaridade ao gene Q7 sendo transcritos durante o período gestacional. A expressão de proteína MHC-Ib foi verificada na membrana de células do trofoblasto e da MCI de embriões e na porção materno fetal de placentas, com uma maior expressão na porção fetal. Placentas oriundas de fetos clonados apresentam maior fluorescência comparada àquelas oriundas de monta natural. Este trabalho identificou, em embriões bovinos, um possível gene homólogo ao Ped murino e a expressão de proteína semelhante àquela codificada por este gene e conclui que existem vários transcritos com similaridade ao gene Q7 sendo expressos na região materno-fetal da placenta, durante a gestação em bovinos, assim como nos embriões / The aim of the present work was to identify bovine MHC class I genes similar to the murine Ped gene expressing during embryonic development and pregnancy. Bovine in vitro produced embryos and placentas obtained from natural mating or cloning-derived fetuses had their RNA extracted. cDNA was synthesized to isolate fragments showing similarity with the gene described in mice. Once isolated the fragments were purified or cloned into plasmids. The samples were sequenced and obtained sequences edited and compared to other sequences by means of the BLAST software. The expression of MHC-Ib protein was evaluated in embryos (D7) and in placentas using a FITC conjugated mouse monoclonal antibody anti-Qa-2. The consensus sequence amplified from blastocyst cDNA produced significant alignments with genes of the Bola complex, which is part of the bovine MHC class I. The alignment between the consensus sequence and the previously published Q7 and HLA-G sequences demonstrated little nucleotide variations among the sequences. The cDNA amplifications of embryos at the fourth cellular cicle in 48hpi (F8); 48-90hpi (S8) and embryos that reached blastocyst expanded stage in 7 days (FF); in 9 days (FS) showed that the Ped candidate gene is present in FF and FS but not in 8-cell embryos. In placentas, the PCR resulted in amplification of eight fragments at different pregnancy stages. Sequencing of the fragments generated nine consensus sequences, similar to the Ped gene and also to sequences obtained from bovine embryos. The alignment of the sequences showed the existence of two isoforms containing an alternative splicing on exon 2 or 3. This result indicates the existence of polymorphisms or that more than one gene with high similarity to the Q7 gene are transcribed during pregnancy. Expression of MHC-Ib protein was verified in trophoblast membrane and embryos inner cell mass cells and in the maternal-fetal portion in placentas, with a greater expression in the fetal portion. Cloned fetuses placentas presented grater fluorescence compared to natural mated. Overall this work identified in bovine embryos a possible gene homologous to the murine Ped and the expression of protein similar to that coded by this gene and concluded that there are many transcripts similar to the Q7 gene being expressed in the maternal-fetal region of the placenta during pregnancy in bovine and such as in embryos

Made available in DSpace on 2016-08-15T20:31:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CaioRMO_DISSERT.pdf: 4090638 bytes, checksum: b7507f10f52ebe87761d7eafda429ed0 (MD5) Previous issue date: 2010-08-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / EP24.15 (endopeptidase 24.15, EC.3.4.24.15) also know as thimet-oligopeptidase is a metal dependent peptidase involved in the metabolism of neuropeptides as well as MHC-I peptides and more recently important as regulator of protein/protein interactions. The aim of this work is to verify the tissue and cellular distribution of EP24.15 in the lymphoid tissues (thymus, spleen, lymph nods) by means of immunohistochemistry technique. The analysis revealed that EP24.15 is expressed throughout the studied organs, nevertheless the tissue distribuition showed some areas that contained several labeled cell and others devoid of labeling. The cytoplasmic labeling was more frequent if compared to nuclear one. Macrophage is the cell type more fequently labled. The results suggest that it can be involved in the MHC-I peptide metabolism as well as CTLs differentiation. / EP24.15 (endopeptidase 24.15, EC.3.4.24.15) também conhceida por thimet-oligopeptidase é uma metaloendopeptidase que está envolvida no metabolismo de neuropeptídeos, bem como na apresentação de antígenos via MHC-I e mais recentemente como um importante regulador das interações proteína/proteína. O objetivo do presente trabalho é verificar a distribuição tecidual e celular da EP24.15 nos tecidos linfóides (timo, baço e linfonodo) através da técnica de imunohistoquímica. A análise dos resultados revelou que a EP24.15 foi expressa em todos os órgãos estudados, no entanto a distribuição tecidual mostrou áreas com várias células marcadas e outras sem marcação. A distribuição citoplasmática foi mais frequente que a nucelar. O marcrófago foi o tipo celular mais frequentemente marcado. Os resultados sugerem que a enzima pode estar envolvida no metabolismo de peptídeos via MHC-I bem como na diferenciação de CTLs.

Orientador: Noeme Sousa Rocha / Resumo: O tumor venéreo transmissível canino (TVTC) ocorre naturalmente em cães, sem predileção por raça ou sexo sendo transmitido durante o coito ou hábitos sociais. É também um tumor transplantável experimentalmente e tem sido utilizado como modelo para o estudo da relação entre tumor e hospedeiro. Apesar da maior infiltração inflamatória intratumoral e da expressão de moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) estar associada à regressão do tumor, o papel central das células imunes do hospedeiro na evolução clínica do TVTC ainda não está claro. Neste estudo nós buscamos analisar a interação entre TVTC natural e hospedeiro, especialmente sob o ponto de vista da imunidade celular tumoral. Aqui nós identificamos e quantificamos por citometria de fluxo células T (CD3+, CD4+ e CD8+), células NK, células B, macrófagos, em amostras de sangue e de tumor, além da expressão imunoistoquímica de moléculas do MHC de classe I e II, sobretudo nas diferentes fases clínicas do tumor, assim como classificamos os subtipos citológicos do tumor e avaliamos o comportamento tumoral frente ao tratamento quimioterápico com sulfato de vincristina em uma amostra de 22 cães com TVTC natural. A quimioterapia foi efetiva no tratamento da maioria dos casos. Encontramos predomínio de TVTC linfocitóide e que metástases e resistência quimioterápica ocorreram apenas nos tumores de fenótipo linfocitóide e misto. Identificamos aumento significativo na expressão de moléculas de MHC classe I e II na ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The transmissible venereal canine tumor (CTVT) occurs naturally in dogs, without predilection for race or gender being transmitted during intercourse or social habits. It is also an experimentally transplantable tumor and it has been used as a pattern for the study about the relationship between the tumor and the host. Despite the greater intratumoral inflammatory infiltration and the expression of major histocompatibility complex molecules (MHC) is associated with tumor regression, the central role of host immune cells in the CTVT clinical evolution is not clear yet. In this study we sought to analyze the interaction between natural and host CTVT, especially from the point of view of tumor cell immunity. Here we identify and quantify by flow cytometry cells T (CD3+, CD4+ e CD8+), cells NK, cells B, macrophages, in blood and tumor samples, besides the immune histochemical expression of MHC class I and II molecules, specially in the different clinical phases of the tumor as well as classifying the cytological subtypes of the tumor and evaluating the tumor behavior against the chemotherapy treatment with vincristine sulfate in a sample of 22 dogs with natural CTVT. Chemotherapy was effective in the treatment of most cases. We found a predominance of lymphocytoid CTVT and that metastases and chemotherapeutic resistance occurred only in tumors of lymphocytoid and mixed phenotype. We identified a significant increase in the expression of MHC class I and II molecules in the regress... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre