Magíster en Bioquímica Área de Especialización en Bioquímica de Proteínas Recombinantes y Biotecnología y Memoria para optar al título de Bioquímico / Las hemocianinas son metaloglicoproteínas de elevado tamaño presentes en la hemolinfa de algunos moluscos, cuya función principal es el transporte de oxígeno. La hemocianina más estudiada se obtiene de la Lapa Californiana, Megathura crenulata y se conoce como KLH, presentando notorias capacidades inmunomoduladoras, por lo que ha sido utilizada con múltiples fines terapéuticos y de investigación. Sin embargo, las recientemente descubiertas hemocianinas del Loco, Concholepas concholepas, (CCH) y de la Lapa Negra, Fissurella latimarginata, (FLH), han cobrado relevancia, dadas sus mejores propiedades en cuanto a estabilidad y efectos inmunoestimulantes, respectivamente. No obstante, los mecanismos inmunológicos mediante los cuales estas proteínas ejercen sus diversas acciones son poco conocidos. Así, un factor frecuentemente mencionado es su alto contenido de carbohidratos (hasta 9% en peso), con diferencias en su composición entre las especies mencionadas. Interesantemente, se ha descrito en individuos no inmunizados de varias especies, incluyendo los seres humanos, la presencia de anticuerpos naturales reactivos con KLH que estarían dirigidos contra sus carbohidratos, hecho que lleva a considerar como otro factor posible al sistema del complemento. El sistema del complemento es un conjunto de proteínas plasmáticas y de membrana cuya activación, finamente regulada se lleva a cabo en una secuencia de eventos proteolíticos limitados sobre los componentes iniciales. Culmina con la lisis del patógeno mediante la formación de complejos de ataque de membrana. Además, conduce a la opsonización del patógeno y a la coestimulación de linfocitos B, junto con la producción de anafilotoxinas con propiedades inflamatorias, que favorecen la respuesta inmune. Este sistema puede ser activado por la vía clásica, mediante anticuerpos que reconocen al agresor; la vía de las lectinas, mediante diversos carbohidratos presentes en el células agresoras, y la vía alterna, en que el sistema detecta ausencia de moléculas “propias”. En vista de estos antecedentes, proponemos que la presencia, en individuos no inmunizados, de anticuerpos naturales que reconocen a las hemocianinas, conduce a la activación de la vía clásica del sistema del complemento humano por dichas proteínas. Así, el objetivo general de esta tesis ha sido estudiar un rol del complemento que contribuya a explicar la capacidad inmunoestimulante no específica de las hemocianinas en mamíferos. En primera instancia, se analizaron los sueros de 4 pacientes inmunizados con KLH, identificándose dos pacientes con altos niveles de anticuerpos anti-KLH, los cuales se utilizaron como controles positivos para la detección de anticuerpos en donantes no inmunizados con hemocianinas. Así, se detectó en una muestra de 5 donantes, diferentes niveles de anticuerpos no sólo contra KLH, sino que también contra FLH y CCH. Luego, para analizar la especificidad de estos anticuerpos, se realizó una desglicosilación química de las hemocianinas y se observó si esto afectaba la unión de estos anticuerpos, encontrándose que este tratamiento afectó de forma diferencial su reactividad. Específicamente, en algunos casos la desglicosilación disminuyó la unión de los anticuerpos, en otros casos no tuvo efecto y en otros incluso aumentó. Posteriormente, se procedió a analizar la capacidad de algunos sueros para activar la vía clásica del sistema del complemento in vitro, fenómeno que ocurrió con todas las hemocianinas, aunque no se pudo establecer una correlación entre el nivel de anticuerpos y la intensidad de la activación. Además, en concordancia con lo observado anteriormente, la desglicosilación de las hemocianinas tuvo un efecto diferencial en la activación de esta vía, destacándose el efecto sobre FLH, en la cual la desglicosilación aumentó fuertemente tanto la unión de anticuerpos como la activación de la vía clásica. En concordancia con estos resultados, cuando se utilizó un anticuerpo anti-C1q que inhibe específicamente la activación de la vía clásica, esta activación fue revertida. En conjunto, estos resultados apuntan a un nuevo rol para el sistema del complemento, específicamente a través de la vía clásica, con respecto a las notables propiedades inmunomoduladoras no específicas de las hemocianinas de moluscos en mamíferos. Si bien no se pudo definir un rol preponderante para los carbohidratos en todas las hemocianinas, los resultados señalan la necesidad de continuar con esta línea de investigación, para proveer información adicional para un uso seguro de las hemocianinas en biomedicina / Hemocyanins are metalloglycoproteins with large molecular sizes present in the hemolymph of some mollusks, with oxygen transport being their main function. The most studied hemocyanin is obtained from the keyhole limpet, Megathura crenulata and it is known as KLH, with remarkable immunomodulatory capacities, leading to its use in multiple therapeutical and research approaches uses. However, the recently discovered hemocyanins of the Chilean abalone, or “Loco”, Concholepas concholepas (CCH), and that from “Lapa negra”, Fissurella latimarginata, (FLH), have become relevant, given their better properties regarding stability and immunomodulatory effects, respectively. In spite of this, the mechanisms through which these molecules exert their effects are scarcely understood. A frequent explanation is their high carbohydrate content (up to 9% w/w), with differences between their compositions among the mentioned species. Interestingly, in unimmunized individuals from different species, humans included, it has been described the presence of natural antibodies reactive with KLH, possibly through its carbohydrate moieties, leading to the possibility that the complement system is also involved. The complement system is a group of plasma and membrane-bound proteins whose finely regulated activation is carried out in a sequence of limited proteolytic events, involving mainly the initial components. It culminates with the pathogen lysis through formation of membrane attack complexes. It also leads to pathogen opsonization and B cell costimulation, along with the production of anaphylatoxins with inflammatory properties, thus favoring the immune response. This system can be activated through the classical pathway, due to antibodies recognizing an aggressor; the lectin pathway, due to diverse carbohydrates present on the aggressor cells; and the alternate pathway, where the system detects the absence of “self” molecules. Taking these antecedents into account, we propose that the presence, in unimmunized individuals, of antibodies recognizing the hemocyanins, leads to the activation of the classical pathway of the human complement system by these proteins. Thus, the general goal of this thesis has been to study a role of the complement that contributes to explain the non-specific immunostimulatory capacity of the hemocyanins in mammals. First, the sera of 4 patients immunized with KLH were analyzed, and two patients with a high level of anti-KLH antibodies were identified, being used as a positive controls for the detection of antibodies in healthy donors previously unimmunized with hemocyanins. Then we detected in 5 donors, different levels of antibodies not only against KLH, but also against FLH and CCH. In order to analyze the specificity of these antibodies, the hemocyanins were chemically deglycosylated and we observed how this affected the antibody binding in the sera of unimmunized donors, concluding that this treatment affected differentially their reactivity, Specifically, deglycosylation in some cases diminished antibody binding, while in others, no effect was observed and yet, in some it was even increased. Then, the ability of some sera to activate in vitro the classical pathway of the complement system was assessed, a phenomenon that was observed with all hemocyanins, although no correlation between antibody level and activation intensity could be established. Also, as observed before, hemocyanin deglycosylation had a differential effect in the activation of this pathway, with a remarkable effect over FLH, where deglycosylation strongly increased both antibody binding and classical pathway activation. In agreement with these results, when an anti-C1q antibody that specifically inhibits classical pathway activation was used, this activation was reversed. Taken together, these results point towards a new role for the complement system, specifically through the classical pathway, regarding the remarkable non-specific immunomodulatory properties of the molluskan hemocyanins in mammals. Even though we could not define a prevailing role for carbohydrates in all hemocyanins, the results indicate the need to continue with this line of research, to provide additional information for a safe use of hemocyanins in biomedicine / Conicyt, Fondecyt, Proyecto Anillo PIA-ACT 112, BIOSONDA, FUCITED

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El veneno paralizante de los moluscos (VPM), esta formado por más de 26 ficotoxinas de naturaleza no proteica, las cuales presentan un núcleo común que se denomina 3,4,6-trialquil-tetrahidropurina. Dentro de este grupo se encuentran las gonyaulatoxinas que a pesar de no ser las más toxicas del grupo, representan el 75-80% del total de toxinas descritas en las muestras de moluscos de las regiones XI y XII de nuestro país. El propósito de esta memoria fue purificar las toxinas necesarias para la realización de los experimentos y describir con ellas los mecanismos involucrados en la permeabilidad intestinal de las gonyaulatoxinas y. Para este propósito, las toxinas usadas en este estudio fueron extraídas de choritos (Mytilus chilensis) contaminados, provenientes de la XI Región. El grupo mayoritario de contaminantes está constituido por Gonyaulatoxinas. La permeabilidad de las gonyaulatoxinas a través del epitelio intestinal y su efecto sobre la resistencia transepitelial fueron investigados en segmentos extraídos de yeyuno humano. Los segmentos aislados de la mucosa fueron montados en una cámara Ussing y los experimentos fueron realizados bajo condiciones controladas de voltaje. Los cationes orgánicos de gonyaulatoxinas fueron aplicados en el lado apical y las muestras fueron extraídas del lado basolateral. Los resultados demuestran que los epímeros de GTX 2/3 atraviesan el intestino por una vía paracelular y dentro de los límites de resolución de la técnica usada, no se encontró evidencia de ningún otro mecanismo de transporte involucrado en el proceso. Se desarrollo un modelo, según el cual las uniones estrechas experimentan un cambio dependiente del tiempo y concentración de la toxina, mientras que la resistencia transepitelial demuestra una disminución modesta / Fundación de estudios Biomédicos Avanzados. Facultad de Medicina. Proyecto 265

El género Megalobulimus agrupa a las especies de moluscos terrestres de mayor tamaño del neotrópico, además de ser parte de la dieta de los pobladores de la amazonia peruana. Para Perú se han reportado nueve especies de este género, de las que se tiene conocimiento sólo por sus conchas. El objetivo principal del presente trabajo fue discriminar a las especies de Megalobulimus con peristoma rojo de Perú sobre la base de los caracteres de la concha, parte blanda (genitalia, sistema digestivo, complejo paleal y glándula pedal) y datos de alometría para poder evaluar el estatus taxonómico de cada una de ellas y tener mayor conocimiento para la conservación de especies económicamente importantes. Entre el 2008 y 2010 se realizaron colectas en los departamentos de San Martín, Huánuco, Cusco, Madre de Dios y Junín; también se realizó un levantamiento de datos bibliográficos y de bases de datos electrónicas sobre las especies de Megalobulimus con peristoma rojo y, además, se realizó un análisis y una descripción detallada de la concha y anatomía interna, el análisis multivariado de la concha y la genitalia, alometría de la concha y la evaluación de la distribución geográfica para estas especies. Para Perú se han reportado dos especies de Megalobulimus con peristoma rojo, Megalobulimus capillaceus y Megalobulimus separabilis. Como resultado, se identificaron tres morfotipos (San Martín, Huánuco y Cusco) para M. capillaceus. El morfotipo “Cusco” quedó inequívocamente discriminado de los morfotipos “San Martín” y “Huánuco”, tanto a nivel cualitativo como cuantitativo de las características de la concha y parte blanda, por lo que se la eleva de nivel taxonómico, siendo así una especie nueva para la ciencia, Megalobulimus sp. nov. La especie nueva se caracteriza por presentar concha más elongada, pene en forma de garrote, epífalo más largo y oviducto libre más alargado en relación a los morfotipos “San Martín” y “Huánuco”. Megalobulimus capillaceus se diferenció de M. separabilis por su concha más ancha, epífalo prominente y por la presencia de un divertículo externo en el oviducto libre, en tanto que M. separabilis tiene concha elongada, epífalo indiferenciado externamente y no presenta divertículo externo en el oviducto, pero si un divertículo interno. En el Perú, M. capillaceus presenta una distribución restringida a los departamentos de San Martín y Huánuco; M. separabilis se restringe al departamento de Huánuco; en tanto que, Megalobulimus sp. nov. fue encontrada sólo en el departamento de Cusco, aunque no se descarta su presencia en Bolivia. Es posible que M. capillaceus sea endémica de Perú debido a que los especímenes reportados como M. capillaceus para otros países y custodiados en museos, difieren mucho del morfotipo de San Martín, el cual corresponde a la descripción original. La implicancia de discriminar a estas especies consideradas cercanamente relacionadas en base a su característico labio rojo, no queda simplemente como un tema académico, sino que aporta al correcto aprovechamiento de especies económicamente importantes, así como también a la protección de la biodiversidad del país. / -- Megalobulimus is a neotropical genus of land snails that represents the largest living snails, they are also edible for the Peruvian Amazon people. There are nine especies of Megalobulimus registered for Peru and the knowlegde of them is only based on shell characters. The main goal of this research was to discriminate species of Megalobulimus with red peristome distributed in Perú on the basis of shell and soft parts (genitalia, digestive system, palial complex and pedal gland) characters, and allometry in order to evalute their taxonomic status and to obtain knowlegde for the conservation of these species of edible snails. The surveys were carried out between 2008 and 2010 in San Martín, Huánuco, Cusco, Madre de Dios and Junín. Literature and electronic data base were also revised for Megalobulimus species with red peristome. A detail description of shell and soft parts, as well as multivariate analysis of shell and genitaly, shell allometry and geografic distribution was carried out. There are two reports for Perú of Megalobulimus with red peristome, Megalobulimus capillaceus and M. separabilis. Three morphotypes (San Martín, Huánuco and Cusco) of M. capillaceus were recognized. Morphotype "Cusco" was undoubtedly different of remaining morphs. This discrimination is based on qualitative and quantitative analyses of shell and soft parts characters. This morph was recognized as a new species, Megalobulimus sp.nov. This species has a more elongate shell, a club-shaped penis, a longer epiphallus and a longer free oviduct in contrast with other morphotypes. M. capillaceus has a widest shell, a prominent epiphallus and the presence of a free oviduct external diverticule than M. separabilis. On the contrary, M. separabilis has a more elongate shell, its epiphallus is hardly differedciated from the vas deferens externally and it has a free oviduct internal diverticule. For Perú, M. capillaceus is retricted to San Martín and Huánuco; while Megalobulimus sp. nov was found only in Cusco, although his presence in Bolivia is not excluded. It is possible that M. capillaceus can be endemic for Perú because the samples reported as M. capillaceus for other countries and deposited in museums are not related with the morphotype "San Martín", considered the “type”. The implications to distinguish these apparently closely related species, on the basis of their red peristomes, is beyond academic interest. This work provides elements for the sustainable use of these species of edible snails, as well as to protect the biodiversity of Perú. / Tesis

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / A partir de los años 70, se han observado alteraciones anatómicas y reproductivas en los moluscos, especialmente en neogastrópodos hembras que desarrollan características masculinas (imposex). Esto sucede en áreas cercanas a zonas portuarias contaminadas con organoestañosos. Nassarius gayii (Kiener, 1835) es un molusco neogastrópodo gonocórico que habita niveles submareales y se distribuye desde Perú hasta el Estrecho de Magallanes. El objetivo de este estudio fue describir la anatomía normal del sistema reproductivo de machos y hembras, y las modificaciones encontradas en presencia de contaminación por tributilestaño (TBT). Las muestras fueron obtenidas en otoño y primavera en el Puerto de San Antonio (33º 57' S, 71º 52' O) el que corresponde a un sitio con alta concentración de TBT, y en la Bahía Coliumo (36º 31' S, 72º 56’ O) considerado un sitio menos contaminado por su lejanía a las áreas portuarias. En los individuos capturados se determinó el sexo y se realizó una descripción macroscópica y microscópica general del sistema reproductivo. La descripción anatómica normal para hembras y machos, se realizó con individuos que no presentaban alteraciones evidentes en su tracto reproductor con respecto a lo descrito en la literatura para el género. Las hembras que presentaron estructuras reproductivas masculinas fueron consideradas con imposex. En San Antonio hubo más machos que hembras, todas ellas con imposex. En cambio, en Bahía Coliumo, la proporción de machos y hembras fue similar y no se registró imposex. Similar a lo que sucede en otras especies el imposex en las hembras de N. gayii se reflejó en la aparición de un pene, conducto deferente y el plegamiento del oviducto. No se observó presencia de tejido testicular en las hembras. Estas modificaciones morfológicas se pueden traducir tanto en alteraciones en la tasa reproductiva, como en disminuciones en el tamaño efectivo poblacional, lo que a largo plazo podría poner en riesgo la persistencia de N. gayii a nivel local. Estos resultados sugieren que en Chile es importante controlar el uso de TBT, por sus efectos sobre la fauna y sus potenciales efectos como disruptor endocrino en el ser humano. / Proyecto CSMAR 02/3-2

Magíster en Bioquímica, área de especialización Bioquímica de Proteínas Recombinantes y Biotecnología / Las hemocianinas de algunos moluscos son ampliamente usadas en biomedicina, entre ellas, la de Megathura crenulata (KLH), de Concholepas concholepas (CCH) y de Fissurella latimarginata (FLH), éstas dos últimas producidas en Chile, debido a que son potentes inmunoestimulantes no específicos. El factor común en su mecanismo de inmunoestimulación es que polarizan la respuesta hacia una de tipo Th1, fundamental para combatir tumores. Sin embargo, para potenciar su efecto en cánceres más agresivos como el cáncer oral, se requieren adyuvantes adicionales. Así, los objetivos de esta tesis fueron estudiar la respuesta inmune específica, el efecto antitumoral en modelos murinos de cáncer oral y el efecto in vitro de una formulación terapéutica, constituida por una hemocianina y un adyuvante tipo Th1 (QS-21, AddaVax), planteando las siguientes hipótesis: 1. Las hemocianinas de moluscos gastrópodos inducen una respuesta inmune humoral y celular del tipo Th1 en la inmunoterapia del cáncer oral en un modelo murino, que será potenciada al ser empleadas en conjunto con adyuvantes Th1, mejorando así la respuesta terapéutica contra dicho cáncer. 2. Las hemocianinas afectan la viabilidad de las células tumorales de cáncer oral. Los principales resultados demostraron que: 1. La formulación FLH más QS-21 presentó la mejor inmunogenicidad, reflejada en un mayor título de IgG total anti-hemocianina, con predominio de anticuerpos IgG2a, y una respuesta celular superior en un ensayo de hipersensibilidad retardada (DTH). 2. En los modelos ortotópicos y heterotópicos de cáncer oral, la formulación FLH más QS-21 brindó los resultados más prometedores, evaluados mediante una DTH positiva, menor desarrollo de tumor y mayor sobrevida de los animales de experimentación en comparación con el resto de los tratamientos y controles, siendo el denominador común el requerimiento de una inmunización previa con hemocianina antes del desafío con las células tumorales. 3. Las preparaciones de hemocianina-adyuvante tuvieron efectos variables, pero no significativos sobre la viabilidad de las líneas celulares de cáncer oral AT-84, AT-84 E7 Luc y MOC7. 4. No se encontró reacción cruzada entre los anticuerpos antihemocianina y antígenos de superficie presentes en la línea tumoral murina MOC7. Finalmente, es importante destacar que se trata del primer trabajo en que se investiga el efecto de hemocianinas solas y combinadas con adyuvantes en modelos de cáncer oral murino, por lo cual los resultados obtenidos sientan las bases para profundizar en el estudio y la aplicación de las hemocianinas y especialmente de FLH en la inmunoterapia del cáncer oral, tanto para la prevención como para el tratamiento de este tipo de carcinoma en seres humanos / The hemocyanins of some mollusks are used in biomedicine, including the one of Megathura crenulata (KLH), of Concholepas concholepas (CCH) and of Fissurella latimarginata (FLH), the last two produced in Chile, since they are potent non-specific immunostimulants. The common factor in their immunostimulatory mechanism is that induce a strong polarization toward Th1 immune response, fundamental for destroying tumors. Nevertheless, to potentiate its effect in more aggressive cancers like oral cancer, additional adjuvants are required. The aims of this thesis were to study the specific immune response, the antitumor effect in murine models of oral cancer and the in vitro effect of a therapeutic formulation, consisting of a hemocyanin and a Th1 adjuvant (QS-21, AddaVax). The hypotheses were: 1. The hemocyanins of mollusks gastropod induce a humoral and cellular type Th1 immune response in oral cancer immunotherapy in a murine model, and will be enhanced when they are used in conjunction with Th1 adjuvants, thereby improving the therapeutic response against such cancer. 2. The hemocyanins affect the cellular viability of the tumor cells of oral cancer. The principal results demostrated that: 1. The FLH plus QS-21 formulation showed the better immunogenicity, as reflected in a major anti-hemocyanin IgG total title, with predominance of IgG2a antibodies, and better cellular response in a delated-type hypersensitivity assay (DTH). 2. In the orthotopic and heterotopic models of oral cancer, the FLH plus QS-21 formulation showed the most promising results, evaluated through a positive DTH, less tumor development and a major survival compared with other treatments and controls. The common factor was the priming with hemocyanins prior the tumor cells challenge. 3. The hemocyanin-adjuvant preparations had variable, without significant effects on the viability of the oral cancer cell lines AT-84, AT-84 E7 Luc and MOC7. 4. A cross reaction between the anti-hemocyanin antibodies and the surface antigens in the MOC7 murine tumor line was not found. Finally, it is important to note that this is the first study in which are investigated the effect of the hemocyanins alone and combined with adjuvants in murine models of oral cancer. Therefore, the results lay the basis for further studies on application of hemocyanins and especially FLH in oral cancer immunotherapy, both for the prevention and/or the treatment of such carcinoma in humans / Fondecyt

Las lomas son ecosistemas estacionales que se encuentran en la costa peruana. Dentro de las especies endémicas de moluscos de lomas podemos encontrar a Bostryx aguilari (Mollusca, Gastropoda, Orthalicidae), reportada para lomas cercanas a la ciudad de Lima. La información brindada por los genomas, como el ADN mitocondrial, se ha convertido en el componente clave para desarrollar estudios de filogenias y conservación. En el presente trabajo se realizó una evaluación de la evolución de esta especie a nivel de su genoma. Se realizaron distintas colectas y se procedió a la extracción del ADN por medio del método del CTAB con separación cloroformo: alcohol isoamílico y precipitación con etanol. Se amplificaron dos marcadores mitocondriales (COI y 16S rRNA) y un marcador nuclear (rRNA). Se secuenciaron los mejores productos de amplificación. Se procedió a realizar una caracterización genómica por marcador así como la evaluación de la diversidad genética encontrada. Para la reconstrucción filogenética se utilizaron distintas secuencias de Orthalicidos obtenidos por diversos proyectos de investigación así como de la base de datos del GenBank. Se construyeron árboles filogenéticos mediante los métodos de Neighbor-Joining, Máxima Parsimonia, Máxima Verosimilitud e Inferencia Bayesiana. Las distintas extracciones realizadas mostraron una baja en la eficiencia de esta técnica, en especial por la dificultad para separar los pigmentos propios de B. aguilari. Se realizó un total de 80 extracciones. Fueron obtenidas 11 secuencias de distintas poblaciones para el marcador 16S rRNA, cuatro para el marcador COI y cuatro para el gen rRNA nuclear. La caracterización genómica mostró valores cercanos a otros Orthalicidos. La diversidad genética encontrada fue menor a la esperada. B. aguilari es una especie bien diferenciada y conforma un grupo natural en todos nuestros análisis. La población de Atocongo se mostró ligeramente más diferenciada del resto. Las relaciones evolutivas de B. aguilari dentro de la familia Orthalicidae la mostraron como especie más emparentada a B. conspersus y S. versicolor. Al contrario de lo esperado, el género Bostryx conformó un grupo polifilético. El marcador COI mostró ser eficiente como un código de barras de B. aguilari. Toda la evidencia molecular presentada, sumada a la evidencia conquiológica y morfológica, nos lleva a concluir que B. aguilari no formaría parte del género Bostryx, sino más bien de un nuevo género. Posteriores estudios donde se incluyan un mayor número de especies podría conducirnos a aclarar sus relaciones evolutivas dentro de la familia Orthalicidae. / Lomas are seasonal ecosystems occurring in the Peruvian coast. Bostryx aguilari (Mollusca, Gastropoda, Orthalicidae) is an endemic land snail which lives in Lomas from Lima. Genomic information (for example mitochondrial genome) has become a key factor to develop both phylogenetic and conservation studies. The present work is an evaluation of the genomic evolution of B. aguilari. Land snails were collected and DNA was isolated using CTAB method. The mitochondrial markers both Cytochrome oxidase I (COI) and 16S rRNA as well as the rRNA nuclear markers were amplified and sequenced. The three markers were used for genomic characterization and the evaluation of genetic diversity. Phylogenetic reconstruction was carried out also using sequences of other nine Orthalicid species and ten species retrieved from the GenBank. The phylogenetic trees were constructed with Neighbor-Joining, Maximum Parsimony, Maximum Likelihood and Bayesian Inference. DNA was difficult to amplify probably due to pigments in the muscle tissue of the snail foot. From the 80 extractions, eleven sequences of 16S rRNA from different populations of B. aguilari were obtained, four of COI and four of nuclear rRNA. The genomic characterization showed similar values with other species of the Family Orthalicidae. Genetic diversity showed low values. B. aguilari showed high differentiation from other Orthalicids and conformed a natural group. B. aguilari is more related to B. consperus and S. versiocolor than to other members of the Family Orthalicidae. Surprisingly, the genus Bostryx showed a polyphyletic pattern. The COI marker is an efficient barcode for B. aguilari. Molecular and morphological evidence lead us to conclude a B. aguilari does not belong to the genus Bostryx. B. aguilari would be a new genus. It is necessary more studies including more species to solve the evolutionary relationships within the Family Orthalicidae.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En moluscos las características morfológicas de la concha a menudo expresan variación en función de la procedencia geográfica. El género Biomphalaria corresponde a caracoles pulmonados de ambiente límnicos que se distribuyen en Chile desde el extremo norte hasta el Río Puelo (41°47'S, 72°01'O). En el Altiplano se han detectado poblaciones en sistemas hídricos aislados entre sí. Estudiamos caracoles de este género provenientes de las siguientes localidades: Bofedal de Caquena (69°12'O 18° 3'S), Bofedal de Colpa (69°13'O 18° 3'S) y Bofedal de Parinacota (69°15'O 18°11'S). Individuos de estas localidades fueron recolectados y llevados al laboratorio, donde fueron cultivados en condiciones de jardín común durante una generación. Se midieron once caracteres de la concha tanto a aquellos recolectados de terreno como a los cultivados en el laboratorio. Los resultados muestran que, tanto en los individuos recolectados en terreno como en aquellos cultivados en laboratorio, los caracoles procedentes de Parinacota difieren morfológicamente de Caquena y Colpa, mientras estos dos últimos no mostraron diferencias entre sí. Adicionalmente, se observó que la morfología de la concha de los caracoles recolectados en terreno presentó mayores coeficientes de variación, en comparación a los cultivados en laboratorio. Finalmente, al analizar mediante índices las cuatro variables de la concha que tuvieron mayor peso en el análisis de componentes principales: largo del callo peristomal, ancho ventral de la concha, largo del peristoma y ancho del peristoma, se observó convergencia entre la generación parental y la cultivada en laboratorio en estos rasgos: longitud del peristoma (abertura de la concha) y ancho del peristoma de una generación a la siguiente, lo que correspondería a un fenómeno de plasticidad fenotípica en estos caracteres

Las lomas son ecosistemas estacionales que se encuentran en la costa peruana. Dentro de las especies endémicas de moluscos de lomas podemos encontrar a Bostryx aguilari (Mollusca, Gastropoda, Orthalicidae), reportada para lomas cercanas a la ciudad de Lima. La información brindada por los genomas, como el ADN mitocondrial, se ha convertido en el componente clave para desarrollar estudios de filogenias y conservación. En el presente trabajo se realizó una evaluación de la evolución de esta especie a nivel de su genoma. Se realizaron distintas colectas y se procedió a la extracción del ADN por medio del método del CTAB con separación cloroformo: alcohol isoamílico y precipitación con etanol. Se amplificaron dos marcadores mitocondriales (COI y 16S rRNA) y un marcador nuclear (rRNA). Se secuenciaron los mejores productos de amplificación. Se procedió a realizar una caracterización genómica por marcador así como la evaluación de la diversidad genética encontrada. Para la reconstrucción filogenética se utilizaron distintas secuencias de Orthalicidos obtenidos por diversos proyectos de investigación así como de la base de datos del GenBank. Se construyeron árboles filogenéticos mediante los métodos de Neighbor-Joining, Máxima Parsimonia, Máxima Verosimilitud e Inferencia Bayesiana. Las distintas extracciones realizadas mostraron una baja en la eficiencia de esta técnica, en especial por la dificultad para separar los pigmentos propios de B. aguilari. Se realizó un total de 80 extracciones. Fueron obtenidas 11 secuencias de distintas poblaciones para el marcador 16S rRNA, cuatro para el marcador COI y cuatro para el gen rRNA nuclear. La caracterización genómica mostró valores cercanos a otros Orthalicidos. La diversidad genética encontrada fue menor a la esperada. B. aguilari es una especie bien diferenciada y conforma un grupo natural en todos nuestros análisis. La población de Atocongo se mostró ligeramente más diferenciada del resto. Las relaciones evolutivas de B. aguilari dentro de la familia Orthalicidae la mostraron como especie más emparentada a B. conspersus y S. versicolor. Al contrario de lo esperado, el género Bostryx conformó un grupo polifilético. El marcador COI mostró ser eficiente como un código de barras de B. aguilari. Toda la evidencia molecular presentada, sumada a la evidencia conquiológica y morfológica, nos lleva a concluir que B. aguilari no formaría parte del género Bostryx, sino más bien de un nuevo género. Posteriores estudios donde se incluyan un mayor número de especies podría conducirnos a aclarar sus relaciones evolutivas dentro de la familia Orthalicidae. / Lomas are seasonal ecosystems occurring in the Peruvian coast. Bostryx aguilari (Mollusca, Gastropoda, Orthalicidae) is an endemic land snail which lives in Lomas from Lima. Genomic information (for example mitochondrial genome) has become a key factor to develop both phylogenetic and conservation studies. The present work is an evaluation of the genomic evolution of B. aguilari. Land snails were collected and DNA was isolated using CTAB method. The mitochondrial markers both Cytochrome oxidase I (COI) and 16S rRNA as well as the rRNA nuclear markers were amplified and sequenced. The three markers were used for genomic characterization and the evaluation of genetic diversity. Phylogenetic reconstruction was carried out also using sequences of other nine Orthalicid species and ten species retrieved from the GenBank. The phylogenetic trees were constructed with Neighbor-Joining, Maximum Parsimony, Maximum Likelihood and Bayesian Inference. DNA was difficult to amplify probably due to pigments in the muscle tissue of the snail foot. From the 80 extractions, eleven sequences of 16S rRNA from different populations of B. aguilari were obtained, four of COI and four of nuclear rRNA. The genomic characterization showed similar values with other species of the Family Orthalicidae. Genetic diversity showed low values. B. aguilari showed high differentiation from other Orthalicids and conformed a natural group. B. aguilari is more related to B. consperus and S. versiocolor than to other members of the Family Orthalicidae. Surprisingly, the genus Bostryx showed a polyphyletic pattern. The COI marker is an efficient barcode for B. aguilari. Molecular and morphological evidence lead us to conclude a B. aguilari does not belong to the genus Bostryx. B. aguilari would be a new genus. It is necessary more studies including more species to solve the evolutionary relationships within the Family Orthalicidae.

El proyecto consiste en una evaluación técnico económica de una planta de engorda de abalón verde en el norte del país, específicamente en la Tercera Región de Atacama. El abalón verde es un molusco de la familia de los gastrópodos (caracoles marinos) Este molusco se consume principalmente en Japón, China y Corea.

Made available in DSpace on 2012-09-05T18:23:56Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 202.pdf: 1467611 bytes, checksum: ad2778ae06f99957715eaa2d20f04d6d (MD5) Previous issue date: 2003 / A poluição das águas vem sendo motivo de crescente preocupação face as previsões de escassez deste recurso natural. Neste contexto, os testes de toxicidade tem sido úteis para nortear atividades regulatórias voltadas para controle da poluição e prevenção de danos aos ecossistemas aquáticos. Os ensaios mais frequentemente empregados para este fim envolvem um reduzido número de espécies e apenas exposições de curta duração. Aspectos mais sutis da toxicidade, como disfunções reprodutivas evidenciadas após exposições prolongadas a baixas concentrações dos poluentes, são em geral negligenciados. Neste trabalho foram realizados dois estudos para avaliar os efeitos de substâncias químicas sobre a reprodução de caramujos do gênero Biomphalaria. No primeiro estudo (Capítulo 1) investigou-se a embriotoxicidade de substâncias moluscicidas para a B. glabrata; e no segundo (Capítulo 2) avaliou-se os efeitos da exposição contínua por mais de uma geração a 3 poluentes, sobre a reprodução da B. tenagophila. No primeiro estudo, cerca de 200 ovos (com até 15 horas), foram expostos à 4 moluscicidas por 96 horas e observados por mais 6 dias após cessada a exposição. Os resultados mostraram que o látex da Euphorbia milii é praticamente desprovido de efeito embrioletal, mas é teratogênico e retarda a eclosão mesmo em baixas concentrações. Os demais moluscicidas exibiram acentuado efeito embrioletal (hidróxido de trifenil estanho > niclosamida > sulfato de cobre) mas mostraram-se menos potentes do que o látex como teratógenos. No segundo estudo, caramujos adultos (10 por concentração), foram individualmente expostos à concentrações não agudamente letais de três poluentes (endosulfan, nonilfenol etoxilado e atrazina) por duas gerações consecutivas. Avaliou-se a mortalidade e a fecundidade, por 8 semanas, e o desenvolvimento embrionário da geração subsequente em duas situações: exposição descontinuada e contínua. Os resultados obtidos mostram que alguns efeitos só se manifestam com a continuidade da exposição por mais de uma geração. O estudo multigeração do desempenho reprodutivo de caramujos aquáticos, demonstrou ser sensível para detectar efeitos crônicos de baixas concentrações de poluentes ambientais