As Mucopolissacaridoses (MPS) são um grupo de doenças de armazenamento lisossômico causadas por deficiência de enzimas que catalisam a degradação gradual das glicosaminoglicanas (GAGs). GAGs (anteriormente chamadas de mucopolissacarídeos) são produtos de degradação das proteoglicanas que existem na matriz extracelular e tem efeito proteolítico. A classificação das MPS é baseada na deficiência enzimática específica. A MPS IVA é causada por mutações no gene que codifica a enzima GALNS (Nacetilgalactosamina-6-sulfatase), a qual desempenha um papel crucial na degradação do sulfato de queratano e condroitina-6-sulfatase. As mutações na enzima se resumem em três categorias: interrupção do sítio ativo, alterações no núcleo hidrofóbico e exposição da superfície, onde mutações missense na estrutura podem afetar gravemente a atividade da proteína GALNS, alterando seu núcleo hidrofóbico ou modificando seu enovelamento (folding). Com a falta de tratamentos efetivos, sendo em sua maioria paliativos, e tendo como base a estrutura já resolvida da GLANS selvagem, este trabalho teve como objetivo modelar 3 variantes da enzima GALNs, sendo uma mutação no sítio ativo, uma no núcleo hidrofóbico e uma na superfície. Foi usado o software MODELLER 9.12 para a modelagem comparativa, os softwares Prochek, PROSA II, ERRATv2, Verify3d, ProQ para a avaliação dos modelos, o software NAND 2.10, para simulação de dinâmica molecular e o software Chimera 1.10.1 para cálculo de superfícies eletrostáticas e hidrofobicidade da superfície. Os modelos apresentaram bons resultados segundo os softwares de avaliação e análise visual. Apresentaram poucas diferenças estruturais em relação à estrutura da GALNS selvagem, demonstraram estabilidade em simulação de dinâmica molecular. Entretanto, algumas diferenças foram observadas com relação à distribuição de cargas e hidrofobicidade no sítio ativo do modelo da variante com mutação no sítio ativo. Pôde ser concluído que as 3 mutações analisadas não causaram alterações estruturais significativas, não interferiram na estabilidade estrutural em simulação de dinâmica molecular, entretanto, foi demonstrado que mutações na região do sítio ativo podem interferir na função da enzima. / The Mucopolysaccharidoses (MPS) are a group of lysosomal storage diseases caused by deficiencies in enzymes that catalyze the gradual glycosaminoglycans (GAGs) degradation. GAGs (formerly called mucopolysaccharides) are products of proteoglycan degradation that exist in the extracellular matrix and have proteolytic effect. The classification of MPS is based on the specific enzyme deficiency. MPS IVA is caused by mutations in the gene that encodes the GALNS enzyme (Nacetilgalactosamina-6-sulfatase), which plays a crucial role in the degradation of keratan sulfate and chondroitin-6-sulfatase. Mutations in the enzyme can be summarized in three categories: interruption of the active site, changes in the hydrophobic core and display surface, where missense mutations in the structure can seriously affect the activity of GALNS protein, changing its hydrophobic core or modifying its folding. With the lack of effective treatments, in its most palliative, and based on the wild GALNS structure already determined, this study aimed to model 3 variants of GALNS enzyme, a mutation in the active site, one in the hydrophobic core and a on the surface. 9.12 MODELLER was used for comparative modeling software, the software Prochek, Prose II, ERRATv2, Verify3d, ProQ models for the evaluation of the NAND 2.10 software, for molecular dynamics simulation and software Chimera 1.10.1 calculates electrostatic and hydrophobic surface. The models showed good results according to the evaluation software and visual analysis. Presented few structural differences from the wild GALNS structure and showed stability in molecular dynamics simulation. However, some differences were observed with respect to the charge distribution and hydrophobicity in the active site of the variants of the model with a mutation in the active site. It might be concluded that the three mutations analyzed did not cause significant structural changes and did not affect the structural stability in molecular dynamics simulation, however, it has been shown that mutations in the active site region may interfere with the function of this enzyme.

As Mucopolissacaridoses (MPS) são um grupo de doenças de armazenamento lisossômico causadas por deficiência de enzimas que catalisam a degradação gradual das glicosaminoglicanas (GAGs). GAGs (anteriormente chamadas de mucopolissacarídeos) são produtos de degradação das proteoglicanas que existem na matriz extracelular e tem efeito proteolítico. A classificação das MPS é baseada na deficiência enzimática específica. A MPS IVA é causada por mutações no gene que codifica a enzima GALNS (Nacetilgalactosamina-6-sulfatase), a qual desempenha um papel crucial na degradação do sulfato de queratano e condroitina-6-sulfatase. As mutações na enzima se resumem em três categorias: interrupção do sítio ativo, alterações no núcleo hidrofóbico e exposição da superfície, onde mutações missense na estrutura podem afetar gravemente a atividade da proteína GALNS, alterando seu núcleo hidrofóbico ou modificando seu enovelamento (folding). Com a falta de tratamentos efetivos, sendo em sua maioria paliativos, e tendo como base a estrutura já resolvida da GLANS selvagem, este trabalho teve como objetivo modelar 3 variantes da enzima GALNs, sendo uma mutação no sítio ativo, uma no núcleo hidrofóbico e uma na superfície. Foi usado o software MODELLER 9.12 para a modelagem comparativa, os softwares Prochek, PROSA II, ERRATv2, Verify3d, ProQ para a avaliação dos modelos, o software NAND 2.10, para simulação de dinâmica molecular e o software Chimera 1.10.1 para cálculo de superfícies eletrostáticas e hidrofobicidade da superfície. Os modelos apresentaram bons resultados segundo os softwares de avaliação e análise visual. Apresentaram poucas diferenças estruturais em relação à estrutura da GALNS selvagem, demonstraram estabilidade em simulação de dinâmica molecular. Entretanto, algumas diferenças foram observadas com relação à distribuição de cargas e hidrofobicidade no sítio ativo do modelo da variante com mutação no sítio ativo. Pôde ser concluído que as 3 mutações analisadas não causaram alterações estruturais significativas, não interferiram na estabilidade estrutural em simulação de dinâmica molecular, entretanto, foi demonstrado que mutações na região do sítio ativo podem interferir na função da enzima. / The Mucopolysaccharidoses (MPS) are a group of lysosomal storage diseases caused by deficiencies in enzymes that catalyze the gradual glycosaminoglycans (GAGs) degradation. GAGs (formerly called mucopolysaccharides) are products of proteoglycan degradation that exist in the extracellular matrix and have proteolytic effect. The classification of MPS is based on the specific enzyme deficiency. MPS IVA is caused by mutations in the gene that encodes the GALNS enzyme (Nacetilgalactosamina-6-sulfatase), which plays a crucial role in the degradation of keratan sulfate and chondroitin-6-sulfatase. Mutations in the enzyme can be summarized in three categories: interruption of the active site, changes in the hydrophobic core and display surface, where missense mutations in the structure can seriously affect the activity of GALNS protein, changing its hydrophobic core or modifying its folding. With the lack of effective treatments, in its most palliative, and based on the wild GALNS structure already determined, this study aimed to model 3 variants of GALNS enzyme, a mutation in the active site, one in the hydrophobic core and a on the surface. 9.12 MODELLER was used for comparative modeling software, the software Prochek, Prose II, ERRATv2, Verify3d, ProQ models for the evaluation of the NAND 2.10 software, for molecular dynamics simulation and software Chimera 1.10.1 calculates electrostatic and hydrophobic surface. The models showed good results according to the evaluation software and visual analysis. Presented few structural differences from the wild GALNS structure and showed stability in molecular dynamics simulation. However, some differences were observed with respect to the charge distribution and hydrophobicity in the active site of the variants of the model with a mutation in the active site. It might be concluded that the three mutations analyzed did not cause significant structural changes and did not affect the structural stability in molecular dynamics simulation, however, it has been shown that mutations in the active site region may interfere with the function of this enzyme.

Mucopolissacaridoses (MPS) são erros inatos do metabolismo, fazem parte das doenças lisossômicas de depósito e ocorrem devido à deficiência na atividade de enzimas que catalisam a degradação de glicosaminoglicanos (GAGs). São doenças crônicas e progressivas causadas pelo acúmulo de um ou mais GAGs nos lisossomos das células. A MPS do tipo IV (síndrome de Morquio) ocorre pelo acúmulo de queratan sulfato e condoitin-6-sulfato, causado pela deficiência de duas diferentes enzimas, que distinguem essa MPS em dois subtipos, deficiência de N-acetilgalactosamina-6-sulfatase (MPS IV tipo A) ou de β-galactosidase (MPS IV tipo B). Na MPS IV A as características clínicas predominantes são relacionadas ao sistema esquelético e na maioria das vezes o paciente tem inteligência normal; não há uma terapia efetiva para a doença, deste modo o diagnóstico precoce direciona para o início de tratamentos paliativos. A investigação inicial dessa MPS se baseia em avaliação clínica, radiografias, quantificação e identificação de GAGs urinários e o diagnóstico definitivo pela medida da atividade enzimática da N-acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS) em leucócitos ou fibroblastos. O objetivo desse trabalho foi estudar alguns parâmetros bioquímicos da enzima GALNS em leucócitos de indivíduos normais e adaptar a técnica de medida dessa atividade enzimática para sangue impregnado em papel filtro. O Km e a Vmáx da GALNS em leucócitos de indivíduos normais foi de 7,16mM e 77,3nmol/17h/mg de proteína, respectivamente. Também adaptamos a técnica da medida da atividade enzimática dessa enzima utilizando menor concentração de substrato (3mM), esta concentração teve correlação positiva com a concentração 10 mM, que é empregada na técnica original. A partir disto, foram estabelecidos os valores de referência em leucócitos para indivíduos normais e indivíduos afetados com MPS IV A. Os mesmos foram, respectivamente: 11,0 a 101,4 e 0,1 a 0,2 nmol/17h/mg de proteína. Foi também observado que, com o passar do tempo, a temperatura de 70ºC causa uma inativação gradual da atividade enzimática. Por último, apesar de várias alterações na técnica original em leucócitos, não foi possível adaptá-la para ser utilizada na medida da atividade da GALNS em sangue impregnado em papel filtro. A determinação dos parâmetros bioquímicos da GALNS é conveniente devido ao avanço nos estudos clínicos de desenvolvimento da terapia de reposição enzimática aos indivíduos afetados com MPS IV A e na distinção de indivíduos saudáveis, afetados e heterozigotos. Desenvolver técnicas fluorimétricas em amostras de sangue impregnado em papel filtro é de grande importância para serem utilizadas em triagem de recém-nascidos e populações de alto risco para MPS. Devendo ser confirmado por testes de atividade da enzima em leucócitos ou fibroblastos cultivados. A partir dos nossos protocolos, não foi possível desenvolver e padronizar uma técnica para medida da atividade da enzima N-acetilgalactosamina-6-sulfatase em sangue impregnado em papel filtro de modo a triarmos indivíduos com suspeita de MPS IV A. / Mucopolysaccharidosis (MPS) are inborn errors of metabolism, are part of the lysosomal storage diseases and occur due to the deficiency in the activity of enzymes that catalyze the degradation of glycosaminoglycans (GAGs). They are chronic and progressive diseases caused by the accumulation of one or more GAGs in the lysosomes of cells. The MPS type IV (Morquio syndrome) occurs by the accumulation of keratan sulfate and condoitin-6-sulfate, caused by two different enzyme deficiencies, which distinguish this MPS into two subtypes, deficiency of N-acetylgalactosamine-6-sulfatase (MPS IV type A) or the enzyme β-galactosidase (MPS type IV B). In MPS IVA the predominant clinical features are related to the skeletal system and in most cases the patient has normal intelligence. There is no effective therapy for the disease, so early diagnosis directs for the beginning of palliative treatments. The initial investigation of this MPS is based on clinical evaluation, radiographs, quantification and identification of urinary GAGs and the definitive diagnosis by measure of N-acetylgalactosamine-6-sulfatase (GALNS) activity in leukocytes or fibroblasts. The aim of this work was to study some biochemical parameters of the GALNS in leukocytes of normal individuals and adapt the technique of measuring this enzyme activity to blood impregnated on filter paper. The Km and Vmax of GALNS in leukocytes from normal subjects was 7.16 mM and 77.3 nmol/17h/mg of protein, respectively. We also adapted the technique of measuring the enzymatic activity of this enzyme using lower substrate concentration (3mM). This concentration had a positive correlation with 10 mM concentration, which is used in the original technique. From this, the reference values for normal and individuals affected with MPS IVA in leukocytes were established. They were 11.0 to 101.4 and 0.1 to 0.2 of nmol/17h/mg of protein, respectively. It was also observed that over time the temperature of 70°C causes a gradual inactivation of enzyme activity. Finally, despite several changes to the original technique in leukocytes, it has not been possible to adapt it to be used in measuring the activity of GALNS blood impregnated on filter paper. The determination of biochemical parameters of GALNS is convenient due to the advancement in clinical studies for the development of enzyme replacement therapy for individuals affected with MPS IVA and to distinguish between healthy and affected heterozygous individuals. The development of fluorometric techniques in blood impregnated on filter paper is of great importance for use in newborn screening and in high risk populations to MPS. It should be confirmed by tests of enzyme activity in leukocytes or cultured fibroblasts. Unfortunately, from our protocols, it was not possible to develop and standardize a technique for measuring the activity of the enzyme N- acetylgalactosamine-6-sulfatase in blood impregnated on filter paper for to screen individuals suspected of MPS IVA.

Mucopolissacaridoses (MPS) são erros inatos do metabolismo, fazem parte das doenças lisossômicas de depósito e ocorrem devido à deficiência na atividade de enzimas que catalisam a degradação de glicosaminoglicanos (GAGs). São doenças crônicas e progressivas causadas pelo acúmulo de um ou mais GAGs nos lisossomos das células. A MPS do tipo IV (síndrome de Morquio) ocorre pelo acúmulo de queratan sulfato e condoitin-6-sulfato, causado pela deficiência de duas diferentes enzimas, que distinguem essa MPS em dois subtipos, deficiência de N-acetilgalactosamina-6-sulfatase (MPS IV tipo A) ou de β-galactosidase (MPS IV tipo B). Na MPS IV A as características clínicas predominantes são relacionadas ao sistema esquelético e na maioria das vezes o paciente tem inteligência normal; não há uma terapia efetiva para a doença, deste modo o diagnóstico precoce direciona para o início de tratamentos paliativos. A investigação inicial dessa MPS se baseia em avaliação clínica, radiografias, quantificação e identificação de GAGs urinários e o diagnóstico definitivo pela medida da atividade enzimática da N-acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS) em leucócitos ou fibroblastos. O objetivo desse trabalho foi estudar alguns parâmetros bioquímicos da enzima GALNS em leucócitos de indivíduos normais e adaptar a técnica de medida dessa atividade enzimática para sangue impregnado em papel filtro. O Km e a Vmáx da GALNS em leucócitos de indivíduos normais foi de 7,16mM e 77,3nmol/17h/mg de proteína, respectivamente. Também adaptamos a técnica da medida da atividade enzimática dessa enzima utilizando menor concentração de substrato (3mM), esta concentração teve correlação positiva com a concentração 10 mM, que é empregada na técnica original. A partir disto, foram estabelecidos os valores de referência em leucócitos para indivíduos normais e indivíduos afetados com MPS IV A. Os mesmos foram, respectivamente: 11,0 a 101,4 e 0,1 a 0,2 nmol/17h/mg de proteína. Foi também observado que, com o passar do tempo, a temperatura de 70ºC causa uma inativação gradual da atividade enzimática. Por último, apesar de várias alterações na técnica original em leucócitos, não foi possível adaptá-la para ser utilizada na medida da atividade da GALNS em sangue impregnado em papel filtro. A determinação dos parâmetros bioquímicos da GALNS é conveniente devido ao avanço nos estudos clínicos de desenvolvimento da terapia de reposição enzimática aos indivíduos afetados com MPS IV A e na distinção de indivíduos saudáveis, afetados e heterozigotos. Desenvolver técnicas fluorimétricas em amostras de sangue impregnado em papel filtro é de grande importância para serem utilizadas em triagem de recém-nascidos e populações de alto risco para MPS. Devendo ser confirmado por testes de atividade da enzima em leucócitos ou fibroblastos cultivados. A partir dos nossos protocolos, não foi possível desenvolver e padronizar uma técnica para medida da atividade da enzima N-acetilgalactosamina-6-sulfatase em sangue impregnado em papel filtro de modo a triarmos indivíduos com suspeita de MPS IV A. / Mucopolysaccharidosis (MPS) are inborn errors of metabolism, are part of the lysosomal storage diseases and occur due to the deficiency in the activity of enzymes that catalyze the degradation of glycosaminoglycans (GAGs). They are chronic and progressive diseases caused by the accumulation of one or more GAGs in the lysosomes of cells. The MPS type IV (Morquio syndrome) occurs by the accumulation of keratan sulfate and condoitin-6-sulfate, caused by two different enzyme deficiencies, which distinguish this MPS into two subtypes, deficiency of N-acetylgalactosamine-6-sulfatase (MPS IV type A) or the enzyme β-galactosidase (MPS type IV B). In MPS IVA the predominant clinical features are related to the skeletal system and in most cases the patient has normal intelligence. There is no effective therapy for the disease, so early diagnosis directs for the beginning of palliative treatments. The initial investigation of this MPS is based on clinical evaluation, radiographs, quantification and identification of urinary GAGs and the definitive diagnosis by measure of N-acetylgalactosamine-6-sulfatase (GALNS) activity in leukocytes or fibroblasts. The aim of this work was to study some biochemical parameters of the GALNS in leukocytes of normal individuals and adapt the technique of measuring this enzyme activity to blood impregnated on filter paper. The Km and Vmax of GALNS in leukocytes from normal subjects was 7.16 mM and 77.3 nmol/17h/mg of protein, respectively. We also adapted the technique of measuring the enzymatic activity of this enzyme using lower substrate concentration (3mM). This concentration had a positive correlation with 10 mM concentration, which is used in the original technique. From this, the reference values for normal and individuals affected with MPS IVA in leukocytes were established. They were 11.0 to 101.4 and 0.1 to 0.2 of nmol/17h/mg of protein, respectively. It was also observed that over time the temperature of 70°C causes a gradual inactivation of enzyme activity. Finally, despite several changes to the original technique in leukocytes, it has not been possible to adapt it to be used in measuring the activity of GALNS blood impregnated on filter paper. The determination of biochemical parameters of GALNS is convenient due to the advancement in clinical studies for the development of enzyme replacement therapy for individuals affected with MPS IVA and to distinguish between healthy and affected heterozygous individuals. The development of fluorometric techniques in blood impregnated on filter paper is of great importance for use in newborn screening and in high risk populations to MPS. It should be confirmed by tests of enzyme activity in leukocytes or cultured fibroblasts. Unfortunately, from our protocols, it was not possible to develop and standardize a technique for measuring the activity of the enzyme N- acetylgalactosamine-6-sulfatase in blood impregnated on filter paper for to screen individuals suspected of MPS IVA.

Mucopolissacaridoses (MPS) são erros inatos do metabolismo, fazem parte das doenças lisossômicas de depósito e ocorrem devido à deficiência na atividade de enzimas que catalisam a degradação de glicosaminoglicanos (GAGs). São doenças crônicas e progressivas causadas pelo acúmulo de um ou mais GAGs nos lisossomos das células. A MPS do tipo IV (síndrome de Morquio) ocorre pelo acúmulo de queratan sulfato e condoitin-6-sulfato, causado pela deficiência de duas diferentes enzimas, que distinguem essa MPS em dois subtipos, deficiência de N-acetilgalactosamina-6-sulfatase (MPS IV tipo A) ou de β-galactosidase (MPS IV tipo B). Na MPS IV A as características clínicas predominantes são relacionadas ao sistema esquelético e na maioria das vezes o paciente tem inteligência normal; não há uma terapia efetiva para a doença, deste modo o diagnóstico precoce direciona para o início de tratamentos paliativos. A investigação inicial dessa MPS se baseia em avaliação clínica, radiografias, quantificação e identificação de GAGs urinários e o diagnóstico definitivo pela medida da atividade enzimática da N-acetilgalactosamina-6-sulfatase (GALNS) em leucócitos ou fibroblastos. O objetivo desse trabalho foi estudar alguns parâmetros bioquímicos da enzima GALNS em leucócitos de indivíduos normais e adaptar a técnica de medida dessa atividade enzimática para sangue impregnado em papel filtro. O Km e a Vmáx da GALNS em leucócitos de indivíduos normais foi de 7,16mM e 77,3nmol/17h/mg de proteína, respectivamente. Também adaptamos a técnica da medida da atividade enzimática dessa enzima utilizando menor concentração de substrato (3mM), esta concentração teve correlação positiva com a concentração 10 mM, que é empregada na técnica original. A partir disto, foram estabelecidos os valores de referência em leucócitos para indivíduos normais e indivíduos afetados com MPS IV A. Os mesmos foram, respectivamente: 11,0 a 101,4 e 0,1 a 0,2 nmol/17h/mg de proteína. Foi também observado que, com o passar do tempo, a temperatura de 70ºC causa uma inativação gradual da atividade enzimática. Por último, apesar de várias alterações na técnica original em leucócitos, não foi possível adaptá-la para ser utilizada na medida da atividade da GALNS em sangue impregnado em papel filtro. A determinação dos parâmetros bioquímicos da GALNS é conveniente devido ao avanço nos estudos clínicos de desenvolvimento da terapia de reposição enzimática aos indivíduos afetados com MPS IV A e na distinção de indivíduos saudáveis, afetados e heterozigotos. Desenvolver técnicas fluorimétricas em amostras de sangue impregnado em papel filtro é de grande importância para serem utilizadas em triagem de recém-nascidos e populações de alto risco para MPS. Devendo ser confirmado por testes de atividade da enzima em leucócitos ou fibroblastos cultivados. A partir dos nossos protocolos, não foi possível desenvolver e padronizar uma técnica para medida da atividade da enzima N-acetilgalactosamina-6-sulfatase em sangue impregnado em papel filtro de modo a triarmos indivíduos com suspeita de MPS IV A. / Mucopolysaccharidosis (MPS) are inborn errors of metabolism, are part of the lysosomal storage diseases and occur due to the deficiency in the activity of enzymes that catalyze the degradation of glycosaminoglycans (GAGs). They are chronic and progressive diseases caused by the accumulation of one or more GAGs in the lysosomes of cells. The MPS type IV (Morquio syndrome) occurs by the accumulation of keratan sulfate and condoitin-6-sulfate, caused by two different enzyme deficiencies, which distinguish this MPS into two subtypes, deficiency of N-acetylgalactosamine-6-sulfatase (MPS IV type A) or the enzyme β-galactosidase (MPS type IV B). In MPS IVA the predominant clinical features are related to the skeletal system and in most cases the patient has normal intelligence. There is no effective therapy for the disease, so early diagnosis directs for the beginning of palliative treatments. The initial investigation of this MPS is based on clinical evaluation, radiographs, quantification and identification of urinary GAGs and the definitive diagnosis by measure of N-acetylgalactosamine-6-sulfatase (GALNS) activity in leukocytes or fibroblasts. The aim of this work was to study some biochemical parameters of the GALNS in leukocytes of normal individuals and adapt the technique of measuring this enzyme activity to blood impregnated on filter paper. The Km and Vmax of GALNS in leukocytes from normal subjects was 7.16 mM and 77.3 nmol/17h/mg of protein, respectively. We also adapted the technique of measuring the enzymatic activity of this enzyme using lower substrate concentration (3mM). This concentration had a positive correlation with 10 mM concentration, which is used in the original technique. From this, the reference values for normal and individuals affected with MPS IVA in leukocytes were established. They were 11.0 to 101.4 and 0.1 to 0.2 of nmol/17h/mg of protein, respectively. It was also observed that over time the temperature of 70°C causes a gradual inactivation of enzyme activity. Finally, despite several changes to the original technique in leukocytes, it has not been possible to adapt it to be used in measuring the activity of GALNS blood impregnated on filter paper. The determination of biochemical parameters of GALNS is convenient due to the advancement in clinical studies for the development of enzyme replacement therapy for individuals affected with MPS IVA and to distinguish between healthy and affected heterozygous individuals. The development of fluorometric techniques in blood impregnated on filter paper is of great importance for use in newborn screening and in high risk populations to MPS. It should be confirmed by tests of enzyme activity in leukocytes or cultured fibroblasts. Unfortunately, from our protocols, it was not possible to develop and standardize a technique for measuring the activity of the enzyme N- acetylgalactosamine-6-sulfatase in blood impregnated on filter paper for to screen individuals suspected of MPS IVA.

Introdução: As Doenças lisossômicas (DLs) são condições genéticas, herdadas na sua maioria de forma autossômica recessiva, caracterizadas usualmente pela deficiência de enzimas lisossômicas específicas, envolvidas na síntese, degradação, armazenamento ou transporte de macromoléculas necessárias para o funcionamento normal do organismo. Nas situações mais típicas, o substrato não degradado acumula-se progressivamente nos lisossomos, com repercussões estruturais e funcionais, levando a sinais e sintomas característicos. Os pacientes apresentam um amplo espectro de manifestações clínicas, que podem incluir disfunção de órgãos, anormalidades esqueléticas, envolvimento neuronal, entre outras. O diagnóstico é usualmente obtido pela identificação da deficiência enzimática específica em leucócitos obtidos do sangue periférico, usualmente realizado em laboratórios de referência. O transporte da amostra pode ser um obstáculo quando o serviço requisitante está situado longe do centro de referência ou em outro país, situação em que a amostra de sangue pode chegar ao laboratório já sem condições de ser analisada. Objetivo: Este estudo teve como objetivo principal, tornar disponível um método mais simples, seguro e acessível que utiliza amostras de leucócitos impregnados em papel filtro (LIPF) como uma nova ferramenta para o diagnóstico bioquímico de pacientes com DLs. Métodos: O estudo envolveu amostras de pacientes com diagnóstico previamente confirmado de DLs (amostra de conveniência, por se tratarem de doenças raras, com incidências individuais ao redor de 1:100.000 recém-nascidos vivos). Foram incluídos no estudo os pacientes com diagnóstico já estabelecido de DLs selecionadas (MPS IVA, Doença de Krabbe, Doença de Gaucher e Doença de Pompe), independente do sexo e/ou idade, atendidos no Serviço de Genética Médica do HCPA, que concordaram em participar do estudo. O grupo de referência negativo foi constituído pelas amostras de 50 indivíduos hígidos, adultos, de ambos os sexos. Resultados: Os resultados obtidos nos ensaios enzimáticos de pacientes com MPS IVA, Doença de Krabbe, Doença de Gaucher e Doença de Pompe, indicaram que as enzimas analisadas em amostras de LIPF permitiram a identificação de todos os pacientes, com sensibilidade de 100%. Os testes de estabilidade realizados nas amostras de LIPF indicaram que as amostras, quando mantidas a 4ºC, se mostram estáveis por pelo menos 30 dias. Conclusões: Nas condições utilizadas, amostras de LIPF se mostraram adequadas para a identificação segura de pacientes com MPS tipo IVA, Doença de Krabbe, Doença de Gaucher e Doença de Pompe. As amostras de leucócitos secos em papel filtro são mais estáveis e seguras para o transporte, indicando que possa ser esta uma importante ferramenta para facilitar a identificação de pacientes com DLDs, especialmente daqueles que vivem em áreas que tem dificuldades para a remessa de amostras líquidas para serviços de referência. / Background: Lysosomal Disorders (LDs) are genetic conditions, mostly inherited in autosomal recessive fashion, usually characterized by a deficiency of specific lysosomal enzymes involved in the synthesis, degradation, storage or transportation of macromolecules necessary for normal functioning of the organism. Typically, the non-degraded substrate is progressively accumulated in lysosomes, with structural and functional repercussions, leading to characteristic signs and symptoms. Affected patients present a wide range of clinical manifestations, which may include organ dysfunction, skeletal anomalies, neuronal involvement, etc. The diagnosis is normally made through identification of the specific enzyme deficiency in white blood cells from a sample of peripheral blood, usually performed in reference laboratories. The transporting of a liquid sample can be a problem when the test orderer is located far from the reference center or in a foreign country, as often the blood sample arrives at the laboratory in poor condition and cannot be properly analyzed. Aim: The main aim of this study was to make available a new technique that is simpler, safer and more accessible, using leukocytes impregnated on filter paper (LIFP) as a new tool for the biochemical diagnosis of patients with LSDs. Methods: This study involved samples of patients with previously confirmed diagnosis of selected LSDs (a convenience sample, as these are rare diseases, with individual incidences around 1:100.000 live newborns). Patients with an established diagnosis of MPS IVA, Krabbe Disease, Gaucher’s disease and Pompe disease regardless of sex and/or age, cared for at the Genetics Service of HCPA and who agreed to participate were included in the study. The negative reference group comprised blood samples from 50 healthy adults of both genders. Results: The results obtained in the enzymatic assays of patients with MPS IVA, Krabbe Disease, Gaucher’s disease, and Pompe disease indicated that the analyzed enzymes in LIFP samples allowed the identification of all patients, with sensitivity of 100%. The stability tests performed in LIFP samples indicated that samples, when maintained at 4ºC, were stable for at least 30 days. Conclusions: In the conditions used, LIFP samples were shown to be adequate for a reliable identification of patients with MPS IVA, Krabbe Disease, Gaucher’s disease, and Pompe disease. Blood samples on filter paper are more stable and reliable for transportation, indicating that this may be an important tool to facilitate the identification of patients with LSDs, particularly those living in areas with difficulties for the shipment of liquid samples to reference cervices.

Introdução: As Doenças lisossômicas (DLs) são condições genéticas, herdadas na sua maioria de forma autossômica recessiva, caracterizadas usualmente pela deficiência de enzimas lisossômicas específicas, envolvidas na síntese, degradação, armazenamento ou transporte de macromoléculas necessárias para o funcionamento normal do organismo. Nas situações mais típicas, o substrato não degradado acumula-se progressivamente nos lisossomos, com repercussões estruturais e funcionais, levando a sinais e sintomas característicos. Os pacientes apresentam um amplo espectro de manifestações clínicas, que podem incluir disfunção de órgãos, anormalidades esqueléticas, envolvimento neuronal, entre outras. O diagnóstico é usualmente obtido pela identificação da deficiência enzimática específica em leucócitos obtidos do sangue periférico, usualmente realizado em laboratórios de referência. O transporte da amostra pode ser um obstáculo quando o serviço requisitante está situado longe do centro de referência ou em outro país, situação em que a amostra de sangue pode chegar ao laboratório já sem condições de ser analisada. Objetivo: Este estudo teve como objetivo principal, tornar disponível um método mais simples, seguro e acessível que utiliza amostras de leucócitos impregnados em papel filtro (LIPF) como uma nova ferramenta para o diagnóstico bioquímico de pacientes com DLs. Métodos: O estudo envolveu amostras de pacientes com diagnóstico previamente confirmado de DLs (amostra de conveniência, por se tratarem de doenças raras, com incidências individuais ao redor de 1:100.000 recém-nascidos vivos). Foram incluídos no estudo os pacientes com diagnóstico já estabelecido de DLs selecionadas (MPS IVA, Doença de Krabbe, Doença de Gaucher e Doença de Pompe), independente do sexo e/ou idade, atendidos no Serviço de Genética Médica do HCPA, que concordaram em participar do estudo. O grupo de referência negativo foi constituído pelas amostras de 50 indivíduos hígidos, adultos, de ambos os sexos. Resultados: Os resultados obtidos nos ensaios enzimáticos de pacientes com MPS IVA, Doença de Krabbe, Doença de Gaucher e Doença de Pompe, indicaram que as enzimas analisadas em amostras de LIPF permitiram a identificação de todos os pacientes, com sensibilidade de 100%. Os testes de estabilidade realizados nas amostras de LIPF indicaram que as amostras, quando mantidas a 4ºC, se mostram estáveis por pelo menos 30 dias. Conclusões: Nas condições utilizadas, amostras de LIPF se mostraram adequadas para a identificação segura de pacientes com MPS tipo IVA, Doença de Krabbe, Doença de Gaucher e Doença de Pompe. As amostras de leucócitos secos em papel filtro são mais estáveis e seguras para o transporte, indicando que possa ser esta uma importante ferramenta para facilitar a identificação de pacientes com DLDs, especialmente daqueles que vivem em áreas que tem dificuldades para a remessa de amostras líquidas para serviços de referência. / Background: Lysosomal Disorders (LDs) are genetic conditions, mostly inherited in autosomal recessive fashion, usually characterized by a deficiency of specific lysosomal enzymes involved in the synthesis, degradation, storage or transportation of macromolecules necessary for normal functioning of the organism. Typically, the non-degraded substrate is progressively accumulated in lysosomes, with structural and functional repercussions, leading to characteristic signs and symptoms. Affected patients present a wide range of clinical manifestations, which may include organ dysfunction, skeletal anomalies, neuronal involvement, etc. The diagnosis is normally made through identification of the specific enzyme deficiency in white blood cells from a sample of peripheral blood, usually performed in reference laboratories. The transporting of a liquid sample can be a problem when the test orderer is located far from the reference center or in a foreign country, as often the blood sample arrives at the laboratory in poor condition and cannot be properly analyzed. Aim: The main aim of this study was to make available a new technique that is simpler, safer and more accessible, using leukocytes impregnated on filter paper (LIFP) as a new tool for the biochemical diagnosis of patients with LSDs. Methods: This study involved samples of patients with previously confirmed diagnosis of selected LSDs (a convenience sample, as these are rare diseases, with individual incidences around 1:100.000 live newborns). Patients with an established diagnosis of MPS IVA, Krabbe Disease, Gaucher’s disease and Pompe disease regardless of sex and/or age, cared for at the Genetics Service of HCPA and who agreed to participate were included in the study. The negative reference group comprised blood samples from 50 healthy adults of both genders. Results: The results obtained in the enzymatic assays of patients with MPS IVA, Krabbe Disease, Gaucher’s disease, and Pompe disease indicated that the analyzed enzymes in LIFP samples allowed the identification of all patients, with sensitivity of 100%. The stability tests performed in LIFP samples indicated that samples, when maintained at 4ºC, were stable for at least 30 days. Conclusions: In the conditions used, LIFP samples were shown to be adequate for a reliable identification of patients with MPS IVA, Krabbe Disease, Gaucher’s disease, and Pompe disease. Blood samples on filter paper are more stable and reliable for transportation, indicating that this may be an important tool to facilitate the identification of patients with LSDs, particularly those living in areas with difficulties for the shipment of liquid samples to reference cervices.

Introdução: As Doenças lisossômicas (DLs) são condições genéticas, herdadas na sua maioria de forma autossômica recessiva, caracterizadas usualmente pela deficiência de enzimas lisossômicas específicas, envolvidas na síntese, degradação, armazenamento ou transporte de macromoléculas necessárias para o funcionamento normal do organismo. Nas situações mais típicas, o substrato não degradado acumula-se progressivamente nos lisossomos, com repercussões estruturais e funcionais, levando a sinais e sintomas característicos. Os pacientes apresentam um amplo espectro de manifestações clínicas, que podem incluir disfunção de órgãos, anormalidades esqueléticas, envolvimento neuronal, entre outras. O diagnóstico é usualmente obtido pela identificação da deficiência enzimática específica em leucócitos obtidos do sangue periférico, usualmente realizado em laboratórios de referência. O transporte da amostra pode ser um obstáculo quando o serviço requisitante está situado longe do centro de referência ou em outro país, situação em que a amostra de sangue pode chegar ao laboratório já sem condições de ser analisada. Objetivo: Este estudo teve como objetivo principal, tornar disponível um método mais simples, seguro e acessível que utiliza amostras de leucócitos impregnados em papel filtro (LIPF) como uma nova ferramenta para o diagnóstico bioquímico de pacientes com DLs. Métodos: O estudo envolveu amostras de pacientes com diagnóstico previamente confirmado de DLs (amostra de conveniência, por se tratarem de doenças raras, com incidências individuais ao redor de 1:100.000 recém-nascidos vivos). Foram incluídos no estudo os pacientes com diagnóstico já estabelecido de DLs selecionadas (MPS IVA, Doença de Krabbe, Doença de Gaucher e Doença de Pompe), independente do sexo e/ou idade, atendidos no Serviço de Genética Médica do HCPA, que concordaram em participar do estudo. O grupo de referência negativo foi constituído pelas amostras de 50 indivíduos hígidos, adultos, de ambos os sexos. Resultados: Os resultados obtidos nos ensaios enzimáticos de pacientes com MPS IVA, Doença de Krabbe, Doença de Gaucher e Doença de Pompe, indicaram que as enzimas analisadas em amostras de LIPF permitiram a identificação de todos os pacientes, com sensibilidade de 100%. Os testes de estabilidade realizados nas amostras de LIPF indicaram que as amostras, quando mantidas a 4ºC, se mostram estáveis por pelo menos 30 dias. Conclusões: Nas condições utilizadas, amostras de LIPF se mostraram adequadas para a identificação segura de pacientes com MPS tipo IVA, Doença de Krabbe, Doença de Gaucher e Doença de Pompe. As amostras de leucócitos secos em papel filtro são mais estáveis e seguras para o transporte, indicando que possa ser esta uma importante ferramenta para facilitar a identificação de pacientes com DLDs, especialmente daqueles que vivem em áreas que tem dificuldades para a remessa de amostras líquidas para serviços de referência. / Background: Lysosomal Disorders (LDs) are genetic conditions, mostly inherited in autosomal recessive fashion, usually characterized by a deficiency of specific lysosomal enzymes involved in the synthesis, degradation, storage or transportation of macromolecules necessary for normal functioning of the organism. Typically, the non-degraded substrate is progressively accumulated in lysosomes, with structural and functional repercussions, leading to characteristic signs and symptoms. Affected patients present a wide range of clinical manifestations, which may include organ dysfunction, skeletal anomalies, neuronal involvement, etc. The diagnosis is normally made through identification of the specific enzyme deficiency in white blood cells from a sample of peripheral blood, usually performed in reference laboratories. The transporting of a liquid sample can be a problem when the test orderer is located far from the reference center or in a foreign country, as often the blood sample arrives at the laboratory in poor condition and cannot be properly analyzed. Aim: The main aim of this study was to make available a new technique that is simpler, safer and more accessible, using leukocytes impregnated on filter paper (LIFP) as a new tool for the biochemical diagnosis of patients with LSDs. Methods: This study involved samples of patients with previously confirmed diagnosis of selected LSDs (a convenience sample, as these are rare diseases, with individual incidences around 1:100.000 live newborns). Patients with an established diagnosis of MPS IVA, Krabbe Disease, Gaucher’s disease and Pompe disease regardless of sex and/or age, cared for at the Genetics Service of HCPA and who agreed to participate were included in the study. The negative reference group comprised blood samples from 50 healthy adults of both genders. Results: The results obtained in the enzymatic assays of patients with MPS IVA, Krabbe Disease, Gaucher’s disease, and Pompe disease indicated that the analyzed enzymes in LIFP samples allowed the identification of all patients, with sensitivity of 100%. The stability tests performed in LIFP samples indicated that samples, when maintained at 4ºC, were stable for at least 30 days. Conclusions: In the conditions used, LIFP samples were shown to be adequate for a reliable identification of patients with MPS IVA, Krabbe Disease, Gaucher’s disease, and Pompe disease. Blood samples on filter paper are more stable and reliable for transportation, indicating that this may be an important tool to facilitate the identification of patients with LSDs, particularly those living in areas with difficulties for the shipment of liquid samples to reference cervices.

Mucopolysaccharidoses are a group of diseases that belong to lysosomal storage disorders. A common sign of these monogenic multisystem diseases is a gene mutation leading to a deficiency of the lysosomal enzyme participating in glycosaminoglycan degradation. It results to their accumulation in the tissues and organs, where they cause a progressive damage. There is no efficient treatment available for most mucopolysaccharidoses. Moreover, the research is complicated because of the low prevalence and type of affected tissues. Animal models of these human diseases are used for an evaluation of newly developed therapeutic approaches. However, they also have many limitations due to the different pathogenesis and catabolic pathways of the accumulated substrates between humans and animals. Therefore, animal models are replaced by human cell models. In this thesis, the development of four mucopolysaccharidoses human cell models is reported (MPS IIID, MPS IVA, MPS IVB, MPS VI). Corresponding genes (GNS, GALNS, GLB1, ARSB) were inactivated using CRISPR/Cas9 technology, where plasmids containing specific inserts are delivered to the target human induced pluripotent stem cells (iPSC), using electroporation. Isolated clones, which represent iPSC disease models, were characterized by Sanger sequencing, enzyme...