Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Traditionally, the exocrine and endocrine cellular compartments of the pancreas have been considered distinct functional systems. However, recent studies suggest a more intricate relationship between the exocrine and endocrine, which may impact pancreatic growth and health. Additionally, translational control mechanisms have been linked to organ development. Our lab has shown that the mRNA translation factor eukaryotic initiation factor 5A (eIF5A), when in its post-translationally modified “hypusinated” form, plays a role in pancreas development. The hypusination of eIF5A requires the rate-limiting enzyme deoxyhypusine synthase (Dhps) to post- translationally modify a critical lysine residue which in turn produces the active form of eIF5A that functions in mRNA translation. When we generated animals with a deletion of Dhps in the pancreatic progenitor cells, there was no alteration in islet mass but significant exocrine insufficiency at embryonic (E) day 18.5 concomitant with downregulation of proteins required for exocrine pancreas development and function. Resultantly these animals died by 6 weeks-of-age. These observations prompted the question, is the phenotype caused by the absence of hypusinated eIF5A or the increase of unhypusinated eIF5A? To address this, we generated a mouse model wherein Eif5a is deleted in the pancreas (eIF5A∆PANC) and these mutant animals also display exocrine insufficiency. Interestingly, beta cell mass is increased at E18.5, and the mutant animals maintain euglycemia and survive up to 2 years. Ongoing analyses are interrogating the differences between these animal models with the goal to determine if mRNA translation facilitates cellular communication between the exocrine and endocrine pancreas.

Le striatum dorsal et le noyau accumbens (NAc) jouent un rôle crucial dans la sélection et l’exécution de mouvements résultant de l’intégration de signaux dopaminergiques et d’informations glutamatergiques sensorielles. A ce jour, les mécanismes moléculaires à travers lesquels la dopamine (DA) régule la plasticité des neurones épineux moyens du striatum (MSNs) sont peu connus. La synthèse des protéines est un événement essentiel requis pour la plasticité synaptique et la mémoire à long terme. Dans de nombreuses régions cérébrales, l’initiation, étant l'étape limitante de la synthèse protéique, est contrôlée par la phosphorylation de facteurs d’initiation de la traduction (eIFs). Notre hypothèse est que la DA pourrait réguler la traduction d’ARNm dans le striatum à travers des mécanismes moléculaires similaires. La première partie de cette thèse visait à étudier le rôle de la DA dans la régulation de la machinerie de traduction dans les MSNs. Pour ce faire, nous avons analysé au niveau du striatum, la phosphorylation de différents eIFs en réponse à l’administration aigue ou répétée de d-amphetamine (d-amph), entraînant une augmentation transitoire ou de longue durée de la transmission dopaminergique, respectivement. Bien que l’administration de la d-amph est associée à une légère augmentation de pS209-eIF4E, l’état de phosphorylation de S1108-eIF4G reste inchangé. En revanche, une forte augmentation de p51-eIF2α a été observée après administration répétée d-amph. Nous démontrons que la phosphorylation de 51-eIF2α est corrélée à une diminution transitoire de la synthèse protéique globale dans le striatum. En outre, la d-amph induit également une importante augmentation de la phosphorylation de la protéine ribosomale S6 (rpS6). Cet effet se produit spécifiquement dans MSNs exprimant le récepteur D1 à la DA et implique la cascade de signalisation AMPc/PKA/DARPP-32, tout en étant indépendant des voies mTORC1/S6K et ERK. La phosphorylation de rpS6 est couramment utilisée pour marquer de l'activité neuronale bien que son rôle biologique dans le cerveau reste énigmatique. Compte tenu sa régulation significative par la DA, la deuxième partie de cette thèse a eu pour but d’acquérir de nouvelles connaissances sur la fonction de la phosphorylation de rpS6 en utilisant un modèle de souris rpS6 déficient de ses sites de phosphorylations, rpS6P-/-. Dans ces souris transgéniques la synthèse protéique globale est normale dans diverses régions du cerveau. Néanmoins, les souris rpS6P -/- présentent une altération de la traduction d'un sous-ensemble de ARNm, ceci sélectivement dans le NAc, suggérant le rôle potentiel de la phosphorylation de rpS6 dans la régulation de la traduction de transcrits bien spécifiques au sein de cette sous-région du striatum. Dans l'ensemble, les résultats présentés dans cette thèse permettent une meilleure compréhension des mécanismes engagés par DA pour contrôler la traduction d’ ARNm dans les MSNs du striatum. / The dorsal striatum and the nucleus accumbens (NAc) process dopamine (DA) signals in order to generate appropriate behavior in response to given glutamatergic sensory cues. The molecular mechanisms through which DA promotes long-lasting changes in striatal GABAergic medium-sized spiny neurons (MSNs) are still not fully understood. It is widely accepted that protein synthesis is an essential event required for several forms of synaptic plasticity and long-term memory. In various brain areas, initiation is the rate-limiting step of translation and is regulated through phosphorylation of translation initiation factors (eIFs). Whether DA could regulate mRNA translation in the striatum through similar mechanisms is yet poorly investigated. A first part of this thesis aimed to shed light on the role of DA in the regulation of the translational machinery in MSNs. Here, we measured the phosphorylation state of eIFs following single and repeated in vivo d-amphetamine (d-amph) administration, resulting in a transient or long-lasting increase of the dopaminergic transmission, respectively. Although d-amph exposure slightly enhances the striatal pS209-eIF4E, pS1108-eIF4G remains unchanged. In contrast, a strong increase in p51-eIF2α is observed after repeated d-amph administration. We demonstrate that d-amph-induced p51-eIF2α is associated to a transient decrease in generall striatal protein synthesis. In addition, d-amph markedly increases the striatal phosphorylation of the 40S ribosomal protein S6 (rpS6). This effect occurs selectively in D1 DA receptor (D1R)-expressing MSNs and requires the cAMP/PKA/DARPP-32 cascade but is independent of mTORC1/S6K and ERK signaling. rpS6 phosphorylation is commonly used as a marker for neuronal activity even though its biological role in the brain remains puzzling. Given the significant regulation of striatal rpS6 phosphorylation by DA, the second part of this thesis sought to gain new insights into the function of this post-translational event by using a phosphodeficient rpS6P-/- mouse model. We showed that rpS6P-/- mice display unaltered global protein synthesis in different brain regions. Nonetheless, rpS6P-/- mice exhibit impaired translation of a subset of mRNA selectively in the NAc, pointing to the potential role of rpS6 phosphorylation in the regulation of transcript-specific translation within this striatal sub-region. Overall, the results presented in this thesis provide a better understanding of the mechanisms engaged by DA to control mRNA translation in striatal MSNs.

Il est à ce jour bien établi que la régulation de l’expression génique dépend en grande partie des évènements post-transcriptionnels et que la traduction des ARNm tient un rôle de premier plan dans ces processus. Elle est particulièrement importante pour définir le protéome, maintenir l’homéostasie et contrôler la croissance et la prolifération cellulaire. De nombreuses pathologies humaines telles que le cancer découlent de dérèglements de la synthèse protéique. Ceci souligne l’importance d’une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires contribuant au contrôle de la traduction des ARNm. Le facteur d’initiation eIF4E est essentiel à la traduction et son activité est régulée par ses partenaires protéiques dont font partie les protéines 4E-BP et 4E-T. Les voies de signalisation PI3K/mTOR et MAPK qui sont fortement impliquées dans l’étiologie du cancer, contrôlent la traduction en modulant l’activité d’eIF4E via l’inhibition des protéines 4E-BP et la localisation de 4E-T. Afin d’améliorer notre compréhension des mécanismes régulant la traduction des ARNm, nous avons utilisé plusieurs approches. Tout d’abord, nous avons caractérisé les mécanismes par lesquels le complexe mTORC1 est activé en réponse aux facteurs de croissance et avons déterminé que la kinase RSK, en aval de la voie Ras/ERK, contrôle directement l’activité de mTORC1 en phosphorylant Raptor, la sous-unité régulatrice du complexe mTORC1. Par ailleurs, nous nous sommes intéressés au rôle joué par mTORC1 dans l’initiation de la traduction. Pour cela, nous avons réalisé un criblage protéomique dans le but d’identifier de nouveaux facteurs sous le contrôle de mTORC1 qui participent activement à la traduction. Ces travaux ont ainsi permis l’identification de la protéine de liaison à l’ARN LARP1 comme effecteur majeur de la traduction des ARNm et de la croissance cellulaire en aval de mTORC1. Finalement, notre étude de l’effet du stress oxydant dans la répression de la traduction nous a permis de montrer que la kinase JNK contrôle la localisation du répresseur 4E-T au sein des P-bodies, qui sont des granules cytoplasmiques concentrant des ARNm non traduits et des facteurs de la dégradation des ARNm. Nos travaux ont donc abouti à la découverte de mécanismes moléculaires cruciaux impliqués dans la régulation de la traduction des ARNm et de la synthèse protéique. Ces derniers étant largement impliqués dans la prolifération cellulaire et la croissance tumorale, nos recherches ouvrent sur un champ d’investigation plus large pour le développement de nouvelles molécules anti-cancéreuses. / It is now well established that gene expression is predominantly regulated by post-transcriptional events and that mRNA translation plays an essential role in this process. Translation of mRNAs is especially important in defining the proteome, maintaining homeostasis and controlling cell growth and cell proliferation. Several human diseases such as cancer are associated with aberrant regulation of protein synthesis highlighting the need to better understand the molecular mechanisms contributing to translational control. The translation initiation factor eIF4E is a key component of the translational machinery whose activity is controlled by its partners, the 4E-BP and 4E-T proteins. The PI3K/mTOR and MAPK signaling pathways, which are strongly implicated in cancer etiology, control mRNA translation by modulating eIF4E activity through the inhibition of the 4E-BPs and the regulation of eIF4E localization by 4E-T. In order to better understand how mRNA translation is regulated we used several approaches. First, we characterized the mechanisms contributing to mTORC1 activation in response to growth factor. We found that the kinase RSK, that lies downstream of the Ras/ERK pathway, directly controls mTORC1 activity by phosphorylating Raptor, the regulatory sub-unit of the complex. This provides evidence of an additional mechanism by which MAPK pathway regulates mTORC1. We next performed a proteomic screen to identify novel mTOR-regulated factors that actively participate in translation. This approach led to the identification of several candidate proteins which included the RNA-binding protein LARP1 that we found to be a major effector of mTORC1-mediated mRNA translation, cell growth and proliferation. Finally we investigated the impact of oxidative stress on translation inhibition and found that the JNK kinase controls 4E-T localization in P-bodies that are cytoplasmic granules containing non-translating mRNAs and proteins from the mRNA decay and silencing machineries. Together this work provides important novel insights into the regulation of mRNA translation and protein synthesis that represent processes strongly connected to tumorigenesis and brings precious information on the mechanisms by which signaling pathways control cell growth and proliferation.

<p>  </p> <p>Traditionally, the exocrine and endocrine cellular compartments of the pancreas have been considered distinct functional systems. However, recent studies suggest a more intricate relationship between the exocrine and endocrine, which may impact pancreatic growth and health. Additionally, translational control mechanisms have been linked to organ development. Our lab has shown that the mRNA translation factor eukaryotic initiation factor 5A (eIF5A), when in its post-translationally modified “hypusinated” form, plays a role in pancreas development. The hypusination of eIF5A requires the rate-limiting enzyme deoxyhypusine synthase (<em>Dhps</em>) to post-translationally modify a critical lysine residue which in turn produces the active form of eIF5A that functions in mRNA translation. When we generated animals with a deletion of <em>Dhps</em> in the pancreatic progenitor cells, there was no alteration in islet mass but significant exocrine insufficiency at embryonic (E) day 18.5 concomitant with downregulation of proteins required for exocrine pancreas development and function. Resultantly these animals died by 6 weeks-of-age. These observations prompted the question, is the phenotype caused by the absence of hypusinated eIF5A or the increase of unhypusinated eIF5A? To address this, we generated a mouse model wherein <em>Eif5a</em> is deleted in the pancreas (eIF5A∆PANC) and these mutant animals also display exocrine insufficiency. Interestingly, beta cell mass is increased at E18.5, and the mutant animals maintain euglycemia and survive up to 2 years. Ongoing analyses are interrogating the differences between these animal models with the goal to determine if mRNA translation facilitates cellular communication between the exocrine and endocrine pancreas.</p>

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Le cancer de la prostate (CaP) est devenu un véritable problème de santé publique dans les pays industrialisés. L'hormonothérapie reste le traitement de première ligne le plus efficace dans les cancers avancés mais il n'empêche pas la progression vers un stade androgéno-indépendant (AI), pour lequel la chimiothérapie s'avère peu efficace. Une des stratégies pour améliorer les thérapies actuelles consiste à cibler des gènes de survie surexprimés dans les CaPs AI afin de restaurer la sensibilité aux traitements du CaPs. Hsp27, protéine surexprimée dans ces cancers, à un effet cytoprotecteur qui engendre une résistance aux traitements. Elle est maintenant reconnue comme une cible thérapeutique importante. Rocchi et al. ont développé un oligonucléotide antisense (ASO) de deuxième génération (OGX-427) qui cible l'ARNm d'Hsp27. OGX-427 est actuellement en essai clinique phase II chez des patients atteints de CaPs au Canada et aux Etats-Unis. Mon projet de thèse a porté sur l'étude des mécanismes d'action d'Hsp27 impliqués dans l'évolution AI du CaP. Cette étude a pour but d'améliorer la sureté pharmacologique d'OGX-427, mais aussi d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques visant spécifiquement les cellules tumorales. Mes travaux de thèse ont montré que lors d'un stress cellulaire induit par hormonothérapie et/ou chimiothérapie, Hsp27 interagit avec le facteur eucaryotique d'initiation de la traduction eIF4E et le protège de sa dégradation par la voie ubiquitine/protéasome. Ceci maintient la synthèse protéique et engendre une survie cellulaire impliquée en partie dans l'effet cytoprotecteur médié par Hsp27. / Prostate cancer (PC) has become a real public health issue in industrialized countries, mainly due to patients' relapse by castration-resistant (CR) disease after androgen ablation. One strategy to improve current therapies in advanced PC involves targeting genes that are activated by androgen withdrawal, either to delay or prevent the emergence of the CR phenotype. Hsp27 is over-expressed in this cancer and has been shown to play a cytoprotective role leading to treatments resistance. This protein is now considered as promising therapeutic target. Rocchi, P. et al. developed and patented a second generation antisens oligonucleotides (ASO) targeting Hsp27 that has been licensed (OGX-427) and phase II clinical trials are currently in process in PC in Canada and USA. My PhD project focused on the study of Hsp27 action mechanisms involved in CRPC progression. The present study aims to improve pharmacological safety of OGX-427 and to identify new therapeutic targets specific of CRPC cells. The results of my PhD have shown that during cell stress induced by hormone- and/or chemotherapy, Hsp27 interacts with eukaryotic translation initiation factor eIF4E and protects it from degradation by the ubiquitin/proteasome pathway. This maintains protein synthesis and leads to cell survival, partly involved in the cytoprotection mediated by Hsp27. Our work therefore concerned the characterization of the interaction site between Hsp27 and eIF4E in order to identify potential inhibitors of this interaction that could delay CRPC progression.

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / In response to different environmental stresses, phosphorylation of eukaryotic initiation factor-2 (eIF2) rapidly reduces protein synthesis, which lowers energy expenditure and facilitates reprogramming of gene expression to remediate stress damage. Central to the changes in gene expression, eIF2 phosphorylation also enhances translation of ATF4, a transcriptional activator of genes subject to the Integrated Stress Response (ISR). The ISR increases the expression of genes important for alleviating stress, or alternatively triggering apoptosis. One ISR target gene encodes the transcriptional regulator CHOP whose accumulation is critical for stress-induced apoptosis. In this dissertation research, I show that eIF2 phosphorylation induces preferential translation of CHOP by a mechanism involving a single upstream ORF (uORF) located in the 5’-leader of the CHOP mRNA. In the absence of stress and low eIF2 phosphorylation, translation of the uORF serves as a barrier that prevents translation of the downstream CHOP coding region. Enhanced eIF2 phosphorylation during stress facilitates ribosome bypass of the uORF, and instead results in the translation of CHOP. Stable cell lines were also constructed that express CHOP transcript containing the wild type uORF or deleted for the uORF and each were analyzed for expression changes in response to the different stress conditions. Increased CHOP levels due to the absence of inhibitory uORF sensitized the cells to stress-induced apoptosis when compared to the cells that express CHOP mRNA containing the wild type uORF. This new mechanism of translational control explains how expression of CHOP and the fate of cells are tightly linked to the levels of phosphorylated eIF2 and stress damage.

Malgré les thérapies anti-cancéreuses ciblées, beaucoup de patients récidivent à cause de la résistance aux traitements qui constitue un problème clinique majeur. Cette résistance est soutenue par la reprogrammation métabolique et traductionnelle. La synthèse des protéines oncogéniques fait appel au complexe d’initiation de la traduction eucaryote 4F (eIF4F), compris des facteurs : eIF4A, eIF4E et eIF4G. Il est ainsi possible de cibler la synthèse protéique spécifique aux cellules cancéreuses par des inhibiteurs de l’initiation de la traduction. Nous proposons que le ciblage de la machinerie traductionnelle, via l’inhibition du eIF4A (eIF4Ai), affecte particulièrement les cellules cancéreuses. Mais est-ce qu’il est en mesure d’atténuer la résistance aux inhibiteurs de kinase (IKs) et d’en empêcher l’adaptation et la reprogrammation métabolique? L’efficacité des eIF4Ais est vérifiée par l’évaluation de la croissance et de la mort cellulaire (Annexine V) dans des cellules de mélanome, sensibles et résistantes aux IKs. Celle-ci est accompagnée de la réduction de la synthèse protéique évaluée par profilage polysomique, de la baisse des cibles de l'eIF4Ai (BCL-2, CDK4...) quantifiées par western-blots, d’un important stress bioénergétique mesuré par Seahorse et du contrôle des principales voies métaboliques analysées par GCMS. L’analyse du profilage polysomique, de l’ARNseq et du métabolome permettront de mettre en évidence les réseaux qui soutiennent l’efficacité des eIF4Ais et les mécanismes moléculaires sous-jacents à l’efficacité de cette thérapie. Ces derniers seront par la suite validés par des approches génétiques évaluant les principaux gènes et voies métaboliques qui y sont impliqués. Cette étude comblera de grosses lacunes dans les connaissances relatives aux mécanismes moléculaires qui soutiennent la résistance aux IKs afin d’améliorer leur efficacité en clinique. / Despite advances in research and development of targeted cancer therapies, many patients relapse due to treatment resistance. This is the case of melanoma resistant to BRAF inhibitors (BRAFi). 40-50% of melanoma cancer cells express the constitutively active oncoprotein BRAFV600E, leading to metabolic and translational reprogramming that is proposed to support resistance to cancer therapies. Studies have shown the importance of the eukaryotic translation initiation complex 4F (eIF4F), including factors: eIF4A, eIF4E and eIF4G, in the oncogenic proteins’ synthesis (e.g. growth factors, metabolic factors, etc.). The cancer cells translatome is distinct from the normal cells translatome. It is thus possible to target protein synthesis specific to cancer cells using molecules that inhibit translation initiation, the limiting phase in this process, affecting the cancer cells specifically. We propose that targeting the translational machinery via eIF4A inhibitors (eIF4Ai) would attenuate resistance to kinase inhibitors (KIs) and we seek to dissect the underlying molecular mechanisms. The efficacy of eIF4Ais in BRAFi sensitive and/or resistant melanoma is evaluated showing that eIF4Ais inhibit cell growth and induce melanoma cells death, using growth curves and FACS (Annexin_V). This is accompanied by a protein synthesis reduction, evaluated by polysome profiling showing a decrease in eIF4Ais treated cells and western-blots showing a decrease in translational targets of eIF4Ai (BCL-2, CDK4, etc.). A significant bioenergetic stress is measured by Seahorse and the control of the main metabolic pathways including glycolysis, TCA cycle and amino acids metabolism is analyzed by GCMS. Then the analysis of the translatome by polysome profiling and RNAseq and of the metabolome by GCMS/LCMS and Seahorse shed light on the translational networks that dictate metabolic reprogramming supporting eIF4Ai efficacy. Finally, the molecular mechanisms underlying the efficacy of eIF4Ai will be identified using genetic approaches to validate the main genes and metabolites and/or corresponding metabolic pathways involved in the response to eIF4Ai of the kinase inhibitor resistant melanoma. This study will fill large gaps in knowledge about the molecular mechanisms that support resistance to KIs in order to improve their clinical efficacy.

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