Many genetic processes require enzymes or enzyme complexes that interact simultaneously with distant sites along the genome. Such long-range DNA-enzyme interactions are important for example in gene regulation, DNA replication, repair and recombination. In addition many restriction enzymes depend on interactions between two recognition sites and form therefore a model system for studying long-range communications on DNA. Topic of the present work are Type III restriction enzymes. For these enzymes the communication mechanism between their distant target sites has not been resolved and conflicting models including 3D diffusion, 1D translocation and 1D diffusion have been proposed. Also the role of ATP hydrolysis by their superfamily 2 helicase domains which catalyse functions of many enzyme systems is still poorly understood. To cleave DNA, Type III restriction enzymes sense the relative orientation of their distant target sites and cleave DNA only if at least two of them are situated in an inverted repeat. This process strictly depends on ATP hydrolysis. The aim of this PhD thesis was to elucidate this long-range communication. For this a new single molecule assay was developed using a setup combining magnetic tweezers and objective-type total internal reflection fluorescence microscopy. In addition of being able to mechanically manipulate individual DNA molecules, this assay allows to directly visualize the binding and movement of fluorescently labelled enzymes along DNA. Applying this assay to quantum dot labelled Type III restriction enzymes, a 1D diffusion of the enzymes after binding at their target sites could be demonstrated. Furthermore, it was found that the diffusion depends on the nucleotide that is bound to the ATPase domains of these enzymes. This suggested that ATP hydrolysis acts as a switch to license diffusion from the target site which leads to cleavage. In addition to the direct visualization of the enzyme-DNA interaction, the cleavage site selection, the DNA end influence (open or blocked) and the DNA binding kinetics were measured in bulk solution assays (not part of this thesis). The experimental results were compared to Monte Carlo simulations of a diffusion-collision-model which is proposed as long-range communication in this thesis.

Aufgrund einer komplexen Wechselwirkung mit Proteinen ist das Genom in einer Zelle ständig mechanischer Spannung und Torsion ausgesetzt. Daher ist es wichtig die Mechanik und die Dynamik von verdrillter DNA unter Spannung zu verstehen. Diese Situation wurde experimentell mittels einer sog. magnetischen Pinzette nachgestellt, indem sowohl Kraft als auch Drehmoment auf ein einzelnes DNA Molekül ausgeübt und gleichzeitig die mechanische Antwort des Polymers aufgezeichnet wurde. Als erstes Beispiel wurde der Übergang von linearer zu sog. plectonemischer DNA untersucht, d.h. die Absorption eines Teils der induzierten Verdrillung in einer superhelikalen Struktur. Eine abrupte Längenänderung am Anfang dieses Übergangs wurde bereits im Vorfeld publiziert. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass diese abrupte DNA Verkürzung insbesondere von der Länge der DNA und der Ionenkonzentration der Lösung abhängt. Dieses Verhalten kann mittels eines Modells verstanden werden, in dem die Energie pro Verwringung der ersten Schlinge innerhalb der Superhelix größer ist als die aller nachfolgenden. Des Weiteren wurden DNA-DNA Wechselwirkungen in der Umgebung monovalenter Ionen durch die Analyse des Superspiralisierungsverhaltens einzelner DNA Moleküle bei konstanter Kraft charakterisiert. Solche Wechselwirkungen sind für die Kompaktierung des Genoms und die Regulation der Transkription wichtig. Oft wird DNA als gleichmäßig geladener Zylinder modelliert und ihre elektrostatischen Wechselwirkungen im Rahmen der Poisson-Boltzmann-Gleichung mit einem Ladungsanpassungsfaktor berechnet. Trotz erheblicher Anstrengung ist eine präzise Bestimmung dieses Parameters bisher nicht gelungen. Ein theoretisches Modell dieses Prozesses zeigte nun eine erstaunlich kleine effektive DNA Ladung von ~40% der nominalen Ladungsdichte. Abgesehen von Gleichgewichtsprozessen wurde auch die Dynamik eines Faltungsvorgangs von DNA untersucht. Spontane Branch Migration einer homologen Holliday-Struktur wurde genutzt, um die intramolekulare Reibung der DNA zu erforschen. Mittels einer magnetischen Pinzette wurde eine torsionslimitierte Holliday-Struktur gestreckt während die Längenfluktuationen der Zweige mit schneller Videomikroskopie bei ~3 kHz aufgezeichnet wurden. Einzelne diffusive Schritte der Basenpaare sollten auf einer sub-Millisekunden Zeitskala auftreten und viel kleiner als die Gesamtfluktuationen der DNA sein. Eine Analyse der spektralen Leistungsdichte der Längenfluktuationen ermöglicht eine eindeutige Beschreibung der Dynamik der Branch Migration. Die Holliday-Struktur wurde außerdem als nanomechanischer Linearversteller eingesetzt, um einen einzelnen fluoreszierenden Quantenpunkt durch ein exponentiell abfallendes evaneszentes Feld zu bewegen. Durch die Aufzeichnung der Emission des Quantenpunkts sowohl in dem evaneszenten Feld als auch unter gleichmäßiger Beleuchtung kann die Intensitätsverteilung des Anregungsfelds ohne weitere Dekonvolution bestimmt werden. Diese neue Technik ist von besonderem wissenschaftlichen Interesse, weil die Beschreibung dreidimensionaler inhomogener Beleuchtungsfelder eine große Herausforderung in der modernen Mikroskopie darstellt. Die Ergebnisse dieser Arbeit werden dem besseren Verständnis einer Vielzahl biologischer Prozesse, die in Verbindung mit DNA Superspiralisierung stehen, dienen und weitere technische Anwendungen des DNA-basierten Linearverstellers hervorbringen. / The genome inside the cell is continuously subjected to tension and torsion primarily due to a complex interplay with a large variety of proteins. To gain insight into these processes it is crucial to understand the mechanics and dynamics of twisted DNA under tension. Here, this situation is mimicked experimentally by applying force and torque to a single DNA molecule with so called magnetic tweezers and measuring its mechanical response. As a first example a transition from a linear to a plectonemic DNA configuration is studied, i.e. the absorption of part of the applied twist in a superhelical structure. Recent experiments revealed the occurrence of an abrupt extension change at the onset of this transition. Here, it is found that this abrupt DNA shortening strongly depends on the length of the DNA molecule and the ionic strength of the solution. This behavior can be well understood in the framework of a model in which the energy per writhe for the initial plectonemic loop is larger than for subsequent turns of the superhelix. Furthermore DNA-DNA interactions in the presence of monovalent ions were comprehensively characterized by analyzing the supercoiling behavior of single DNA molecules held under constant tension. These interactions are important for genome compaction and transcription regulation. So far DNA is often modeled as a homogeneously charged cylinder and its electrostatic interactions are calculated within the framework of the Poisson-Boltzmann equation including a charge adaptation factor. Despite considerable efforts, until now a rigorous quantitative assessment of this parameter has been lacking. A theoretical model of this process revealed a surprisingly small effective DNA charge of ~40% of the nominal charge density. Besides describing equilibrium processes, also the dynamics during refolding of nucleic acids is investigated. Spontaneous branch migration of a homologous Holliday junction serves as an ideal system where the friction within the biomolecule can be studied. This is realized by stretching a torsionally constrained Holliday junction using magnetic tweezers and recording the length fluctuations of the arms with high-speed videomicroscopy at ~3 kHz. Single base pair diffusive steps are expected to occur on a sub-millisecond time scale and to be much smaller than the overall DNA length fluctuations. Power-spectral-density analysis of the length fluctuations is able to clearly resolve the overall dynamics of the branch migration process. Apart from studying intramolecular friction, the four-arm DNA junction was also used as a nanomechanical translation stage to move a single fluorescent quantum dot through an exponentially decaying evanescent field. Recording the emission of the quantum dot within the evanescent field as well as under homogeneous illumination allows to directly obtain the intensity distribution of the excitation field without additional deconvolution. This new technique is of particular scientific interest because the characterization of three-dimensional inhomogeneous illumination fields is a challenge in modern microscopy. The results presented in this work will help to better understand a large variety of biological processes related to DNA supercoiling and inspire further technical applications of the nanomechanical DNA gear.

Many genetic processes require enzymes or enzyme complexes that interact simultaneously with distant sites along the genome. Such long-range DNA-enzyme interactions are important for example in gene regulation, DNA replication, repair and recombination. In addition many restriction enzymes depend on interactions between two recognition sites and form therefore a model system for studying long-range communications on DNA. Topic of the present work are Type III restriction enzymes. For these enzymes the communication mechanism between their distant target sites has not been resolved and conflicting models including 3D diffusion, 1D translocation and 1D diffusion have been proposed. Also the role of ATP hydrolysis by their superfamily 2 helicase domains which catalyse functions of many enzyme systems is still poorly understood. To cleave DNA, Type III restriction enzymes sense the relative orientation of their distant target sites and cleave DNA only if at least two of them are situated in an inverted repeat. This process strictly depends on ATP hydrolysis. The aim of this PhD thesis was to elucidate this long-range communication. For this a new single molecule assay was developed using a setup combining magnetic tweezers and objective-type total internal reflection fluorescence microscopy. In addition of being able to mechanically manipulate individual DNA molecules, this assay allows to directly visualize the binding and movement of fluorescently labelled enzymes along DNA. Applying this assay to quantum dot labelled Type III restriction enzymes, a 1D diffusion of the enzymes after binding at their target sites could be demonstrated. Furthermore, it was found that the diffusion depends on the nucleotide that is bound to the ATPase domains of these enzymes. This suggested that ATP hydrolysis acts as a switch to license diffusion from the target site which leads to cleavage. In addition to the direct visualization of the enzyme-DNA interaction, the cleavage site selection, the DNA end influence (open or blocked) and the DNA binding kinetics were measured in bulk solution assays (not part of this thesis). The experimental results were compared to Monte Carlo simulations of a diffusion-collision-model which is proposed as long-range communication in this thesis.

Aufgrund einer komplexen Wechselwirkung mit Proteinen ist das Genom in einer Zelle ständig mechanischer Spannung und Torsion ausgesetzt. Daher ist es wichtig die Mechanik und die Dynamik von verdrillter DNA unter Spannung zu verstehen. Diese Situation wurde experimentell mittels einer sog. magnetischen Pinzette nachgestellt, indem sowohl Kraft als auch Drehmoment auf ein einzelnes DNA Molekül ausgeübt und gleichzeitig die mechanische Antwort des Polymers aufgezeichnet wurde. Als erstes Beispiel wurde der Übergang von linearer zu sog. plectonemischer DNA untersucht, d.h. die Absorption eines Teils der induzierten Verdrillung in einer superhelikalen Struktur. Eine abrupte Längenänderung am Anfang dieses Übergangs wurde bereits im Vorfeld publiziert. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass diese abrupte DNA Verkürzung insbesondere von der Länge der DNA und der Ionenkonzentration der Lösung abhängt. Dieses Verhalten kann mittels eines Modells verstanden werden, in dem die Energie pro Verwringung der ersten Schlinge innerhalb der Superhelix größer ist als die aller nachfolgenden. Des Weiteren wurden DNA-DNA Wechselwirkungen in der Umgebung monovalenter Ionen durch die Analyse des Superspiralisierungsverhaltens einzelner DNA Moleküle bei konstanter Kraft charakterisiert. Solche Wechselwirkungen sind für die Kompaktierung des Genoms und die Regulation der Transkription wichtig. Oft wird DNA als gleichmäßig geladener Zylinder modelliert und ihre elektrostatischen Wechselwirkungen im Rahmen der Poisson-Boltzmann-Gleichung mit einem Ladungsanpassungsfaktor berechnet. Trotz erheblicher Anstrengung ist eine präzise Bestimmung dieses Parameters bisher nicht gelungen. Ein theoretisches Modell dieses Prozesses zeigte nun eine erstaunlich kleine effektive DNA Ladung von ~40% der nominalen Ladungsdichte. Abgesehen von Gleichgewichtsprozessen wurde auch die Dynamik eines Faltungsvorgangs von DNA untersucht. Spontane Branch Migration einer homologen Holliday-Struktur wurde genutzt, um die intramolekulare Reibung der DNA zu erforschen. Mittels einer magnetischen Pinzette wurde eine torsionslimitierte Holliday-Struktur gestreckt während die Längenfluktuationen der Zweige mit schneller Videomikroskopie bei ~3 kHz aufgezeichnet wurden. Einzelne diffusive Schritte der Basenpaare sollten auf einer sub-Millisekunden Zeitskala auftreten und viel kleiner als die Gesamtfluktuationen der DNA sein. Eine Analyse der spektralen Leistungsdichte der Längenfluktuationen ermöglicht eine eindeutige Beschreibung der Dynamik der Branch Migration. Die Holliday-Struktur wurde außerdem als nanomechanischer Linearversteller eingesetzt, um einen einzelnen fluoreszierenden Quantenpunkt durch ein exponentiell abfallendes evaneszentes Feld zu bewegen. Durch die Aufzeichnung der Emission des Quantenpunkts sowohl in dem evaneszenten Feld als auch unter gleichmäßiger Beleuchtung kann die Intensitätsverteilung des Anregungsfelds ohne weitere Dekonvolution bestimmt werden. Diese neue Technik ist von besonderem wissenschaftlichen Interesse, weil die Beschreibung dreidimensionaler inhomogener Beleuchtungsfelder eine große Herausforderung in der modernen Mikroskopie darstellt. Die Ergebnisse dieser Arbeit werden dem besseren Verständnis einer Vielzahl biologischer Prozesse, die in Verbindung mit DNA Superspiralisierung stehen, dienen und weitere technische Anwendungen des DNA-basierten Linearverstellers hervorbringen. / The genome inside the cell is continuously subjected to tension and torsion primarily due to a complex interplay with a large variety of proteins. To gain insight into these processes it is crucial to understand the mechanics and dynamics of twisted DNA under tension. Here, this situation is mimicked experimentally by applying force and torque to a single DNA molecule with so called magnetic tweezers and measuring its mechanical response. As a first example a transition from a linear to a plectonemic DNA configuration is studied, i.e. the absorption of part of the applied twist in a superhelical structure. Recent experiments revealed the occurrence of an abrupt extension change at the onset of this transition. Here, it is found that this abrupt DNA shortening strongly depends on the length of the DNA molecule and the ionic strength of the solution. This behavior can be well understood in the framework of a model in which the energy per writhe for the initial plectonemic loop is larger than for subsequent turns of the superhelix. Furthermore DNA-DNA interactions in the presence of monovalent ions were comprehensively characterized by analyzing the supercoiling behavior of single DNA molecules held under constant tension. These interactions are important for genome compaction and transcription regulation. So far DNA is often modeled as a homogeneously charged cylinder and its electrostatic interactions are calculated within the framework of the Poisson-Boltzmann equation including a charge adaptation factor. Despite considerable efforts, until now a rigorous quantitative assessment of this parameter has been lacking. A theoretical model of this process revealed a surprisingly small effective DNA charge of ~40% of the nominal charge density. Besides describing equilibrium processes, also the dynamics during refolding of nucleic acids is investigated. Spontaneous branch migration of a homologous Holliday junction serves as an ideal system where the friction within the biomolecule can be studied. This is realized by stretching a torsionally constrained Holliday junction using magnetic tweezers and recording the length fluctuations of the arms with high-speed videomicroscopy at ~3 kHz. Single base pair diffusive steps are expected to occur on a sub-millisecond time scale and to be much smaller than the overall DNA length fluctuations. Power-spectral-density analysis of the length fluctuations is able to clearly resolve the overall dynamics of the branch migration process. Apart from studying intramolecular friction, the four-arm DNA junction was also used as a nanomechanical translation stage to move a single fluorescent quantum dot through an exponentially decaying evanescent field. Recording the emission of the quantum dot within the evanescent field as well as under homogeneous illumination allows to directly obtain the intensity distribution of the excitation field without additional deconvolution. This new technique is of particular scientific interest because the characterization of three-dimensional inhomogeneous illumination fields is a challenge in modern microscopy. The results presented in this work will help to better understand a large variety of biological processes related to DNA supercoiling and inspire further technical applications of the nanomechanical DNA gear.

Clustered Regularly Interspersed Palindromic Repeats (CRISPR) und ihre zugehörigen (Cas) Proteine sind eine Reihe neuer Werkzeuge, die eine beispiellose Kontrolle über genetisches Material ermöglichen. Die meisten CRISPR-Cas-Systeme verwenden ein kurzes RNA-Molekül, das in ihre Struktur eingebunden ist, um sie zu einer spezifischen, komplementären DNA-Sequenz zu führen. Nach Erkennung der Komplementarität wird die DNA dann gespalten. Aufgrund der einfachen Reprogrammierbarkeit der Guide-RNA und ihrer hohen Spezifität für die Ziel-DNA-Sequenz haben diese Systeme ein enormes Potenzial in Bereichen wie Medizin, Landwirtschaft, Biotechnologie und Krankheitsforschung sowie in anderen Bereichen gezeigt und die Aufmerksamkeit von Wissenschaft und Industrie auf sich gezogen. Das gründliche Verständnis dieser Systeme ist entscheidend für ihre sichere Anwendung, insbesondere wenn man die ethischen Implikationen in Betracht zieht. In dieser Arbeit wurden komplexe Einzelmolekülexperimente unter Verwendung mehrerer hochmoderner Methoden eingesetzt, um einige bisher ungelöste Fragen bezüglich der Target-Suche und -spaltung dieser CRISPR-Cas-Systeme zu beantworten. • Direkte Beobachtung und Quantifizierung der Target-Suche durch den CRISPR-Cas-Überwachungskomplex Cascade Der Typ I-E CRISPR-Cas-Komplex Cascade ist ein Multiprotein-Komplex ohne inhärente Nukleaseaktivität, der doppelsträngige DNA bindet, indem er zuerst eine kurze Sequenz von zwei Nukleotiden namens Protospacer Adjacent Motif (PAM) erkennt und dann eine sogenannte R-Loop-Struktur mit dem benachbarten komplementären DNA-Strang bildet. Während der Prozess der R-Loop-Bildung vielfach untersucht wurde, bleibt der Mechanismus, wie Cascade bei potenziell sehr langen DNA-Sequenzen überhaupt zur richtigen Stelle gelangt unklar. Um Licht in diesen Prozess zu bringen, wurde ein kombiniertes Magnetpinzetten- und Fluoreszenzmikroskopie-Experiment etabliert, das die gleichzeitige Erfassung von DNA-Bindung und R-Loop-Bildung ermöglicht. Diese Experimente zeigten, dass Cascade für die Target-Suche einen Mechanismus namens Facilitated Diffusion verwendet. Dies bedeutet, dass Cascade nach einem dreidimensional Diffusionsprozess an einer zufälligen Stelle an DNA bindet und dann mit einem eindimensionalen Scannen um die Bindungsstelle beginnt. Wenn kein Target gefunden wird, wird der Prozess wiederholt. Bei einer nichterfolgreichen Suche dauert das eindimensionale Scannen etwa 150 ms und erstreckt sich über mehrere hundert potenzielle Targets. Das Verdrehen der DNA und damit das Anlegen von Supercoiling erleichtert oder behindert die R-Schleifen-Bildung, je nach Dreh-Richtung, und beeinflusst damit indirekt die Dauer der Suche. Die Experimente zeigten weiterhin, dass auch die Effizienz der Target-Suche, d.h. die Wahrscheinlichkeit, das richtige Ziel zu finden, sobald das eindimensionale Scannen begonnen hat, stark vom Supercoiling abhängt. Während Wahrscheinlichkeiten von über 40 % für negatives Supercoiling gefunden wurden, d.h. mit erleichterter R-Loop-Bildung, betrug sie in Abwesenheit von Supercoiling nur 5 %. • Entwicklung eines kinetischen Modells für den Such- und Erkennungsprozess für den CRISPR-Cas-Überwachungskomplex Cascade Als nächstes wurde ein kinetisches Modell entwickelt, das die Target-Suche als Random Walk auf DNA beschreibt, während dem sich der Cascade-Komplex von PAM zu PAM bewegt und die benachbarten Stellen auf Komplementarität prüft. Dieses Modell ermöglichte nicht nur Vorhersagen von Suchparametern wie Sucheffizienz und -dauer, sondern ermöglichte auch eine genaue Beschreibung der Erkennungswahrscheinlichkeiten, sobald das richtige PAM gefunden wurde. Es konnte herausgefunden werden, dass die Wahrscheinlichkeit, bei der Begegnung mit dem richtigen Ziel erfolgreich einen R-Loop zu bilden, gering ist, höchstwahrscheinlich um einen zu langen Aufenthalt an nur teilweise komplementären und damit falschen Targets zu verhindern. Das Modell sagt jedoch voraus, dass eine Stelle während eines eindimensionalen Scans bis zu 15 Mal besucht wird, um die geringe Erkennungswahrscheinlichkeit auszugleichen. Es wurde somit gezeigt, dass Target-Suche und -Erkennung in einem ausgefeilten Prozess eng miteinander verbunden sind, der die Zeit an falschen Targets minimiert aber dennoch eine schnelle Erkennung des richtigen Targets ermöglicht. • Untersuchung der Stabilität von CRISPR-Cas9 nach der Spaltung CRISPR-Cas9 ist ein einzelnes Protein, das doppelsträngige DNA in einem durch RNA gesteuerten Prozess ähnlich dem von Cascade anvisiert und bindet. Cas9 hat jedoch eine inhärente Nukleaseaktivität und spaltet die DNA nach der R-Loop-Bildung selbst. Dafür hat es zwei Nuklease-Domänen, die jeweils einen Strang der DNA spalten. Cas9 ist das derzeit am weitesten verbreitete Tool für Anwendungen in der Genomeditierung. Eine Erkenntnis, an dessen Erklärung weiterhin geforscht wird, ist, dass Cas9 auch nach der Spaltung für Stunden an sein DNA-Target gebunden bleibt, was es zu einem de-facto Single-Turnover-Enzym macht. Biologisch gesehen ist dies erstaunlich, da CRISPR-Cas-Systeme in einem engen Wettbewerb gegen ihre viralen Gegner stehen. Aus Anwendungssicht verbirgt und behindert Cas9 durch das lange Binden die zu bearbeitende DNA-Stelle vor den Reparatursystemen der Zellen. Für ein effizientes Gensystem ist es entscheidend, Möglichkeiten zu entwickeln, Cas9 kontrolliert von seinem Ziel zu entfernen. Dafür ist ein detailliertes Verständnis des Verhaltens von Cas9 nach der Reaktion erforderlich. Bisher wurde angenommen, dass Cas9 in eine einzelne, stabile post-Spaltungskonformation eintritt, deren Stabilität, insbesondere unter Einfluss von Torsion und Kraft, wie sie in der Zelle oft auftreten nicht gut untersucht ist. Unter Verwendung eines hochparallelen Magnetpinzetten-Experiments, das die gleichzeitige Beobachtung von bis zu Hunderten von DNA-Molekülen ermöglicht, wurde gezeigt, dass die post-Spaltungsstabilität von Cas9 und seinen mutierten Nickase-Varianten viel komplexer ist: Wenn der Non-Target- Strang (der Strang, der nicht an der R-Loop-Bildung beteiligt ist) gespalten wird, wie es bei Wildtyp-Cas9 und seiner Non-Target-Strang spaltenden Nickase-Variante der Fall ist, wird der gespaltene Non-Target-Strang über eine Drehbewegung um den anderen Strang herum unter Reibung freigesetzt. Auf diese Weise können diese Varianten hohe Torsionsspannungen aushalten und bleiben für Stunden an ihrem Ziel gebunden, was nachfolgende Zellreparaturmechanismen behindert. Für die Nickase-Variante, die nur den Target-Strang spaltet, kann der Non-Target-Strang bei ausreichend hohem Supercoiling-Niveau, wie es zum Beispiel während der Transkription in Zellen häufig vorkommt, nicht freigesetzt werden. Stattdessen kollabiert bei ausreichend hohen Supercoiling-Niveaus der R-Loop und die Cas9-Nickase dissoziiert von der DNA. Für diese Cas9-Variante deckten die Experimente mehrere verschiedene Stabilitätszustände mit Kollapszeiten von einigen Minuten bis hin zu Stunden auf. Diese Ergebnisse legen nahe, dass es nach der Spaltung hohe konformationelle Flexibilität mit komplexen Dynamiken zwischen verschiedenen Stabilitätszuständen gibt.:Table of Contents 1 Introduction 1 1.1 How to fight off viruses: CRISPR and the adaptive immune system of prokaryotes 1 1.2 How to edit the genome: Strategies, applications and obstacles 6 1.3 The needle in the haystack: Search, recognition, and cleavage of specific DNA sequences 11 1.4 The influence of torque on the interaction of CRISPR-Cas systems with DNA 21 1.5 How to model target search and recognition 25 2 Methods 33 2.1 Magnetic Tweezers 33 2.2 Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy 41 2.3 Combined Magnetic Tweezers and TIRF Measurements 44 3 Objectives and Outline 47 4 Dynamic interplay between target search and recognition for a Type I CRISPR-Cas system 49 4.1 Summary 49 4.2 Associated publication 51 4.3 Supplementary Information 66 5 Probing the stability of the SpCas9-DNA complex after cleavage 93 5.1 Summary 93 5.2 Associated publication 95 5.3 Supplementary Information 107 6 Correlated Single-Molecule Magnetic Tweezers and Fluorescence Measurements of DNA-Enzyme Interactions 115 6.1 Summary 115 6.2 Associated publication 116 7 Conclusion and Outlook 147 Bibliography 151 List of Figures 171 Selbstständigkeitserklärung 175 Author Contributions 177 Acknowledgements 179 / Clustered Regularly Interspersed Palindromic Repeats (CRISPR) and their associated (Cas) proteins are new tools that allow unprecedented control over genetic material. Most CRISPR-Cas systems use a short RNA molecule incorporated into their structure to guide them to a specific, complementary sequence of DNA. Upon recognition of the complementarity, the DNA is then cleaved. Given the simple re-programmability of the guide RNA and high specificity for the targeted DNA sequence, these systems have shown immense potential in fields such as medicine, agriculture, biotechnology, and disease research, among others, and have attracted the attention of academia and industry. A thorough understanding of these systems on different scales is paramount to their safe usage, especially considering the ethical implications. In this work, complex single-molecule experiments combining several state-of-the-art methods were employed to shed light on some unresolved questions regarding target search and cleavage of these CRISPR-Cas systems. • Direct observation and quantification of the target search by the CRISPR-Cas surveillance complex Cascade The Type I-E CRISPR-Cas complex Cascade is a multi-protein complex without inherent nuclease activity that targets and binds double-stranded DNA by first detecting a short two-nucleotide long sequence called Protospacer Adjacent Motif (PAM) and then forming a so-called R-loop structure with the adjacent complementary DNA strand. While the process of R-loop formation has been studied extensively, the mechanism of how Cascade gets to the correct site in the first place - on potentially vast DNA sequences - remains unclear. To shed light on this process, a combined magnetic tweezers and fluorescence microscopy assay was established that allowed the simultaneous detection of DNA binding and R-loop formation. These experiments showed that Cascade employs a facilitated diffusion mechanism for target search. After a three-dimensional diffusion process, it randomly binds DNA and proceeds to one-dimensional scanning around the binding site. If no target is found, the process is repeated. If no target can be found, the one-dimensional scanning lasts approximately 150ms and spans several hundred potential targets. Twisting the DNA facilitates or hinders R-loop formation depending on the direction and thereby indirectly affects the duration. The experiments further showed that the efficiency of the target search, i.e., the probability of finding the correct target once a one-dimensional scanning event has started, also depends greatly on the level of supercoiling. While probabilities higher than 40% were found for negative supercoiling levels, i.e., with facilitated R-loop formation, it was as low as 5% in the absence of supercoiling. • Establishment of a kinetic model for the target search and recognition process employed by the CRISPR-Cas surveillance complex Cascade Next, a kinetic model was developed, which described the target search as a random walk on DNA, during which the Cascade complex scans individual PAMs for adjacent targets. This model enabled predictions of target search parameters, such as search efficiency and duration, and also allowed the accurate description of target recognition probabilities once the correct PAM had been found under varying supercoiling levels. We found that upon encountering the correct target, the probability of successfully forming an R-loop is low, preventing stalling at only partially complementary sequences. However, our model predicts that the target site is revisited up to 15 times during one scanning process to compensate for the low recognition probability. It was thus shown that target search and recognition are tightly linked in a delicate process, minimizing time at off-targets while nonetheless enabling fast recognition. • Probing the stability of CRISPR-Cas9 after cleavage CRISPR-Cas9 is a single protein that targets and binds double-stranded DNA in an RNA-guided process similar to Cascade. In contrast to Cascade, Cas9 has inherent nuclease activity and cleaves the DNA upon R-loop formation. More specifically, Cas9 has two nuclease domains that each cleave one strand of the DNA. It is the currently most widely used tool for applications in genome editing. One finding that continues to puzzle researchers is that Cas9 stays bound to its DNA target for durations in the order of hours even after cleavage, making it a de facto single-turnover enzyme. From a biological standpoint, this is puzzling because CRISPR-Cas systems are in a tight arms race against their viral adversaries. From an application viewpoint, Cas9 conceals and obstructs the to-be-edited DNA site from the cells’ repair systems. For an efficient gene editing system, it is crucial to develop ways of removing Cas9 from its target in a controlled manner. For this, a detailed understanding of the post-reaction behavior of Cas9 is required. So far, Cas9 was believed to enter a single, stable post-cleavage conformation, the stability of which was not well understood, especially under the influence of force and twist. Employing a highly parallel magnetic tweezers experiment, allowing the simultaneous observation of up to hundreds of DNA molecules, the post-cleavage stability of Cas9 and its mutated nickase variants was shown to be much more complex: If the non-target strand (the strand not involved in the R-loop) is cleaved, as is the case for wild-type Cas9 and its non-target strand cleaving nickase variant, the cleaved non-target strand is released via a swiveling motion under friction. This way, these variants can release high torsional stress and stay bound to their target for hours, hindering subsequent cell repair machinery. The non-target strand cannot be released upon torsional stress for the nickase variant that only cleaves the target strand. Instead, if the supercoiling levels are high enough, as often applied in cells, for example during transcription, the R-loop collapses, and the Cas9 nickase dissociates from the DNA. We found several different stability states with collapse times of a few minutes up to hours. These results suggest high conformational flexibility after cleavage with complex dynamics between different stability states.:Table of Contents 1 Introduction 1 1.1 How to fight off viruses: CRISPR and the adaptive immune system of prokaryotes 1 1.2 How to edit the genome: Strategies, applications and obstacles 6 1.3 The needle in the haystack: Search, recognition, and cleavage of specific DNA sequences 11 1.4 The influence of torque on the interaction of CRISPR-Cas systems with DNA 21 1.5 How to model target search and recognition 25 2 Methods 33 2.1 Magnetic Tweezers 33 2.2 Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy 41 2.3 Combined Magnetic Tweezers and TIRF Measurements 44 3 Objectives and Outline 47 4 Dynamic interplay between target search and recognition for a Type I CRISPR-Cas system 49 4.1 Summary 49 4.2 Associated publication 51 4.3 Supplementary Information 66 5 Probing the stability of the SpCas9-DNA complex after cleavage 93 5.1 Summary 93 5.2 Associated publication 95 5.3 Supplementary Information 107 6 Correlated Single-Molecule Magnetic Tweezers and Fluorescence Measurements of DNA-Enzyme Interactions 115 6.1 Summary 115 6.2 Associated publication 116 7 Conclusion and Outlook 147 Bibliography 151 List of Figures 171 Selbstständigkeitserklärung 175 Author Contributions 177 Acknowledgements 179

Each organism has to maintain the integrity of its genetic code, which is stored in its DNA. This is achieved by strongly controlled and regulated cellular processes such as DNA replication, -repair and -recombination. An essential element of these processes is the unwinding of the duplex strands of the DNA helix. This biochemical reaction is catalyzed by helicases that use the energy of nucleoside triphophate (NTP) hydrolysis. Although all helicases comprise highly conserved domains in their amino acid sequence, they exhibit large variations regarding for example their structure, their function and their target nucleic acid structures. The main objective of this thesis is to obtain insight into the DNA unwinding mechanisms of three helicases from two different organisms. These helicase vary in their structures and are involved in different pathways of DNA metabolism. In particular the replicative, hexameric helicase Large Tumor-Antigen (T-Antigen) from Simian virus 40 and the DNA repair helicases RecQ2 and RecQ3 from Arabidopsis thaliana are studied. To observe DNA unwinding by these helicases in real-time on the single molecule level, a biophysical technique, called magnetic tweezers, was applied. This technique allows to stretch single DNA molecules attached to magnetic particles. Simultaneously one can measure the DNA end-to-end distance. Special DNA hairpin templates allowed to characterize different parameters of the DNA unwinding reaction such as the unwinding velocity, the length of unwound DNA (processivity) or the influence of forces. From this mechanistic models about the functions of the helicases could be obtained. T-Antigen is found to be one of the slowest and most processive helicases known so far. In contrast to prokaryotic helicases, the unwinding velocity of T-Antigen shows a weak dependence on the applied force. Since current physical models for the unwinding velocity fail to describe the data an alternative model is developed. The investigated RecQ helicases are found to unwind and close short stretches of DNA in a repetitive fashion. This activity is shown for the first time under external forces. The experiments revealed that the repetitive DNA unwinding is based on the ability of both enzymes to switch from one single DNA strand to the other. Although RecQ2 and RecQ3 perform repetitive DNA unwinding, both enzymes differ largely in the measured DNA unwinding properties. Most importantly, while RecQ2 is a classical helicase that unwinds DNA, RecQ3 mostly rewinds DNA duplexes. These different properties may reflect different specific tasks of the helicases during DNA repair processes. To obtain high spatial resolution in DNA unwinding experiments, the experimental methods were optimized. An improved and more stable magnetic tweezers setup with sub-nanometer resolution was built. Additionally, different methods to prepare various DNA templates for helicase experiments were developed. Furthermore, the torsional stability of magnetic particles within an external field was investigated. The results led to selection rules for DNA-microsphere constructs that allow high resolution measurements. / Jeder Organismus ist bestrebt, die genetischen Informationen intakt zu halten, die in seiner DNA gespeichert sind. Dies wird durch präzise gesteuerte zelluläre Prozesse wie DNA-Replikation, -Reparatur und -Rekombination verwirklicht. Ein wesentlicher Schritt ist dabei das Entwinden von DNA-Doppelsträngen zu Einzelsträngen. Diese chemische Reaktion wird von Helikasen durch die Hydrolyse von Nukleosidtriphosphaten katalysiert. Obwohl bei allen Helikasen bestimmte Aminosäuresequenzen hoch konserviert sind, können sie sich in Eigenschaften wie Struktur, Funktion oder DNA Substratspezifität stark unterscheiden. Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist es, die Entwindungsmechanismen von drei verschieden Helikasen aus zwei unterschiedlichen Organismen zu untersuchen, die sich in ihrer Struktur sowie ihrer Funktion unterscheiden. Es handelt sich dabei um die replikative, hexamerische Helikase Large Tumor-Antigen (T-Antigen) vom Simian-Virus 40 und die DNA-Reparatur-Helikasen RecQ2 und RecQ3 der Pflanze Arabidopsis thaliana. Um DNA-Entwindung in Echtzeit zu untersuchen, wird eine biophysikalische Einzelmolekültechnik, die \"Magnetische Pinzette\", verwendet. Mit dieser Technik kann man ein DNA-Molekül, das an ein magnetisches Partikel gebunden ist, strecken und gleichzeitig dessen Gesamtlänge messen. Mit speziellen DNA-Konstrukten kann man so bestimmte Eigenschaften der Helikasen bei der DNA-Entwindung, wie z.B. Geschwindigkeit, Länge der entwundenen DNA (Prozessivität) oder den Einfluß von Kraft, ermitteln. Es wird gezeigt, dass T-Antigen eine der langsamsten und prozessivsten Helikasen ist. Im Gegensatz zu prokaryotischen Helikasen ist die Entwindungsgeschwindigkeit von T-Antigen kaum kraftabhängig. Aktuelle Modelle sagen dieses Verhalten nicht vorraus, weshalb ein alternatives Modell entwickelt wird. Die untersuchten RecQ-Helikasen zeigen ein Entwindungsverhalten bei dem permanent kurze Abschnitte von DNA entwunden und wieder zusammengeführt werden. Dieses Verhalten wird hier zum ersten Mal unter dem Einfluß externer Kräfte gemessen. Es wird gezeigt, dass die permanente Entwindung auf die Fähigkeit beider Helikasen, von einem einzelen DNA-Strang auf den anderen zu wechseln, zurückzuführen ist. Obwohl RecQ2 und RecQ3 beide das Verhalten des permanenten Entwindens aufzeigen, unterscheiden sie sich stark in anderen Eigenschaften. Der gravierendste Unterschied ist, dass RecQ2 wie eine klassische Helikase die DNA entwindet, während RecQ3 eher bestrebt ist, die DNA-Einzelstränge wieder zusammenzuführen. Die unterschiedlichen Eigenschaften könnten die verschieden Aufgaben beider Helikasen während DNA-Reparaturprozessen widerspiegeln. Weiterhin werden die experimentellen Methoden optimiert, um möglichst hohe Auflösungen der Daten zu erreichen. Dazu zählen der Aufbau einer verbesserten und stabileren \"Magnetischen Pinzette\" mit sub-nanometer Auflösung und die Entwicklung neuer Methoden, um DNA Konstrukte herzustellen. Außerdem wird die Torsions\\-steifigkeit von magnetischen Partikeln in externen magnetischen Feldern untersucht. Dabei finden sich Auswahlkriterien für DNA-gebundene magnetische Partikel, durch die eine hohe Auflösung erreicht wird.

Each organism has to maintain the integrity of its genetic code, which is stored in its DNA. This is achieved by strongly controlled and regulated cellular processes such as DNA replication, -repair and -recombination. An essential element of these processes is the unwinding of the duplex strands of the DNA helix. This biochemical reaction is catalyzed by helicases that use the energy of nucleoside triphophate (NTP) hydrolysis. Although all helicases comprise highly conserved domains in their amino acid sequence, they exhibit large variations regarding for example their structure, their function and their target nucleic acid structures. The main objective of this thesis is to obtain insight into the DNA unwinding mechanisms of three helicases from two different organisms. These helicase vary in their structures and are involved in different pathways of DNA metabolism. In particular the replicative, hexameric helicase Large Tumor-Antigen (T-Antigen) from Simian virus 40 and the DNA repair helicases RecQ2 and RecQ3 from Arabidopsis thaliana are studied. To observe DNA unwinding by these helicases in real-time on the single molecule level, a biophysical technique, called magnetic tweezers, was applied. This technique allows to stretch single DNA molecules attached to magnetic particles. Simultaneously one can measure the DNA end-to-end distance. Special DNA hairpin templates allowed to characterize different parameters of the DNA unwinding reaction such as the unwinding velocity, the length of unwound DNA (processivity) or the influence of forces. From this mechanistic models about the functions of the helicases could be obtained. T-Antigen is found to be one of the slowest and most processive helicases known so far. In contrast to prokaryotic helicases, the unwinding velocity of T-Antigen shows a weak dependence on the applied force. Since current physical models for the unwinding velocity fail to describe the data an alternative model is developed. The investigated RecQ helicases are found to unwind and close short stretches of DNA in a repetitive fashion. This activity is shown for the first time under external forces. The experiments revealed that the repetitive DNA unwinding is based on the ability of both enzymes to switch from one single DNA strand to the other. Although RecQ2 and RecQ3 perform repetitive DNA unwinding, both enzymes differ largely in the measured DNA unwinding properties. Most importantly, while RecQ2 is a classical helicase that unwinds DNA, RecQ3 mostly rewinds DNA duplexes. These different properties may reflect different specific tasks of the helicases during DNA repair processes. To obtain high spatial resolution in DNA unwinding experiments, the experimental methods were optimized. An improved and more stable magnetic tweezers setup with sub-nanometer resolution was built. Additionally, different methods to prepare various DNA templates for helicase experiments were developed. Furthermore, the torsional stability of magnetic particles within an external field was investigated. The results led to selection rules for DNA-microsphere constructs that allow high resolution measurements. / Jeder Organismus ist bestrebt, die genetischen Informationen intakt zu halten, die in seiner DNA gespeichert sind. Dies wird durch präzise gesteuerte zelluläre Prozesse wie DNA-Replikation, -Reparatur und -Rekombination verwirklicht. Ein wesentlicher Schritt ist dabei das Entwinden von DNA-Doppelsträngen zu Einzelsträngen. Diese chemische Reaktion wird von Helikasen durch die Hydrolyse von Nukleosidtriphosphaten katalysiert. Obwohl bei allen Helikasen bestimmte Aminosäuresequenzen hoch konserviert sind, können sie sich in Eigenschaften wie Struktur, Funktion oder DNA Substratspezifität stark unterscheiden. Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist es, die Entwindungsmechanismen von drei verschieden Helikasen aus zwei unterschiedlichen Organismen zu untersuchen, die sich in ihrer Struktur sowie ihrer Funktion unterscheiden. Es handelt sich dabei um die replikative, hexamerische Helikase Large Tumor-Antigen (T-Antigen) vom Simian-Virus 40 und die DNA-Reparatur-Helikasen RecQ2 und RecQ3 der Pflanze Arabidopsis thaliana. Um DNA-Entwindung in Echtzeit zu untersuchen, wird eine biophysikalische Einzelmolekültechnik, die \"Magnetische Pinzette\", verwendet. Mit dieser Technik kann man ein DNA-Molekül, das an ein magnetisches Partikel gebunden ist, strecken und gleichzeitig dessen Gesamtlänge messen. Mit speziellen DNA-Konstrukten kann man so bestimmte Eigenschaften der Helikasen bei der DNA-Entwindung, wie z.B. Geschwindigkeit, Länge der entwundenen DNA (Prozessivität) oder den Einfluß von Kraft, ermitteln. Es wird gezeigt, dass T-Antigen eine der langsamsten und prozessivsten Helikasen ist. Im Gegensatz zu prokaryotischen Helikasen ist die Entwindungsgeschwindigkeit von T-Antigen kaum kraftabhängig. Aktuelle Modelle sagen dieses Verhalten nicht vorraus, weshalb ein alternatives Modell entwickelt wird. Die untersuchten RecQ-Helikasen zeigen ein Entwindungsverhalten bei dem permanent kurze Abschnitte von DNA entwunden und wieder zusammengeführt werden. Dieses Verhalten wird hier zum ersten Mal unter dem Einfluß externer Kräfte gemessen. Es wird gezeigt, dass die permanente Entwindung auf die Fähigkeit beider Helikasen, von einem einzelen DNA-Strang auf den anderen zu wechseln, zurückzuführen ist. Obwohl RecQ2 und RecQ3 beide das Verhalten des permanenten Entwindens aufzeigen, unterscheiden sie sich stark in anderen Eigenschaften. Der gravierendste Unterschied ist, dass RecQ2 wie eine klassische Helikase die DNA entwindet, während RecQ3 eher bestrebt ist, die DNA-Einzelstränge wieder zusammenzuführen. Die unterschiedlichen Eigenschaften könnten die verschieden Aufgaben beider Helikasen während DNA-Reparaturprozessen widerspiegeln. Weiterhin werden die experimentellen Methoden optimiert, um möglichst hohe Auflösungen der Daten zu erreichen. Dazu zählen der Aufbau einer verbesserten und stabileren \"Magnetischen Pinzette\" mit sub-nanometer Auflösung und die Entwicklung neuer Methoden, um DNA Konstrukte herzustellen. Außerdem wird die Torsions\\-steifigkeit von magnetischen Partikeln in externen magnetischen Feldern untersucht. Dabei finden sich Auswahlkriterien für DNA-gebundene magnetische Partikel, durch die eine hohe Auflösung erreicht wird.