Many genetic processes require enzymes or enzyme complexes that interact simultaneously with distant sites along the genome. Such long-range DNA-enzyme interactions are important for example in gene regulation, DNA replication, repair and recombination. In addition many restriction enzymes depend on interactions between two recognition sites and form therefore a model system for studying long-range communications on DNA. Topic of the present work are Type III restriction enzymes. For these enzymes the communication mechanism between their distant target sites has not been resolved and conflicting models including 3D diffusion, 1D translocation and 1D diffusion have been proposed. Also the role of ATP hydrolysis by their superfamily 2 helicase domains which catalyse functions of many enzyme systems is still poorly understood. To cleave DNA, Type III restriction enzymes sense the relative orientation of their distant target sites and cleave DNA only if at least two of them are situated in an inverted repeat. This process strictly depends on ATP hydrolysis. The aim of this PhD thesis was to elucidate this long-range communication. For this a new single molecule assay was developed using a setup combining magnetic tweezers and objective-type total internal reflection fluorescence microscopy. In addition of being able to mechanically manipulate individual DNA molecules, this assay allows to directly visualize the binding and movement of fluorescently labelled enzymes along DNA. Applying this assay to quantum dot labelled Type III restriction enzymes, a 1D diffusion of the enzymes after binding at their target sites could be demonstrated. Furthermore, it was found that the diffusion depends on the nucleotide that is bound to the ATPase domains of these enzymes. This suggested that ATP hydrolysis acts as a switch to license diffusion from the target site which leads to cleavage. In addition to the direct visualization of the enzyme-DNA interaction, the cleavage site selection, the DNA end influence (open or blocked) and the DNA binding kinetics were measured in bulk solution assays (not part of this thesis). The experimental results were compared to Monte Carlo simulations of a diffusion-collision-model which is proposed as long-range communication in this thesis.

Aufgrund einer komplexen Wechselwirkung mit Proteinen ist das Genom in einer Zelle ständig mechanischer Spannung und Torsion ausgesetzt. Daher ist es wichtig die Mechanik und die Dynamik von verdrillter DNA unter Spannung zu verstehen. Diese Situation wurde experimentell mittels einer sog. magnetischen Pinzette nachgestellt, indem sowohl Kraft als auch Drehmoment auf ein einzelnes DNA Molekül ausgeübt und gleichzeitig die mechanische Antwort des Polymers aufgezeichnet wurde. Als erstes Beispiel wurde der Übergang von linearer zu sog. plectonemischer DNA untersucht, d.h. die Absorption eines Teils der induzierten Verdrillung in einer superhelikalen Struktur. Eine abrupte Längenänderung am Anfang dieses Übergangs wurde bereits im Vorfeld publiziert. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass diese abrupte DNA Verkürzung insbesondere von der Länge der DNA und der Ionenkonzentration der Lösung abhängt. Dieses Verhalten kann mittels eines Modells verstanden werden, in dem die Energie pro Verwringung der ersten Schlinge innerhalb der Superhelix größer ist als die aller nachfolgenden. Des Weiteren wurden DNA-DNA Wechselwirkungen in der Umgebung monovalenter Ionen durch die Analyse des Superspiralisierungsverhaltens einzelner DNA Moleküle bei konstanter Kraft charakterisiert. Solche Wechselwirkungen sind für die Kompaktierung des Genoms und die Regulation der Transkription wichtig. Oft wird DNA als gleichmäßig geladener Zylinder modelliert und ihre elektrostatischen Wechselwirkungen im Rahmen der Poisson-Boltzmann-Gleichung mit einem Ladungsanpassungsfaktor berechnet. Trotz erheblicher Anstrengung ist eine präzise Bestimmung dieses Parameters bisher nicht gelungen. Ein theoretisches Modell dieses Prozesses zeigte nun eine erstaunlich kleine effektive DNA Ladung von ~40% der nominalen Ladungsdichte. Abgesehen von Gleichgewichtsprozessen wurde auch die Dynamik eines Faltungsvorgangs von DNA untersucht. Spontane Branch Migration einer homologen Holliday-Struktur wurde genutzt, um die intramolekulare Reibung der DNA zu erforschen. Mittels einer magnetischen Pinzette wurde eine torsionslimitierte Holliday-Struktur gestreckt während die Längenfluktuationen der Zweige mit schneller Videomikroskopie bei ~3 kHz aufgezeichnet wurden. Einzelne diffusive Schritte der Basenpaare sollten auf einer sub-Millisekunden Zeitskala auftreten und viel kleiner als die Gesamtfluktuationen der DNA sein. Eine Analyse der spektralen Leistungsdichte der Längenfluktuationen ermöglicht eine eindeutige Beschreibung der Dynamik der Branch Migration. Die Holliday-Struktur wurde außerdem als nanomechanischer Linearversteller eingesetzt, um einen einzelnen fluoreszierenden Quantenpunkt durch ein exponentiell abfallendes evaneszentes Feld zu bewegen. Durch die Aufzeichnung der Emission des Quantenpunkts sowohl in dem evaneszenten Feld als auch unter gleichmäßiger Beleuchtung kann die Intensitätsverteilung des Anregungsfelds ohne weitere Dekonvolution bestimmt werden. Diese neue Technik ist von besonderem wissenschaftlichen Interesse, weil die Beschreibung dreidimensionaler inhomogener Beleuchtungsfelder eine große Herausforderung in der modernen Mikroskopie darstellt. Die Ergebnisse dieser Arbeit werden dem besseren Verständnis einer Vielzahl biologischer Prozesse, die in Verbindung mit DNA Superspiralisierung stehen, dienen und weitere technische Anwendungen des DNA-basierten Linearverstellers hervorbringen. / The genome inside the cell is continuously subjected to tension and torsion primarily due to a complex interplay with a large variety of proteins. To gain insight into these processes it is crucial to understand the mechanics and dynamics of twisted DNA under tension. Here, this situation is mimicked experimentally by applying force and torque to a single DNA molecule with so called magnetic tweezers and measuring its mechanical response. As a first example a transition from a linear to a plectonemic DNA configuration is studied, i.e. the absorption of part of the applied twist in a superhelical structure. Recent experiments revealed the occurrence of an abrupt extension change at the onset of this transition. Here, it is found that this abrupt DNA shortening strongly depends on the length of the DNA molecule and the ionic strength of the solution. This behavior can be well understood in the framework of a model in which the energy per writhe for the initial plectonemic loop is larger than for subsequent turns of the superhelix. Furthermore DNA-DNA interactions in the presence of monovalent ions were comprehensively characterized by analyzing the supercoiling behavior of single DNA molecules held under constant tension. These interactions are important for genome compaction and transcription regulation. So far DNA is often modeled as a homogeneously charged cylinder and its electrostatic interactions are calculated within the framework of the Poisson-Boltzmann equation including a charge adaptation factor. Despite considerable efforts, until now a rigorous quantitative assessment of this parameter has been lacking. A theoretical model of this process revealed a surprisingly small effective DNA charge of ~40% of the nominal charge density. Besides describing equilibrium processes, also the dynamics during refolding of nucleic acids is investigated. Spontaneous branch migration of a homologous Holliday junction serves as an ideal system where the friction within the biomolecule can be studied. This is realized by stretching a torsionally constrained Holliday junction using magnetic tweezers and recording the length fluctuations of the arms with high-speed videomicroscopy at ~3 kHz. Single base pair diffusive steps are expected to occur on a sub-millisecond time scale and to be much smaller than the overall DNA length fluctuations. Power-spectral-density analysis of the length fluctuations is able to clearly resolve the overall dynamics of the branch migration process. Apart from studying intramolecular friction, the four-arm DNA junction was also used as a nanomechanical translation stage to move a single fluorescent quantum dot through an exponentially decaying evanescent field. Recording the emission of the quantum dot within the evanescent field as well as under homogeneous illumination allows to directly obtain the intensity distribution of the excitation field without additional deconvolution. This new technique is of particular scientific interest because the characterization of three-dimensional inhomogeneous illumination fields is a challenge in modern microscopy. The results presented in this work will help to better understand a large variety of biological processes related to DNA supercoiling and inspire further technical applications of the nanomechanical DNA gear.

Many genetic processes require enzymes or enzyme complexes that interact simultaneously with distant sites along the genome. Such long-range DNA-enzyme interactions are important for example in gene regulation, DNA replication, repair and recombination. In addition many restriction enzymes depend on interactions between two recognition sites and form therefore a model system for studying long-range communications on DNA. Topic of the present work are Type III restriction enzymes. For these enzymes the communication mechanism between their distant target sites has not been resolved and conflicting models including 3D diffusion, 1D translocation and 1D diffusion have been proposed. Also the role of ATP hydrolysis by their superfamily 2 helicase domains which catalyse functions of many enzyme systems is still poorly understood. To cleave DNA, Type III restriction enzymes sense the relative orientation of their distant target sites and cleave DNA only if at least two of them are situated in an inverted repeat. This process strictly depends on ATP hydrolysis. The aim of this PhD thesis was to elucidate this long-range communication. For this a new single molecule assay was developed using a setup combining magnetic tweezers and objective-type total internal reflection fluorescence microscopy. In addition of being able to mechanically manipulate individual DNA molecules, this assay allows to directly visualize the binding and movement of fluorescently labelled enzymes along DNA. Applying this assay to quantum dot labelled Type III restriction enzymes, a 1D diffusion of the enzymes after binding at their target sites could be demonstrated. Furthermore, it was found that the diffusion depends on the nucleotide that is bound to the ATPase domains of these enzymes. This suggested that ATP hydrolysis acts as a switch to license diffusion from the target site which leads to cleavage. In addition to the direct visualization of the enzyme-DNA interaction, the cleavage site selection, the DNA end influence (open or blocked) and the DNA binding kinetics were measured in bulk solution assays (not part of this thesis). The experimental results were compared to Monte Carlo simulations of a diffusion-collision-model which is proposed as long-range communication in this thesis.

Aufgrund einer komplexen Wechselwirkung mit Proteinen ist das Genom in einer Zelle ständig mechanischer Spannung und Torsion ausgesetzt. Daher ist es wichtig die Mechanik und die Dynamik von verdrillter DNA unter Spannung zu verstehen. Diese Situation wurde experimentell mittels einer sog. magnetischen Pinzette nachgestellt, indem sowohl Kraft als auch Drehmoment auf ein einzelnes DNA Molekül ausgeübt und gleichzeitig die mechanische Antwort des Polymers aufgezeichnet wurde. Als erstes Beispiel wurde der Übergang von linearer zu sog. plectonemischer DNA untersucht, d.h. die Absorption eines Teils der induzierten Verdrillung in einer superhelikalen Struktur. Eine abrupte Längenänderung am Anfang dieses Übergangs wurde bereits im Vorfeld publiziert. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass diese abrupte DNA Verkürzung insbesondere von der Länge der DNA und der Ionenkonzentration der Lösung abhängt. Dieses Verhalten kann mittels eines Modells verstanden werden, in dem die Energie pro Verwringung der ersten Schlinge innerhalb der Superhelix größer ist als die aller nachfolgenden. Des Weiteren wurden DNA-DNA Wechselwirkungen in der Umgebung monovalenter Ionen durch die Analyse des Superspiralisierungsverhaltens einzelner DNA Moleküle bei konstanter Kraft charakterisiert. Solche Wechselwirkungen sind für die Kompaktierung des Genoms und die Regulation der Transkription wichtig. Oft wird DNA als gleichmäßig geladener Zylinder modelliert und ihre elektrostatischen Wechselwirkungen im Rahmen der Poisson-Boltzmann-Gleichung mit einem Ladungsanpassungsfaktor berechnet. Trotz erheblicher Anstrengung ist eine präzise Bestimmung dieses Parameters bisher nicht gelungen. Ein theoretisches Modell dieses Prozesses zeigte nun eine erstaunlich kleine effektive DNA Ladung von ~40% der nominalen Ladungsdichte. Abgesehen von Gleichgewichtsprozessen wurde auch die Dynamik eines Faltungsvorgangs von DNA untersucht. Spontane Branch Migration einer homologen Holliday-Struktur wurde genutzt, um die intramolekulare Reibung der DNA zu erforschen. Mittels einer magnetischen Pinzette wurde eine torsionslimitierte Holliday-Struktur gestreckt während die Längenfluktuationen der Zweige mit schneller Videomikroskopie bei ~3 kHz aufgezeichnet wurden. Einzelne diffusive Schritte der Basenpaare sollten auf einer sub-Millisekunden Zeitskala auftreten und viel kleiner als die Gesamtfluktuationen der DNA sein. Eine Analyse der spektralen Leistungsdichte der Längenfluktuationen ermöglicht eine eindeutige Beschreibung der Dynamik der Branch Migration. Die Holliday-Struktur wurde außerdem als nanomechanischer Linearversteller eingesetzt, um einen einzelnen fluoreszierenden Quantenpunkt durch ein exponentiell abfallendes evaneszentes Feld zu bewegen. Durch die Aufzeichnung der Emission des Quantenpunkts sowohl in dem evaneszenten Feld als auch unter gleichmäßiger Beleuchtung kann die Intensitätsverteilung des Anregungsfelds ohne weitere Dekonvolution bestimmt werden. Diese neue Technik ist von besonderem wissenschaftlichen Interesse, weil die Beschreibung dreidimensionaler inhomogener Beleuchtungsfelder eine große Herausforderung in der modernen Mikroskopie darstellt. Die Ergebnisse dieser Arbeit werden dem besseren Verständnis einer Vielzahl biologischer Prozesse, die in Verbindung mit DNA Superspiralisierung stehen, dienen und weitere technische Anwendungen des DNA-basierten Linearverstellers hervorbringen. / The genome inside the cell is continuously subjected to tension and torsion primarily due to a complex interplay with a large variety of proteins. To gain insight into these processes it is crucial to understand the mechanics and dynamics of twisted DNA under tension. Here, this situation is mimicked experimentally by applying force and torque to a single DNA molecule with so called magnetic tweezers and measuring its mechanical response. As a first example a transition from a linear to a plectonemic DNA configuration is studied, i.e. the absorption of part of the applied twist in a superhelical structure. Recent experiments revealed the occurrence of an abrupt extension change at the onset of this transition. Here, it is found that this abrupt DNA shortening strongly depends on the length of the DNA molecule and the ionic strength of the solution. This behavior can be well understood in the framework of a model in which the energy per writhe for the initial plectonemic loop is larger than for subsequent turns of the superhelix. Furthermore DNA-DNA interactions in the presence of monovalent ions were comprehensively characterized by analyzing the supercoiling behavior of single DNA molecules held under constant tension. These interactions are important for genome compaction and transcription regulation. So far DNA is often modeled as a homogeneously charged cylinder and its electrostatic interactions are calculated within the framework of the Poisson-Boltzmann equation including a charge adaptation factor. Despite considerable efforts, until now a rigorous quantitative assessment of this parameter has been lacking. A theoretical model of this process revealed a surprisingly small effective DNA charge of ~40% of the nominal charge density. Besides describing equilibrium processes, also the dynamics during refolding of nucleic acids is investigated. Spontaneous branch migration of a homologous Holliday junction serves as an ideal system where the friction within the biomolecule can be studied. This is realized by stretching a torsionally constrained Holliday junction using magnetic tweezers and recording the length fluctuations of the arms with high-speed videomicroscopy at ~3 kHz. Single base pair diffusive steps are expected to occur on a sub-millisecond time scale and to be much smaller than the overall DNA length fluctuations. Power-spectral-density analysis of the length fluctuations is able to clearly resolve the overall dynamics of the branch migration process. Apart from studying intramolecular friction, the four-arm DNA junction was also used as a nanomechanical translation stage to move a single fluorescent quantum dot through an exponentially decaying evanescent field. Recording the emission of the quantum dot within the evanescent field as well as under homogeneous illumination allows to directly obtain the intensity distribution of the excitation field without additional deconvolution. This new technique is of particular scientific interest because the characterization of three-dimensional inhomogeneous illumination fields is a challenge in modern microscopy. The results presented in this work will help to better understand a large variety of biological processes related to DNA supercoiling and inspire further technical applications of the nanomechanical DNA gear.

Each organism has to maintain the integrity of its genetic code, which is stored in its DNA. This is achieved by strongly controlled and regulated cellular processes such as DNA replication, -repair and -recombination. An essential element of these processes is the unwinding of the duplex strands of the DNA helix. This biochemical reaction is catalyzed by helicases that use the energy of nucleoside triphophate (NTP) hydrolysis. Although all helicases comprise highly conserved domains in their amino acid sequence, they exhibit large variations regarding for example their structure, their function and their target nucleic acid structures. The main objective of this thesis is to obtain insight into the DNA unwinding mechanisms of three helicases from two different organisms. These helicase vary in their structures and are involved in different pathways of DNA metabolism. In particular the replicative, hexameric helicase Large Tumor-Antigen (T-Antigen) from Simian virus 40 and the DNA repair helicases RecQ2 and RecQ3 from Arabidopsis thaliana are studied. To observe DNA unwinding by these helicases in real-time on the single molecule level, a biophysical technique, called magnetic tweezers, was applied. This technique allows to stretch single DNA molecules attached to magnetic particles. Simultaneously one can measure the DNA end-to-end distance. Special DNA hairpin templates allowed to characterize different parameters of the DNA unwinding reaction such as the unwinding velocity, the length of unwound DNA (processivity) or the influence of forces. From this mechanistic models about the functions of the helicases could be obtained. T-Antigen is found to be one of the slowest and most processive helicases known so far. In contrast to prokaryotic helicases, the unwinding velocity of T-Antigen shows a weak dependence on the applied force. Since current physical models for the unwinding velocity fail to describe the data an alternative model is developed. The investigated RecQ helicases are found to unwind and close short stretches of DNA in a repetitive fashion. This activity is shown for the first time under external forces. The experiments revealed that the repetitive DNA unwinding is based on the ability of both enzymes to switch from one single DNA strand to the other. Although RecQ2 and RecQ3 perform repetitive DNA unwinding, both enzymes differ largely in the measured DNA unwinding properties. Most importantly, while RecQ2 is a classical helicase that unwinds DNA, RecQ3 mostly rewinds DNA duplexes. These different properties may reflect different specific tasks of the helicases during DNA repair processes. To obtain high spatial resolution in DNA unwinding experiments, the experimental methods were optimized. An improved and more stable magnetic tweezers setup with sub-nanometer resolution was built. Additionally, different methods to prepare various DNA templates for helicase experiments were developed. Furthermore, the torsional stability of magnetic particles within an external field was investigated. The results led to selection rules for DNA-microsphere constructs that allow high resolution measurements. / Jeder Organismus ist bestrebt, die genetischen Informationen intakt zu halten, die in seiner DNA gespeichert sind. Dies wird durch präzise gesteuerte zelluläre Prozesse wie DNA-Replikation, -Reparatur und -Rekombination verwirklicht. Ein wesentlicher Schritt ist dabei das Entwinden von DNA-Doppelsträngen zu Einzelsträngen. Diese chemische Reaktion wird von Helikasen durch die Hydrolyse von Nukleosidtriphosphaten katalysiert. Obwohl bei allen Helikasen bestimmte Aminosäuresequenzen hoch konserviert sind, können sie sich in Eigenschaften wie Struktur, Funktion oder DNA Substratspezifität stark unterscheiden. Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist es, die Entwindungsmechanismen von drei verschieden Helikasen aus zwei unterschiedlichen Organismen zu untersuchen, die sich in ihrer Struktur sowie ihrer Funktion unterscheiden. Es handelt sich dabei um die replikative, hexamerische Helikase Large Tumor-Antigen (T-Antigen) vom Simian-Virus 40 und die DNA-Reparatur-Helikasen RecQ2 und RecQ3 der Pflanze Arabidopsis thaliana. Um DNA-Entwindung in Echtzeit zu untersuchen, wird eine biophysikalische Einzelmolekültechnik, die \"Magnetische Pinzette\", verwendet. Mit dieser Technik kann man ein DNA-Molekül, das an ein magnetisches Partikel gebunden ist, strecken und gleichzeitig dessen Gesamtlänge messen. Mit speziellen DNA-Konstrukten kann man so bestimmte Eigenschaften der Helikasen bei der DNA-Entwindung, wie z.B. Geschwindigkeit, Länge der entwundenen DNA (Prozessivität) oder den Einfluß von Kraft, ermitteln. Es wird gezeigt, dass T-Antigen eine der langsamsten und prozessivsten Helikasen ist. Im Gegensatz zu prokaryotischen Helikasen ist die Entwindungsgeschwindigkeit von T-Antigen kaum kraftabhängig. Aktuelle Modelle sagen dieses Verhalten nicht vorraus, weshalb ein alternatives Modell entwickelt wird. Die untersuchten RecQ-Helikasen zeigen ein Entwindungsverhalten bei dem permanent kurze Abschnitte von DNA entwunden und wieder zusammengeführt werden. Dieses Verhalten wird hier zum ersten Mal unter dem Einfluß externer Kräfte gemessen. Es wird gezeigt, dass die permanente Entwindung auf die Fähigkeit beider Helikasen, von einem einzelen DNA-Strang auf den anderen zu wechseln, zurückzuführen ist. Obwohl RecQ2 und RecQ3 beide das Verhalten des permanenten Entwindens aufzeigen, unterscheiden sie sich stark in anderen Eigenschaften. Der gravierendste Unterschied ist, dass RecQ2 wie eine klassische Helikase die DNA entwindet, während RecQ3 eher bestrebt ist, die DNA-Einzelstränge wieder zusammenzuführen. Die unterschiedlichen Eigenschaften könnten die verschieden Aufgaben beider Helikasen während DNA-Reparaturprozessen widerspiegeln. Weiterhin werden die experimentellen Methoden optimiert, um möglichst hohe Auflösungen der Daten zu erreichen. Dazu zählen der Aufbau einer verbesserten und stabileren \"Magnetischen Pinzette\" mit sub-nanometer Auflösung und die Entwicklung neuer Methoden, um DNA Konstrukte herzustellen. Außerdem wird die Torsions\\-steifigkeit von magnetischen Partikeln in externen magnetischen Feldern untersucht. Dabei finden sich Auswahlkriterien für DNA-gebundene magnetische Partikel, durch die eine hohe Auflösung erreicht wird.

Each organism has to maintain the integrity of its genetic code, which is stored in its DNA. This is achieved by strongly controlled and regulated cellular processes such as DNA replication, -repair and -recombination. An essential element of these processes is the unwinding of the duplex strands of the DNA helix. This biochemical reaction is catalyzed by helicases that use the energy of nucleoside triphophate (NTP) hydrolysis. Although all helicases comprise highly conserved domains in their amino acid sequence, they exhibit large variations regarding for example their structure, their function and their target nucleic acid structures. The main objective of this thesis is to obtain insight into the DNA unwinding mechanisms of three helicases from two different organisms. These helicase vary in their structures and are involved in different pathways of DNA metabolism. In particular the replicative, hexameric helicase Large Tumor-Antigen (T-Antigen) from Simian virus 40 and the DNA repair helicases RecQ2 and RecQ3 from Arabidopsis thaliana are studied. To observe DNA unwinding by these helicases in real-time on the single molecule level, a biophysical technique, called magnetic tweezers, was applied. This technique allows to stretch single DNA molecules attached to magnetic particles. Simultaneously one can measure the DNA end-to-end distance. Special DNA hairpin templates allowed to characterize different parameters of the DNA unwinding reaction such as the unwinding velocity, the length of unwound DNA (processivity) or the influence of forces. From this mechanistic models about the functions of the helicases could be obtained. T-Antigen is found to be one of the slowest and most processive helicases known so far. In contrast to prokaryotic helicases, the unwinding velocity of T-Antigen shows a weak dependence on the applied force. Since current physical models for the unwinding velocity fail to describe the data an alternative model is developed. The investigated RecQ helicases are found to unwind and close short stretches of DNA in a repetitive fashion. This activity is shown for the first time under external forces. The experiments revealed that the repetitive DNA unwinding is based on the ability of both enzymes to switch from one single DNA strand to the other. Although RecQ2 and RecQ3 perform repetitive DNA unwinding, both enzymes differ largely in the measured DNA unwinding properties. Most importantly, while RecQ2 is a classical helicase that unwinds DNA, RecQ3 mostly rewinds DNA duplexes. These different properties may reflect different specific tasks of the helicases during DNA repair processes. To obtain high spatial resolution in DNA unwinding experiments, the experimental methods were optimized. An improved and more stable magnetic tweezers setup with sub-nanometer resolution was built. Additionally, different methods to prepare various DNA templates for helicase experiments were developed. Furthermore, the torsional stability of magnetic particles within an external field was investigated. The results led to selection rules for DNA-microsphere constructs that allow high resolution measurements. / Jeder Organismus ist bestrebt, die genetischen Informationen intakt zu halten, die in seiner DNA gespeichert sind. Dies wird durch präzise gesteuerte zelluläre Prozesse wie DNA-Replikation, -Reparatur und -Rekombination verwirklicht. Ein wesentlicher Schritt ist dabei das Entwinden von DNA-Doppelsträngen zu Einzelsträngen. Diese chemische Reaktion wird von Helikasen durch die Hydrolyse von Nukleosidtriphosphaten katalysiert. Obwohl bei allen Helikasen bestimmte Aminosäuresequenzen hoch konserviert sind, können sie sich in Eigenschaften wie Struktur, Funktion oder DNA Substratspezifität stark unterscheiden. Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist es, die Entwindungsmechanismen von drei verschieden Helikasen aus zwei unterschiedlichen Organismen zu untersuchen, die sich in ihrer Struktur sowie ihrer Funktion unterscheiden. Es handelt sich dabei um die replikative, hexamerische Helikase Large Tumor-Antigen (T-Antigen) vom Simian-Virus 40 und die DNA-Reparatur-Helikasen RecQ2 und RecQ3 der Pflanze Arabidopsis thaliana. Um DNA-Entwindung in Echtzeit zu untersuchen, wird eine biophysikalische Einzelmolekültechnik, die \"Magnetische Pinzette\", verwendet. Mit dieser Technik kann man ein DNA-Molekül, das an ein magnetisches Partikel gebunden ist, strecken und gleichzeitig dessen Gesamtlänge messen. Mit speziellen DNA-Konstrukten kann man so bestimmte Eigenschaften der Helikasen bei der DNA-Entwindung, wie z.B. Geschwindigkeit, Länge der entwundenen DNA (Prozessivität) oder den Einfluß von Kraft, ermitteln. Es wird gezeigt, dass T-Antigen eine der langsamsten und prozessivsten Helikasen ist. Im Gegensatz zu prokaryotischen Helikasen ist die Entwindungsgeschwindigkeit von T-Antigen kaum kraftabhängig. Aktuelle Modelle sagen dieses Verhalten nicht vorraus, weshalb ein alternatives Modell entwickelt wird. Die untersuchten RecQ-Helikasen zeigen ein Entwindungsverhalten bei dem permanent kurze Abschnitte von DNA entwunden und wieder zusammengeführt werden. Dieses Verhalten wird hier zum ersten Mal unter dem Einfluß externer Kräfte gemessen. Es wird gezeigt, dass die permanente Entwindung auf die Fähigkeit beider Helikasen, von einem einzelen DNA-Strang auf den anderen zu wechseln, zurückzuführen ist. Obwohl RecQ2 und RecQ3 beide das Verhalten des permanenten Entwindens aufzeigen, unterscheiden sie sich stark in anderen Eigenschaften. Der gravierendste Unterschied ist, dass RecQ2 wie eine klassische Helikase die DNA entwindet, während RecQ3 eher bestrebt ist, die DNA-Einzelstränge wieder zusammenzuführen. Die unterschiedlichen Eigenschaften könnten die verschieden Aufgaben beider Helikasen während DNA-Reparaturprozessen widerspiegeln. Weiterhin werden die experimentellen Methoden optimiert, um möglichst hohe Auflösungen der Daten zu erreichen. Dazu zählen der Aufbau einer verbesserten und stabileren \"Magnetischen Pinzette\" mit sub-nanometer Auflösung und die Entwicklung neuer Methoden, um DNA Konstrukte herzustellen. Außerdem wird die Torsions\\-steifigkeit von magnetischen Partikeln in externen magnetischen Feldern untersucht. Dabei finden sich Auswahlkriterien für DNA-gebundene magnetische Partikel, durch die eine hohe Auflösung erreicht wird.