The solvent-solute interface of a biomolecule is a dynamic but yet highly structured domain that links a chemically diverse solute surface to the chemically homogeneous bulk aqueous phase. The role of the resulting intermediate domain, i.e. the "hydration shell", in regulating DNA structure and recognition has been addressed here by time-resolved infrared spectroscopy. A highly reproducible automated hydration pulse regime was established and implemented for attenuated total reflectance (ATR) Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy to monitor the structural response of DNA to an incremental growth of its hydration shell on its intrinsic time scale of seconds. The transition from the crystallographically defined BI to the BII substate of B-DNA was found to be driven by the increase of water disorder upon growth of the hydration shell, derived from the water OH-stretching absorption frequency and band width changes. 2D correlation analysis was used to identify different water clusters from the temporal behaviour of their water OH stretching frequencies. The results show that BII-stabilizing structural constraints are exerted by strong water-DNA H-bonds in the grooves of B-DNA and are relieved when the groove-bound water merges into a contiguous hydration shell with the less H-bonded PO2- -solvation sphere at ~14 water molecules per DNA phosphate. The H-bond imbalance at the disjunct hydration sites is split symmetrically around the average H-bond strength of bulk water. Thus, merging into a contiguous hydration shell proceeds at little enthalpic cost and homogeneous connectivity to the outer bulk-like H-bond network, such that alteration in the network distant from the DNA can regulate the BI-BII transition in a cooperative manner. The water connectivity is disrupted by DNA-binding peptides. Remarkably, the data show that the replacement of hydration shell water upon ligand biding is crucial in conferring substate specific recognition by peptides that have little intrinsic structural preference. The antibacterial peptide indolicidin secreted from bovine neutrophils dehydrates the non-PO2--bound hydration sites, thereby rendering the unstructured peptide highly specific for the BI state with vibrational signature almost identical to the bacterial minor groove binder netropsin. The proposed dominant role of hydration shell water for DNA conformation was challenged by studying the competing effect of structured water in the coordination-shell of the lanthanide Eu3+ on water structure in the DNA hydration shell. Whereas no effect is seen at low hydration, a hydrogen-like phase is formed at a stoichiometric ratio of Eu3+ :DNA:H2O of 1:10:140, characterized by a strong increase of the molar volume of hydration water. This novel phase appears attractive for lanthanide and possibly actine separation approaches based on biomolecular coordination.

Understanding the interaction of polyelectrolytes with oppositely charged lipid membranes is an important issue of soft matter physics, which provides an insight into mechanisms of interactions between biological macromolecules and cell membranes. Despite the fact that many (bio)macromolecules and filamentous supramolecular assemblies show semiflexible behavior, prior to this work very little was known about the conformational dynamics and Brownian motion of semiflexible particles attached to freestanding lipid membranes. In order to address these issues, diffusion and conformational dynamics of semiflexible DNA molecules and filamentous fd-virus particles electrostatically adsorbed to cationic freestanding lipid membranes were studied on the single particle level by means of optical wide-field fluorescence microscopy. Supergiant unilamellar vesicles (SGUVs) with diameters larger than 100 m represent a perfect model of a freestanding membrane. In this work, a method was developed that enabled the reliable and efficient electroformation of cationic SGUVs on ITO-coated coverslips. The utilization of SGUVs as model freestanding lipid bilayers allowed for determination of the previously unknown surface viscosity of DOPC/DOTAP membranes. In particular, the analysis of the translational diffusion coefficients of small (10, 20, 50 nm) membrane-attached anionic polystyrene beads has shown that the surface viscosity of DOPC/DOTAP membranes with CDOTAP = 1–7 mol% is independent of the DOTAP concentration and equals η = (5.9 ± 0.2) × 10−10 Pa s m. The fluorescence video-microscopy investigation of single DNA molecules attached to cationic SGUVs revealed a previously unreported conformational transition of a membrane-bound DNA molecule from a 2D random coil, the original conformation in which DNA attaches to the membrane, to a compact globule. This membrane-mediated DNA condensation is favored at high cationic lipid concentrations in the membrane and long DNA contour lengths. The DNA compaction rate in the coil–globule transition is 124 ± 46 kbp/s, and the resulting DNA globule sizes were found to be 250–350 nm at DOPC membranes containing 1 mol% DOTAP and 130–200 nm for 7 mol% DOTAP, indicating a stronger compaction for higher charge densities in the membrane. Additional experiments with freestanding cationic membranes in the gel state and supported cationic lipid membranes with gel–fluid coexistence suggest that the DNA collapse on a freestanding fluid cationic membrane may be initiated by a local lipid segregation in the membrane and is accompanied by local membrane deformations, which eventually stabilize the compact DNA globule. Furthermore, in this work single molecule studies of random-coil DNA molecules and filamentous fd-virus particles on a freestanding cationic lipid bilayer with a low charge density were carried out. The experiments revealed that these particles can be described as semiflexible chains in 2D. Taken together, DNA molecules and fd-virus particles cover a broad range of the ratio of contour length and persistence length from 0.4 to 82. The results of this work demonstrate that the mobility of such membrane-attached semiflexible particles is strongly affected by hydrodynamics in the lipid membrane and the surrounding bulk fluid, and can in essence be described using a hydrodynamics-based theory for a disk-shaped solid membrane inclusion with a characteristic size approximately equal to the radii of gyration of the particles.

Many genetic processes require enzymes or enzyme complexes that interact simultaneously with distant sites along the genome. Such long-range DNA-enzyme interactions are important for example in gene regulation, DNA replication, repair and recombination. In addition many restriction enzymes depend on interactions between two recognition sites and form therefore a model system for studying long-range communications on DNA. Topic of the present work are Type III restriction enzymes. For these enzymes the communication mechanism between their distant target sites has not been resolved and conflicting models including 3D diffusion, 1D translocation and 1D diffusion have been proposed. Also the role of ATP hydrolysis by their superfamily 2 helicase domains which catalyse functions of many enzyme systems is still poorly understood. To cleave DNA, Type III restriction enzymes sense the relative orientation of their distant target sites and cleave DNA only if at least two of them are situated in an inverted repeat. This process strictly depends on ATP hydrolysis. The aim of this PhD thesis was to elucidate this long-range communication. For this a new single molecule assay was developed using a setup combining magnetic tweezers and objective-type total internal reflection fluorescence microscopy. In addition of being able to mechanically manipulate individual DNA molecules, this assay allows to directly visualize the binding and movement of fluorescently labelled enzymes along DNA. Applying this assay to quantum dot labelled Type III restriction enzymes, a 1D diffusion of the enzymes after binding at their target sites could be demonstrated. Furthermore, it was found that the diffusion depends on the nucleotide that is bound to the ATPase domains of these enzymes. This suggested that ATP hydrolysis acts as a switch to license diffusion from the target site which leads to cleavage. In addition to the direct visualization of the enzyme-DNA interaction, the cleavage site selection, the DNA end influence (open or blocked) and the DNA binding kinetics were measured in bulk solution assays (not part of this thesis). The experimental results were compared to Monte Carlo simulations of a diffusion-collision-model which is proposed as long-range communication in this thesis.

Die Gattung Beta gehört zur Familie der Chenopodiaceae und wird in die vier Sektionen Beta, Corollinae, Nanae und Procumbentes unterteilt, wobei die Zuckerrübe der Sektion Beta zugeordnet wird. Aus dem Genom der Zuckerrübe und verwandter Wildarten konnten bereits eine Vielzahl von repetitiven DNA-Familien kloniert und untersucht werden. Mit der monosomen Fragmentadditionslinie PRO1 stand eine Chromosomenmutante zur Verfügung, die neben den 18 B. vulgaris-Chromosomen ein Chromosomenfragment der Wildrübe Beta procumbens enthält. Da dieses als Minichromosom bezeichnete Fragment mitotische Stabilität aufweist, muss es ein funktionelles Centromer besitzen, das auch im genetischen Hintergrund von Beta vulgaris aktiv ist. Mit der Erstellung einer BAC (bacterial artifical chromosome)-Bank von PRO1 wurde die molekulare Charakterisierung von Ty3-gypsy-Retrotransposons eines einzelnen Wildrüben-Centromers möglich. Die für die Wildrübe Beta procumbens spezifischen Satellitenrepeats pTS5 und pTS4.1 dienten der Selektion von BACs aus der Centromer-Region des PRO1-Minichromosoms. Die Identifizierung eines unikalen genomischen Locus, mit einer Verschachtelung von zwei nicht homologen LTR-Retrotransposons, ermöglichte die gerichtete Isolation der LTR-Retrotransposons Beetle1 und Beetle2. Das Retrotransposon Beetle1 hat eine Gesamtlänge von 6736 bp und wird von LTR-Sequenzen begrenzt, die eine Länge von 1091 bp (5’-LTR) bzw. 1089 bp (3’-LTR) aufweisen. Das LTR-Retrotransposon Beetle2 weist mit 6690 bp eine ähnliche Gesamtlänge wie Beetle1 auf. Es wird von deutlich kürzeren LTR-Sequenzen mit einer Länge von 774 bp begrenzt. Aufgrund der Reihenfolge der Polyproteingene lassen sich Beetle1 und Beetle2 in die Gruppe der Ty3-gypsy-Retrotransposons (Metaviridae) einordnen. Beide Retrotransposon-Familien besitzen ein einziges offenes Leseraster (open reading frame; ORF) mit fusionierten gag- und pol-Genen. Datenbankrecherchen zeigten hohe Homologien von Beetle1 und Beetle2 mit den centromerischen Ty3-gypsy-Retrotransposons CRM aus Zea mays, CRR aus Oryza sativa und cereba aus Hordeum vulgare. Diese centromerischen Retrotransposons (CRs) sind in den Poaceae stark konserviert und stellen neben Satellitenrepeats eine hochabundante Sequenzklasse der Centromere der Süßgräser dar. Da sie im 3’-Bereich des gag-pol-Polyproteins eine Chromodomäne aufweisen, werden sie der eigenständigen Gruppe der Chromoviren zugeordnet. Chromodomänen sind zur Bindung von Proteinen und DNA befähigt und spielen eine wichtige Rolle in der Chromatin-Modifikation und der Bildung von Heterochromatin-Regionen. Beetle1 und Beetle2 besitzen Motive einer Chromodomäne, die vermutlich für eine gerichtete Transposition in die Centromer-Region verantwortlich ist. Neben der geringen Divergenz von Beetle1- und Beetle2-Sequenzen sowohl im Genom von Beta procumbens als auch in den anderen Arten der Sektion Procumbentes spricht auch das junge Alter von 100 000 bis 350 000 Jahren und die Transkriptionsaktivität für eine Einordnung dieser Ty3-gypsy-Retrotransposons in die Gruppe der Chromoviren. Sowohl die Southern-Hybridisierung als auch die Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung zeigten, dass Beetle1 und Beetle2 nur für die Sektion Procumbentes spezifisch sind und dort in hoher Kopienzahl vorkommen. Untersuchungen mit methylierungssensitiven Restriktionsendonukleasen veranschaulichten den hohen Grad an Cytosin-Methylierung von Beetle1 und Beetle2.

Genome sequencing and annotation projects define the complete sets of RNA and protein components for living systems. They also present the challenge to generate functional information for thousands of previously uncharacterized genes. Protein tagging with fluorescent or affinity tags provides a generic way to describe protein expression and localization patterns and protein-protein interactions. The genome wide application of this approach in Saccharomyces cerevisiae has resulted in a comprehensive picture of the core proteome of a simple, well-studied model system. Extending these studies to more complex, multicellular model organisms, would allow us to place protein function onto a 4 dimensional space-time map, and will improve our understanding of the complex processes of development and differentiation. This will require efficient protein tagging methods and new high performance tags. Here we present a generic protein tagging approach for the model nematode Caenorhabditis elegans. The method is based on recombination mediated DNA engineering of genomic BAC clones into tagged transgenes for integrative transformation. C.elegans offers unique advantages for function discovery through protein tagging: compact and a well annotated genome, combined with a simple and well-understood anatomy and pattern of development. However, the methods for protein tagging in C.elegans have so far been inefficient and largely dependent on artificial cDNA based constructs, which can lack important regulatory elements. In contrast, our approach combines the advantages of authentic regulation with a new application of recombineering, which is simple, fast and efficient. For the first time we apply liquid culture cloning for multiple recombineering steps. This is particularly important when high throughput applications are considered, as it offers significant advantages in scale up and automation. We show that the BAC derived transgenes can be used for stable, integrative transformation in C. elegans. We show that the tagged transgene can take over the function of its endogenous counterpart. Using florescent reporter, we reproduce known and document new expression patterns. The second part of the thesis describes a project that we undertook to develop improved double affinity cassettes for protein purification. We evaluated the performance of 5 new double tag combinations in vitro and in mammalian culture cells. All of the new cassettes performed well and present a valuable tool for protein interaction studies in higher model systems.

Aufgrund einer komplexen Wechselwirkung mit Proteinen ist das Genom in einer Zelle ständig mechanischer Spannung und Torsion ausgesetzt. Daher ist es wichtig die Mechanik und die Dynamik von verdrillter DNA unter Spannung zu verstehen. Diese Situation wurde experimentell mittels einer sog. magnetischen Pinzette nachgestellt, indem sowohl Kraft als auch Drehmoment auf ein einzelnes DNA Molekül ausgeübt und gleichzeitig die mechanische Antwort des Polymers aufgezeichnet wurde. Als erstes Beispiel wurde der Übergang von linearer zu sog. plectonemischer DNA untersucht, d.h. die Absorption eines Teils der induzierten Verdrillung in einer superhelikalen Struktur. Eine abrupte Längenänderung am Anfang dieses Übergangs wurde bereits im Vorfeld publiziert. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass diese abrupte DNA Verkürzung insbesondere von der Länge der DNA und der Ionenkonzentration der Lösung abhängt. Dieses Verhalten kann mittels eines Modells verstanden werden, in dem die Energie pro Verwringung der ersten Schlinge innerhalb der Superhelix größer ist als die aller nachfolgenden. Des Weiteren wurden DNA-DNA Wechselwirkungen in der Umgebung monovalenter Ionen durch die Analyse des Superspiralisierungsverhaltens einzelner DNA Moleküle bei konstanter Kraft charakterisiert. Solche Wechselwirkungen sind für die Kompaktierung des Genoms und die Regulation der Transkription wichtig. Oft wird DNA als gleichmäßig geladener Zylinder modelliert und ihre elektrostatischen Wechselwirkungen im Rahmen der Poisson-Boltzmann-Gleichung mit einem Ladungsanpassungsfaktor berechnet. Trotz erheblicher Anstrengung ist eine präzise Bestimmung dieses Parameters bisher nicht gelungen. Ein theoretisches Modell dieses Prozesses zeigte nun eine erstaunlich kleine effektive DNA Ladung von ~40% der nominalen Ladungsdichte. Abgesehen von Gleichgewichtsprozessen wurde auch die Dynamik eines Faltungsvorgangs von DNA untersucht. Spontane Branch Migration einer homologen Holliday-Struktur wurde genutzt, um die intramolekulare Reibung der DNA zu erforschen. Mittels einer magnetischen Pinzette wurde eine torsionslimitierte Holliday-Struktur gestreckt während die Längenfluktuationen der Zweige mit schneller Videomikroskopie bei ~3 kHz aufgezeichnet wurden. Einzelne diffusive Schritte der Basenpaare sollten auf einer sub-Millisekunden Zeitskala auftreten und viel kleiner als die Gesamtfluktuationen der DNA sein. Eine Analyse der spektralen Leistungsdichte der Längenfluktuationen ermöglicht eine eindeutige Beschreibung der Dynamik der Branch Migration. Die Holliday-Struktur wurde außerdem als nanomechanischer Linearversteller eingesetzt, um einen einzelnen fluoreszierenden Quantenpunkt durch ein exponentiell abfallendes evaneszentes Feld zu bewegen. Durch die Aufzeichnung der Emission des Quantenpunkts sowohl in dem evaneszenten Feld als auch unter gleichmäßiger Beleuchtung kann die Intensitätsverteilung des Anregungsfelds ohne weitere Dekonvolution bestimmt werden. Diese neue Technik ist von besonderem wissenschaftlichen Interesse, weil die Beschreibung dreidimensionaler inhomogener Beleuchtungsfelder eine große Herausforderung in der modernen Mikroskopie darstellt. Die Ergebnisse dieser Arbeit werden dem besseren Verständnis einer Vielzahl biologischer Prozesse, die in Verbindung mit DNA Superspiralisierung stehen, dienen und weitere technische Anwendungen des DNA-basierten Linearverstellers hervorbringen. / The genome inside the cell is continuously subjected to tension and torsion primarily due to a complex interplay with a large variety of proteins. To gain insight into these processes it is crucial to understand the mechanics and dynamics of twisted DNA under tension. Here, this situation is mimicked experimentally by applying force and torque to a single DNA molecule with so called magnetic tweezers and measuring its mechanical response. As a first example a transition from a linear to a plectonemic DNA configuration is studied, i.e. the absorption of part of the applied twist in a superhelical structure. Recent experiments revealed the occurrence of an abrupt extension change at the onset of this transition. Here, it is found that this abrupt DNA shortening strongly depends on the length of the DNA molecule and the ionic strength of the solution. This behavior can be well understood in the framework of a model in which the energy per writhe for the initial plectonemic loop is larger than for subsequent turns of the superhelix. Furthermore DNA-DNA interactions in the presence of monovalent ions were comprehensively characterized by analyzing the supercoiling behavior of single DNA molecules held under constant tension. These interactions are important for genome compaction and transcription regulation. So far DNA is often modeled as a homogeneously charged cylinder and its electrostatic interactions are calculated within the framework of the Poisson-Boltzmann equation including a charge adaptation factor. Despite considerable efforts, until now a rigorous quantitative assessment of this parameter has been lacking. A theoretical model of this process revealed a surprisingly small effective DNA charge of ~40% of the nominal charge density. Besides describing equilibrium processes, also the dynamics during refolding of nucleic acids is investigated. Spontaneous branch migration of a homologous Holliday junction serves as an ideal system where the friction within the biomolecule can be studied. This is realized by stretching a torsionally constrained Holliday junction using magnetic tweezers and recording the length fluctuations of the arms with high-speed videomicroscopy at ~3 kHz. Single base pair diffusive steps are expected to occur on a sub-millisecond time scale and to be much smaller than the overall DNA length fluctuations. Power-spectral-density analysis of the length fluctuations is able to clearly resolve the overall dynamics of the branch migration process. Apart from studying intramolecular friction, the four-arm DNA junction was also used as a nanomechanical translation stage to move a single fluorescent quantum dot through an exponentially decaying evanescent field. Recording the emission of the quantum dot within the evanescent field as well as under homogeneous illumination allows to directly obtain the intensity distribution of the excitation field without additional deconvolution. This new technique is of particular scientific interest because the characterization of three-dimensional inhomogeneous illumination fields is a challenge in modern microscopy. The results presented in this work will help to better understand a large variety of biological processes related to DNA supercoiling and inspire further technical applications of the nanomechanical DNA gear.

Der Grundbaustein des Lebens, die Desoxyribonukleinsäure (DNS), ist aufgrund ihrer spezifischen Basenpaarung ein geeignetes Molekül, um stabile und vielfältige nano- beziehungsweise mikrometergroße Strukturen herzustellen. Diese selbstorganisierten DNS-Strukturen eignen sich als Grundeinheiten für die Ausrichtung anorganischer und organischer Materialien. Für die Synthese solcher DNS-Strukturen werden insbesondere die Kachel-basierte Assemblierung (engl. tile-based assembly, im Folgenden als Tile-basierte Assemblierung bezeichnet) oder die DNS-Origami-Methode verwendet. Die Tile-basierte Assemblierung beinhaltet die Verbindung einzelner DNS-Bausteine, den sogenannten Kacheln (engl. tiles), zu komplexeren DNS-Strukturen. Hingegen entspricht die DNS-Origami-Methode der Faltung eines langen einzelsträngigen DNS-Moleküls, dem sogenannten scaffold, anhand von hunderten kurzen Oligonukleotiden (Heftklammer-Oligomeren, engl. staple strands) hin zu einer entsprechenden Form. Hinsichtlich einer zukünftigen Erstellung von DNS-basierten, nanoelektronischen Systemen war das Ziel dieser Arbeit einheitliche zwei- (2D) und dreidimensionale (3D) DNS-Nanostrukturen herzustellen, Methoden für deren kontrollierte Vernetzung zu entwickeln sowie deren chemische Funktionalisierung mit Nanomaterialien und einer beispielhaften Integration in lithographisch gefertigten Mikrokontaktstrukturen durchzuführen. Hierfür war es notwendig, einen weiten Bogen zu spannen, welcher einerseits verschiedene Konstruktionsprinzipien der DNS-Nanotechnologie vorteilhaft miteinander vereint und der andererseits die weitreichenden Möglichkeiten der chemischen Funktionalisierung der sogenannten DNS-Templatstrukturen auslotet. Konkret wurden zur Erstellung von einheitlichen DNS-Strukturen Assemblierungskonzepte verwendet bzw. entwickelt, welche auf die Ausrichtung einzelner kurzer Oligonukleotide anhand eines langen einzelsträngigen DNS-Templates beruhen. Im ersten Teil der Arbeit ist anhand eines selbstkomplementären Einzelstranges aufgezeigt, wie sich prinzipiell die Wachstumsrichtung einer Tile-basierten Struktur durch die Verwendung eines einzelsträngigen DNS-Templates beeinflussen lässt. Bei diesem Ansatz bildet sich entlang des DNS-Templates eine 2D-Gitterstruktur aus einheitlichen und abschnittsweise selbstkomplementären hexagonalen oder tetragonalen Oligonukleotideinheiten aus. Diese gerichtete Selbstassemblierung führt schließlich zum Aufrollen und Zusammenschluss der 2D-DNS-Struktur zu einer tubulären Struktur. Die Größe und Geometrie der Oligonukleotideinheiten bestimmen dabei maßgeblich den Durchmesser dieser DNS-Nanoröhren. Zur Erklärung von experimentellen Beobachtungen wurde ein Modell entwickelt, welches die Templat-gestützte Assemblierung theoretisch beschreibt. Die erstellten, strukturellen Anforderungen genügenden Nanoröhren eignen sich für eine gleichmäßige Funktionalisierung mit Nanomaterialien, wie anhand der Ausrichtung von Gold-Nanopartikeln gezeigt wurde. In einem weiteren Teil der Arbeit wurde eine ca. 400 nm lange DNS-Nanoröhre anhand der DNS-Origami-Methode erstellt. Diese Nanoröhre diente als Modellsystem zur Untersuchung der Integration von tubulären DNS-Strukturen in Mikrokontaktstrukturen mittels der Dielektrophorese. Eine positive dielektrophoretische Antwort der 3D-DNS-Strukturen konnte im MHz-Bereich festgestellt werden. Des Weiteren wurde für mit Gold-Nanopartikeln funktionalisierte DNS-Nanoröhren eine verstärkte dielektrophoretisch Antwort beobachtet. Neben der Manipulation bzw. Ausrichtung von DNS-Nanostrukturen wurden Konzepte entwickelt, welche zusätzlich zum Aufbau komplexer DNS-Netzwerke innerhalb einer Mikrokontaktstruktur erforderlich sind. Konkret konnte eine Verbindung der 3D-Nanoröhren (i) untereinander über eine 200 nm lange kreuzartige DNS-Zwischenstruktur und (ii) endständig mit einer Goldoberfläche ermöglicht werden. Der dritte Teil dieser Arbeit befasste sich mit der Entwicklung einer modularen 2D-DNS-Struktur, welche unter anderem für eine vergleichbare Untersuchung zur Immobilisierung von Nanomaterialien auf DNS-Strukturen dienen kann. Anhand der DNS-Origami-Methode wurde eine spezifische DNS-Gerüststruktur entworfen, welche die Ausstattung mit einer funktionalisierbaren Tile-basierten Einheit erlaubt. Um die Modularität der DNS-Gerüststruktur zu verdeutlichen, wurden zwei unterschiedliche, drei-beinige Tiles entworfen und anhand eines Ein- oder Zwei-Schritt-Verfahrens in die DNS-Gerüststruktur integriert. Die Anbindung eines Gold-Nanopartikels an jedes Bein des eingebundenen Tiles demonstriert die spezifische Funktionialisierbarkeit dieses Modellsystems. Zudem wurden Methoden, welche zur Aufreinigung der funktionalisierten DNS-Gerüststrukturen dienen, wie auch Effekte der Vernetzung von DNS-Origami-Strukturen anhand unspezifischer Wechselwirkungen untersucht. Die Ermittlung der Struktureigenschaften beziehungsweise der Assemblierungsqualität der in dieser Arbeit gezeigten DNS-Strukturen erfolgte mittels elektrophoretischer und bildgebender Untersuchungsverfahren (Rasterkraftmikroskopie, Transmissionselektronenmikroskopie, Rasterelektronenmikroskopie).

Das nur 16,5 kDa große Survivin ist ein bifunktionales Protein, welches eine bedeutende Rolle in zwei wichtigen zellulären Prozessen spielt, der Apoptose und der Mitose. Aufgrund seiner BIR Domäne wird es zu den Inhibitor der Apoptose Proteine (IAP) gezählt. Diese Gruppe an Proteinen interferiert negativ mit der Aktivierung der Caspasen und wirkt somit einer Induktion der Apoptose entgegen. Neben seiner anti-apoptotischen Funktion besitzt das Survivin zudem eine essentielle Rolle bei der Segregation der Chromosomen und während der Zytokinese. In der Mitose bildet Survivin mit Borealin, INCENP und der mitotische Aurora B Kinase den Chromosomalen Passenger Complex (CPC). Das Survivin besitzt zudem eine grosse medizinische Relevanz und gilt als Tumor-assoziertes Antigen, da es zu den Top vier Transkripten zählt, die in einer Vielzahl unterschiedlicher Tumorentitäten überexprimiert werden, aber nicht in Normalgewebe. Diese Überexpression geht einher mit einer erhöhten Resistenz der Tumore gegenüber Chemo- und Strahlentherapie und macht Survivin zu einem idealen molekularen Ziel einer Krebstherapie mittels RNA Interferenz oder spezifischer pharmakologischer Inhibitoren. In einer Vielzahl an Studien, in denen das Survivin-Protein mittels RNAi, dominant negativer Proteine oder „knock out“ des Survivin Genes (BIRC5) aus geschalten wurde, konnte eine Aktivierung des Tumorsuppressorproteins p53, einem wichtigen Mediator der Zellzyklusregulation, beobachtet werden. Bis heute ist es weitgehend unklar, wie eine Aktivierung von p53 nach einem Survivin Verlust erfolgen kann. Zudem stellte sich die Frage, ob eine therapeutische Intervention, welche die Ausschaltung des Survivin-Proteins zum Ziel hat, neben Tumorzellen auch normales Gewebe schädigen kann. Da Tumorzellen sich von normalen Zellen insbesondere dadurch unterscheiden, dass sie Defekte in p53-Signalwegen bzw. eine inaktivierende p53-Mutation oder Gendeletion besitzen, wurde die Auswirkung einer Survivin-Depletion auf p53-positive Tumorzellen und auf isogene Tumorzellen mit ausgeschalteten p53 untersucht. Zu diesem Zweck wurde p53 mittels RNAi in U87-MG und MCF-7 Zellen ausgeschalten und stabile p53-defiziente Zellen generiert. Insgesamt standen für die Untersuchungen mit HCT116, MCF-7 und U87-MG drei Zelllinien unterschiedlichen Ursprungs sowie ihre isogenetischen, aber p53-defizienten Derivate zur Verfügung. Survivin wurde in diesen Zellen durch einen retroviralen Vektor, der für eine shRNA (small hairpin RNA) gegen Survivin codiert, ausgeschalten. Der Verlust an Survivin führte dabei in Wildtyp- als auch in den p53-defizienten Zellen zu Polyploidie, einer gestörten Zytokinese und multipolaren Spindeln. Zusätzlich konnte eine Induktion an p53/p21waf/cip sowie eine erhöhte, p53- und Caspase 3-unabhängige Apoptose festgestelt werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Expression an p21waf/cip in Wildtyp-Zellen sowie seines potentiellen Targets Cyclin D1 mit der Zunahme an Polyploidie nach Survivin RNAi korreliert. Allerdings führt die Expression des Cdk Inhbibitors p21waf/cip nur zu einem transienten Arrest der Zellen, da polyploide, Survivin-depletierte Zellen BrdU inkorporierten und dadurch proliferierten. Zudem wird zum ersten Mal eine ATM/ATR abhängige „DNA Damage Response“ (DDR) in Survivin-depletierten p53-defzienten und Wildtyp Zellen beschrieben, die zu einer Phosphorylierung und Stabilisierung von p53 führt. Sky-Analysen bestätigten numerische als auch schwere chromosomale Aberrationen wie Translokationen und dizentrische Chromosomen in Survivin-depletierten polyploiden Zellen. Die Inhibierung der Aurora B Kinase, einem weiteren Bestandteil des CPC, mittels eines chemischen Inhibitors zeigt analog das Auftreten von DNA Schäden, eine p53/p21waf/cip Aktivierung sowie eine Zunahme an Polyploidie, wie sie für Survivin beschrieben wurde. Diese Erkenntnisse zeigen deutlich auf, dass die DNA Schäden und der p53/p21waf/cip-abhängige G1 Arrest nach dem „knock down“ von Survivin aufgrund einer gestörten Mitose hervorgerufen wurde, während eine IAP-Funktion des Survivins unter den gewählten experimentellen Bedingungen nicht festzustellen war.

Each organism has to maintain the integrity of its genetic code, which is stored in its DNA. This is achieved by strongly controlled and regulated cellular processes such as DNA replication, -repair and -recombination. An essential element of these processes is the unwinding of the duplex strands of the DNA helix. This biochemical reaction is catalyzed by helicases that use the energy of nucleoside triphophate (NTP) hydrolysis. Although all helicases comprise highly conserved domains in their amino acid sequence, they exhibit large variations regarding for example their structure, their function and their target nucleic acid structures. The main objective of this thesis is to obtain insight into the DNA unwinding mechanisms of three helicases from two different organisms. These helicase vary in their structures and are involved in different pathways of DNA metabolism. In particular the replicative, hexameric helicase Large Tumor-Antigen (T-Antigen) from Simian virus 40 and the DNA repair helicases RecQ2 and RecQ3 from Arabidopsis thaliana are studied. To observe DNA unwinding by these helicases in real-time on the single molecule level, a biophysical technique, called magnetic tweezers, was applied. This technique allows to stretch single DNA molecules attached to magnetic particles. Simultaneously one can measure the DNA end-to-end distance. Special DNA hairpin templates allowed to characterize different parameters of the DNA unwinding reaction such as the unwinding velocity, the length of unwound DNA (processivity) or the influence of forces. From this mechanistic models about the functions of the helicases could be obtained. T-Antigen is found to be one of the slowest and most processive helicases known so far. In contrast to prokaryotic helicases, the unwinding velocity of T-Antigen shows a weak dependence on the applied force. Since current physical models for the unwinding velocity fail to describe the data an alternative model is developed. The investigated RecQ helicases are found to unwind and close short stretches of DNA in a repetitive fashion. This activity is shown for the first time under external forces. The experiments revealed that the repetitive DNA unwinding is based on the ability of both enzymes to switch from one single DNA strand to the other. Although RecQ2 and RecQ3 perform repetitive DNA unwinding, both enzymes differ largely in the measured DNA unwinding properties. Most importantly, while RecQ2 is a classical helicase that unwinds DNA, RecQ3 mostly rewinds DNA duplexes. These different properties may reflect different specific tasks of the helicases during DNA repair processes. To obtain high spatial resolution in DNA unwinding experiments, the experimental methods were optimized. An improved and more stable magnetic tweezers setup with sub-nanometer resolution was built. Additionally, different methods to prepare various DNA templates for helicase experiments were developed. Furthermore, the torsional stability of magnetic particles within an external field was investigated. The results led to selection rules for DNA-microsphere constructs that allow high resolution measurements. / Jeder Organismus ist bestrebt, die genetischen Informationen intakt zu halten, die in seiner DNA gespeichert sind. Dies wird durch präzise gesteuerte zelluläre Prozesse wie DNA-Replikation, -Reparatur und -Rekombination verwirklicht. Ein wesentlicher Schritt ist dabei das Entwinden von DNA-Doppelsträngen zu Einzelsträngen. Diese chemische Reaktion wird von Helikasen durch die Hydrolyse von Nukleosidtriphosphaten katalysiert. Obwohl bei allen Helikasen bestimmte Aminosäuresequenzen hoch konserviert sind, können sie sich in Eigenschaften wie Struktur, Funktion oder DNA Substratspezifität stark unterscheiden. Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist es, die Entwindungsmechanismen von drei verschieden Helikasen aus zwei unterschiedlichen Organismen zu untersuchen, die sich in ihrer Struktur sowie ihrer Funktion unterscheiden. Es handelt sich dabei um die replikative, hexamerische Helikase Large Tumor-Antigen (T-Antigen) vom Simian-Virus 40 und die DNA-Reparatur-Helikasen RecQ2 und RecQ3 der Pflanze Arabidopsis thaliana. Um DNA-Entwindung in Echtzeit zu untersuchen, wird eine biophysikalische Einzelmolekültechnik, die \"Magnetische Pinzette\", verwendet. Mit dieser Technik kann man ein DNA-Molekül, das an ein magnetisches Partikel gebunden ist, strecken und gleichzeitig dessen Gesamtlänge messen. Mit speziellen DNA-Konstrukten kann man so bestimmte Eigenschaften der Helikasen bei der DNA-Entwindung, wie z.B. Geschwindigkeit, Länge der entwundenen DNA (Prozessivität) oder den Einfluß von Kraft, ermitteln. Es wird gezeigt, dass T-Antigen eine der langsamsten und prozessivsten Helikasen ist. Im Gegensatz zu prokaryotischen Helikasen ist die Entwindungsgeschwindigkeit von T-Antigen kaum kraftabhängig. Aktuelle Modelle sagen dieses Verhalten nicht vorraus, weshalb ein alternatives Modell entwickelt wird. Die untersuchten RecQ-Helikasen zeigen ein Entwindungsverhalten bei dem permanent kurze Abschnitte von DNA entwunden und wieder zusammengeführt werden. Dieses Verhalten wird hier zum ersten Mal unter dem Einfluß externer Kräfte gemessen. Es wird gezeigt, dass die permanente Entwindung auf die Fähigkeit beider Helikasen, von einem einzelen DNA-Strang auf den anderen zu wechseln, zurückzuführen ist. Obwohl RecQ2 und RecQ3 beide das Verhalten des permanenten Entwindens aufzeigen, unterscheiden sie sich stark in anderen Eigenschaften. Der gravierendste Unterschied ist, dass RecQ2 wie eine klassische Helikase die DNA entwindet, während RecQ3 eher bestrebt ist, die DNA-Einzelstränge wieder zusammenzuführen. Die unterschiedlichen Eigenschaften könnten die verschieden Aufgaben beider Helikasen während DNA-Reparaturprozessen widerspiegeln. Weiterhin werden die experimentellen Methoden optimiert, um möglichst hohe Auflösungen der Daten zu erreichen. Dazu zählen der Aufbau einer verbesserten und stabileren \"Magnetischen Pinzette\" mit sub-nanometer Auflösung und die Entwicklung neuer Methoden, um DNA Konstrukte herzustellen. Außerdem wird die Torsions\\-steifigkeit von magnetischen Partikeln in externen magnetischen Feldern untersucht. Dabei finden sich Auswahlkriterien für DNA-gebundene magnetische Partikel, durch die eine hohe Auflösung erreicht wird.

Solid state approaches to structural properties like diffraction or microscopy techniques often cannot be applied to biomolecular systems, at least not without special postpreparation which often corrupts the desired properties of the pristine systems. In this work the capabilities of synchrotron-based, soft X-ray spectroscopies as an alternative way to unravel structural properties of such systems are tested. To this end, three exemplary systems were investigated each with the focus on another facet and characteristic length scale. The first example are DNA-alkanethiol self-assembled monolayers, also known as DNA microarrays or DNA chips, for which a way to monitor and controllably tune the structural composition on the mesoscopic scale of many thousands of molecules was sought for. The second example focuses on the single-molecule and submolecular scale in metalprotein hybrid compounds with the aim to identify the binding site of metal atoms or ions within protein molecules and the underlying interaction mechanisms. The most fundamental structural scale, the level of single bonds and molecular orbitals, is addressed in the last example where it was tried to elaborate an approach to map the topology of molecular orbitals based upon X-ray absorption properties. This approach was put to the practical test for the characteristic pi*peptide orbitals in protein backbones. For all three investigated examples, spectroscopies using soft X-ray synchrotron radiation were able to extract the desired information, thus confirming that they may grant alternative access to structural properties of soft-matter systems in cases where standard approaches fail. / Klassische Festkörpertechniken zur Strukturuntersuchung, wie Streu- oder Mikroskopiemethoden, können häufig nicht auf Biomolekülsysteme angewandt werden, zumindest nicht ohne spezielle Postpräparation, die die ursprünglichen Eigenschaften dieser Systeme oft verfälscht. In dieser Arbeit soll untersucht werden, inwieweit Röntgenspektroskopien basierend auf Synchrotronstrahlung einen alternativen Zugang zu Struktureigenschaften solcher Systeme bieten. Dazu wurden drei Systeme exemplarisch untersucht, jeweils mit Schwerpunkt auf einen anderen Aspekt und charakteristischen Längenbereich. Für selbstorganisierende DNA-Alkanthiol-Schichten, sogenannte DNA-Chips, wurde nach eine Weg gesucht, ihre strukturelle Zusammensetzung auf der mesoskopischen Ebene vieler tausend Moleküle zu bestimmen und kontrolliert zu modifizieren. Metallisierte Proteinstrukturen wurden auf Einzelmolekül- bzw. submolekularer Ebene untersucht, mit dem Ziel, die Orte der Metallanlagerung innerhalb des Proteins und die zugrundeliegenden Wechselwirkungsmechanismen zu identifizieren. Die unterste strukturelle Ebene, der Bereich einzelne Bindungen und Molekülorbitale, wurde adressiert am Beispiel der pi*peptide Orbitale des Proteinrückrats. Dafür wurde eine Methode zur Kartographierung einzelner Orbitale anhand von Röntgenabsorptionseigentschaften herausgearbeitet und praktisch getestet. In allen drei Fällen konnten Röntgenspektroskopien die nötigen Informationen liefern und damit ihr Potential für Strukturuntersuchungen in weicher Materie unter Beweis stellen.