A cultura do eucalipto apresenta grande importância no setor florestal no mundo. No Brasil, 70% da área florestal plantada é destinada ao eucalipto. Entretanto, a ferrugem das mirtáceas, também conhecida como ferrugem do eucalipto, causada pelo fungo Puccinia psidii Winter, afeta o enorme potencial produtivo das plantações de eucalipto. A biologia, mecanismos de patogenicidade e genética desse patógeno são pouco conhecidos, apesar de sua importância para o setor florestal. Os elementos transponíveis (TEs) são sequências de DNA com a capacidade de migrar e influenciar a organização, integridade e evolução do genoma hospedeiro. O presente trabalho teve como principal objetivo estudar os TEs presentes no genoma de P. psidii, combinando ferramentas in silico e moleculares. A classificação dos elementos transponíveis no genoma de P. psidii MF-1 foi realizada utilizando contigs previamente minerados e remontados, bem como sem seleção prévia dos contigs, por meio do programa RepeatMasker. Ambas estratégias apontaram o predomínio de elementos da Classe I - LTR Retrotransposons no genoma de P. psidii MF-1. O resultado condiz com a composição de TEs em fungos fitopatogênicos descrita na literatura. Algumas análises in silico, como verificação de integridade e anotação manual de sequências proteicas foram também realizadas para alguns contigs classificados como TEs. Assim, foi possível observar a presença de sequências conservadas pertencentes à região pol em LTR Retrotransposons. Além disso, as análises permitiram inferir sobre a existência de TEs híbridos no genoma parcialmente sequenciado de P. psidii MF-1. Paralelamente foi também realizada uma análise comparativa entre os TEs presentes nos genomas de P. graminis, P. striiformis, P. triticina e P. psidii. Observou-se que P. graminis, P. striiformis e P. triticina apresentam maior frequência de elementos da Classe II, do tipo DNA Transposons ao contrário de P. psidii, com maior frequência de elementos da Classe I. Interessantemente, a quantidade de elementos desconhecidos foi similarmente alta para todos os quatro genomas avaliados. Este tipo de análise é muito importante, pois evidencia a grande quantidade de famílias de TEs novas a serem descobertas. Elas podem estar potencialmente relacionadas ao silenciamento de genes importantes à virulência destes patógenos. A utilização de TEs no estudo de diversidade genética entre populações é bastante comum. A técnica molecular IRAP foi utilizada para acessar a diversidade entre populações de P. psidii originárias de três híbridos de Eucalyptus spp., goiabeira, jambeiro e jabuticabeira. No entanto, esta técnica não se mostrou eficiente para detectar polimorfismos existentes entre estas populações. A anotação de TEs foi difícil devido à observação de sequências de elementos sobrepostas, o que podem representar híbridos de TEs, entretanto, visando a confirmação desta hipótese por meio da PCR, alguns contigs serão sequenciados e mais estudos devem ser realizados para a continuação desta confirmação. Os resultados apresentados neste trabalho são inéditos e representam uma etapa crucial no entendimento de TEs em fungos do gênero Puccinia, em especial do patógeno P. psidii para o desenvolvimento de melhores mecanismos de controle de ferrugem. / The culture of eucalyptus has great importance worldwide in forestry sector. In Brazil, 70% of cultivated forest area is intended for Eucalyptus. However, the eucalyptus potential productive has been affected by rust disease, caused by the fungus Puccinia psidii Winter. Despite its importance to brazilian and world forest sector, the knowledge of biology, genetic and pathogenic mechanisms of this pathogen is scarce. Transposable elements (TEs) are mobile DNA fragments that influence the organization and development of the host genome. These elements have the ability to move within host genome, and their insertion can cause a wide spectrum of mutations in their hosts. This study aims to decipher the TEs in P. psidii genome by combining in silico and molecular tools. P. psidii MF-1 TEs classification was performed automatically, through RepeatMasker software, being observed a predominance of Class I - LTR Retrotransposons in P. psidii MF-1 genome. This result is consistent with the TEs composition described in phytopathogenic fungi. Some in silico analysis, as integrity and manual annotation of conserved protein sequences from TEs were carried out with P. psidii MF-1 contigs classified as transposable elements. The presence of conserved sequences belonging to pol region in LTR Retrotransposons was observed. Furthermore, these analysis allowed the inference of hybrid TEs in P. psidii MF-1. At the same time, a comparative analysis of TEs present in other Puccinia genomes and P. psidii MF-1 was also performed. The P. graminis, P. striiformis and P. triticina genomes have higher frequency of Class II - DNA Transposons unlike the results found for P. psidii. Interestingly, the number of unknown elements was similarly high for all genomes. This type of analysis is very importante because it shows a great number of potential new TEs families to be discovered. They may be potentially related to the virulence gene silencing of these pathogens. Using TEs for study the fungal genetic diversity is quite common. The IRAP technique was used to access the diversity among P. psidii populations originated from three Eucalyptus spp. hybrids, guava, syzigium and jabuticaba. However, this technique was not efficient to detect existing polymorphisms between these populations. TEs annotation was labored due to the existence of overlapping elements, which may represent hybrids TEs. PCR tool was used to confirm some sequences annotated as hybrids and more studies are needed to confirm this hyphotesis. The results presented in this study are novel and is a crucial step in understanding the genetic of P. psidii pathogen for further improvements of rust control mechanisms.

A cultura do eucalipto apresenta grande importância no setor florestal no mundo. No Brasil, 70% da área florestal plantada é destinada ao eucalipto. Entretanto, a ferrugem das mirtáceas, também conhecida como ferrugem do eucalipto, causada pelo fungo Puccinia psidii Winter, afeta o enorme potencial produtivo das plantações de eucalipto. A biologia, mecanismos de patogenicidade e genética desse patógeno são pouco conhecidos, apesar de sua importância para o setor florestal. Os elementos transponíveis (TEs) são sequências de DNA com a capacidade de migrar e influenciar a organização, integridade e evolução do genoma hospedeiro. O presente trabalho teve como principal objetivo estudar os TEs presentes no genoma de P. psidii, combinando ferramentas in silico e moleculares. A classificação dos elementos transponíveis no genoma de P. psidii MF-1 foi realizada utilizando contigs previamente minerados e remontados, bem como sem seleção prévia dos contigs, por meio do programa RepeatMasker. Ambas estratégias apontaram o predomínio de elementos da Classe I - LTR Retrotransposons no genoma de P. psidii MF-1. O resultado condiz com a composição de TEs em fungos fitopatogênicos descrita na literatura. Algumas análises in silico, como verificação de integridade e anotação manual de sequências proteicas foram também realizadas para alguns contigs classificados como TEs. Assim, foi possível observar a presença de sequências conservadas pertencentes à região pol em LTR Retrotransposons. Além disso, as análises permitiram inferir sobre a existência de TEs híbridos no genoma parcialmente sequenciado de P. psidii MF-1. Paralelamente foi também realizada uma análise comparativa entre os TEs presentes nos genomas de P. graminis, P. striiformis, P. triticina e P. psidii. Observou-se que P. graminis, P. striiformis e P. triticina apresentam maior frequência de elementos da Classe II, do tipo DNA Transposons ao contrário de P. psidii, com maior frequência de elementos da Classe I. Interessantemente, a quantidade de elementos desconhecidos foi similarmente alta para todos os quatro genomas avaliados. Este tipo de análise é muito importante, pois evidencia a grande quantidade de famílias de TEs novas a serem descobertas. Elas podem estar potencialmente relacionadas ao silenciamento de genes importantes à virulência destes patógenos. A utilização de TEs no estudo de diversidade genética entre populações é bastante comum. A técnica molecular IRAP foi utilizada para acessar a diversidade entre populações de P. psidii originárias de três híbridos de Eucalyptus spp., goiabeira, jambeiro e jabuticabeira. No entanto, esta técnica não se mostrou eficiente para detectar polimorfismos existentes entre estas populações. A anotação de TEs foi difícil devido à observação de sequências de elementos sobrepostas, o que podem representar híbridos de TEs, entretanto, visando a confirmação desta hipótese por meio da PCR, alguns contigs serão sequenciados e mais estudos devem ser realizados para a continuação desta confirmação. Os resultados apresentados neste trabalho são inéditos e representam uma etapa crucial no entendimento de TEs em fungos do gênero Puccinia, em especial do patógeno P. psidii para o desenvolvimento de melhores mecanismos de controle de ferrugem. / The culture of eucalyptus has great importance worldwide in forestry sector. In Brazil, 70% of cultivated forest area is intended for Eucalyptus. However, the eucalyptus potential productive has been affected by rust disease, caused by the fungus Puccinia psidii Winter. Despite its importance to brazilian and world forest sector, the knowledge of biology, genetic and pathogenic mechanisms of this pathogen is scarce. Transposable elements (TEs) are mobile DNA fragments that influence the organization and development of the host genome. These elements have the ability to move within host genome, and their insertion can cause a wide spectrum of mutations in their hosts. This study aims to decipher the TEs in P. psidii genome by combining in silico and molecular tools. P. psidii MF-1 TEs classification was performed automatically, through RepeatMasker software, being observed a predominance of Class I - LTR Retrotransposons in P. psidii MF-1 genome. This result is consistent with the TEs composition described in phytopathogenic fungi. Some in silico analysis, as integrity and manual annotation of conserved protein sequences from TEs were carried out with P. psidii MF-1 contigs classified as transposable elements. The presence of conserved sequences belonging to pol region in LTR Retrotransposons was observed. Furthermore, these analysis allowed the inference of hybrid TEs in P. psidii MF-1. At the same time, a comparative analysis of TEs present in other Puccinia genomes and P. psidii MF-1 was also performed. The P. graminis, P. striiformis and P. triticina genomes have higher frequency of Class II - DNA Transposons unlike the results found for P. psidii. Interestingly, the number of unknown elements was similarly high for all genomes. This type of analysis is very importante because it shows a great number of potential new TEs families to be discovered. They may be potentially related to the virulence gene silencing of these pathogens. Using TEs for study the fungal genetic diversity is quite common. The IRAP technique was used to access the diversity among P. psidii populations originated from three Eucalyptus spp. hybrids, guava, syzigium and jabuticaba. However, this technique was not efficient to detect existing polymorphisms between these populations. TEs annotation was labored due to the existence of overlapping elements, which may represent hybrids TEs. PCR tool was used to confirm some sequences annotated as hybrids and more studies are needed to confirm this hyphotesis. The results presented in this study are novel and is a crucial step in understanding the genetic of P. psidii pathogen for further improvements of rust control mechanisms.

Long terminal repeat (LTR) retrotransposons account for approximately 10% of mouse and 8% of human genomes and may play a role in modifying gene expression. Many species harbor retrotransposon families encompassing both autonomous and non-autonomous members. Specifically, the mouse Early Transposon (ETn) family members lack all retroviral genes but are transcriptionally and retrotranspositionally active, causing over 20 known insertional germline mutations. ETns owe their retrotransposition potential to proteins encoded by structurally intact MusD retrotransposons with whom they share LTRs. ETn elements are transcribed at a much higher level than MusD retrotransposons in embryos and undifferentiated cells, suggesting their evasion of host restriction mechanisms. However, mechanisms responsible for the replicative success of non-autonomous retrotransposon subfamilies over their coding-competent relatives are poorly understood. In the first stage of my research, I analyzed regulatory sequences in an ETn LTR responsible for its high promoter activity in the undifferentiated cell line P19. I found that three GC-boxes that may function as Sp1/Sp3 binding sites act synergistically and are indispensable for undifferentiated cell-specific promoter activity of the LTR. Sp1 binding partners may be responsible for the restricted ETn expression. Moreover, I have shown that unlike many retroviruses, ETn elements possess multiple transcription initiation sites and that they have amplified via intracellular retrotransposition in the P19 teratocarcinoma cell line. In the next step of my research, I performed analysis of epigenetic mechanisms as a means of ERV suppression. Specifically, I showed that in embryonic stem cells, autonomous MusD retrotransposons are epigenetically suppressed to a greater degree than non-autonomous ETn retrotransposons, illustrated by a higher level of DNA methylation and a lower level of active histone modifications. I hypothesize that MusD elements may be silenced by DNA methylation and repressive chromatin spreading into the LTR from the CpG-rich internal retroviral sequence absent in ETn elements. I propose that internal structure largely devoid of high CG content enables ETn elements to evade host-imposed transcriptional repression, contributing to their high mutagenic activity in the mouse germline.

Long terminal repeat (LTR) retrotransposons account for approximately 10% of mouse and 8% of human genomes and may play a role in modifying gene expression. Many species harbor retrotransposon families encompassing both autonomous and non-autonomous members. Specifically, the mouse Early Transposon (ETn) family members lack all retroviral genes but are transcriptionally and retrotranspositionally active, causing over 20 known insertional germline mutations. ETns owe their retrotransposition potential to proteins encoded by structurally intact MusD retrotransposons with whom they share LTRs. ETn elements are transcribed at a much higher level than MusD retrotransposons in embryos and undifferentiated cells, suggesting their evasion of host restriction mechanisms. However, mechanisms responsible for the replicative success of non-autonomous retrotransposon subfamilies over their coding-competent relatives are poorly understood. In the first stage of my research, I analyzed regulatory sequences in an ETn LTR responsible for its high promoter activity in the undifferentiated cell line P19. I found that three GC-boxes that may function as Sp1/Sp3 binding sites act synergistically and are indispensable for undifferentiated cell-specific promoter activity of the LTR. Sp1 binding partners may be responsible for the restricted ETn expression. Moreover, I have shown that unlike many retroviruses, ETn elements possess multiple transcription initiation sites and that they have amplified via intracellular retrotransposition in the P19 teratocarcinoma cell line. In the next step of my research, I performed analysis of epigenetic mechanisms as a means of ERV suppression. Specifically, I showed that in embryonic stem cells, autonomous MusD retrotransposons are epigenetically suppressed to a greater degree than non-autonomous ETn retrotransposons, illustrated by a higher level of DNA methylation and a lower level of active histone modifications. I hypothesize that MusD elements may be silenced by DNA methylation and repressive chromatin spreading into the LTR from the CpG-rich internal retroviral sequence absent in ETn elements. I propose that internal structure largely devoid of high CG content enables ETn elements to evade host-imposed transcriptional repression, contributing to their high mutagenic activity in the mouse germline.

Long terminal repeat (LTR) retrotransposons account for approximately 10% of mouse and 8% of human genomes and may play a role in modifying gene expression. Many species harbor retrotransposon families encompassing both autonomous and non-autonomous members. Specifically, the mouse Early Transposon (ETn) family members lack all retroviral genes but are transcriptionally and retrotranspositionally active, causing over 20 known insertional germline mutations. ETns owe their retrotransposition potential to proteins encoded by structurally intact MusD retrotransposons with whom they share LTRs. ETn elements are transcribed at a much higher level than MusD retrotransposons in embryos and undifferentiated cells, suggesting their evasion of host restriction mechanisms. However, mechanisms responsible for the replicative success of non-autonomous retrotransposon subfamilies over their coding-competent relatives are poorly understood. In the first stage of my research, I analyzed regulatory sequences in an ETn LTR responsible for its high promoter activity in the undifferentiated cell line P19. I found that three GC-boxes that may function as Sp1/Sp3 binding sites act synergistically and are indispensable for undifferentiated cell-specific promoter activity of the LTR. Sp1 binding partners may be responsible for the restricted ETn expression. Moreover, I have shown that unlike many retroviruses, ETn elements possess multiple transcription initiation sites and that they have amplified via intracellular retrotransposition in the P19 teratocarcinoma cell line. In the next step of my research, I performed analysis of epigenetic mechanisms as a means of ERV suppression. Specifically, I showed that in embryonic stem cells, autonomous MusD retrotransposons are epigenetically suppressed to a greater degree than non-autonomous ETn retrotransposons, illustrated by a higher level of DNA methylation and a lower level of active histone modifications. I hypothesize that MusD elements may be silenced by DNA methylation and repressive chromatin spreading into the LTR from the CpG-rich internal retroviral sequence absent in ETn elements. I propose that internal structure largely devoid of high CG content enables ETn elements to evade host-imposed transcriptional repression, contributing to their high mutagenic activity in the mouse germline. / Medicine, Faculty of / Medical Genetics, Department of / Graduate

Die Gattung Beta gehört zur Familie der Chenopodiaceae und wird in die vier Sektionen Beta, Corollinae, Nanae und Procumbentes unterteilt, wobei die Zuckerrübe der Sektion Beta zugeordnet wird. Aus dem Genom der Zuckerrübe und verwandter Wildarten konnten bereits eine Vielzahl von repetitiven DNA-Familien kloniert und untersucht werden. Mit der monosomen Fragmentadditionslinie PRO1 stand eine Chromosomenmutante zur Verfügung, die neben den 18 B. vulgaris-Chromosomen ein Chromosomenfragment der Wildrübe Beta procumbens enthält. Da dieses als Minichromosom bezeichnete Fragment mitotische Stabilität aufweist, muss es ein funktionelles Centromer besitzen, das auch im genetischen Hintergrund von Beta vulgaris aktiv ist. Mit der Erstellung einer BAC (bacterial artifical chromosome)-Bank von PRO1 wurde die molekulare Charakterisierung von Ty3-gypsy-Retrotransposons eines einzelnen Wildrüben-Centromers möglich. Die für die Wildrübe Beta procumbens spezifischen Satellitenrepeats pTS5 und pTS4.1 dienten der Selektion von BACs aus der Centromer-Region des PRO1-Minichromosoms. Die Identifizierung eines unikalen genomischen Locus, mit einer Verschachtelung von zwei nicht homologen LTR-Retrotransposons, ermöglichte die gerichtete Isolation der LTR-Retrotransposons Beetle1 und Beetle2. Das Retrotransposon Beetle1 hat eine Gesamtlänge von 6736 bp und wird von LTR-Sequenzen begrenzt, die eine Länge von 1091 bp (5’-LTR) bzw. 1089 bp (3’-LTR) aufweisen. Das LTR-Retrotransposon Beetle2 weist mit 6690 bp eine ähnliche Gesamtlänge wie Beetle1 auf. Es wird von deutlich kürzeren LTR-Sequenzen mit einer Länge von 774 bp begrenzt. Aufgrund der Reihenfolge der Polyproteingene lassen sich Beetle1 und Beetle2 in die Gruppe der Ty3-gypsy-Retrotransposons (Metaviridae) einordnen. Beide Retrotransposon-Familien besitzen ein einziges offenes Leseraster (open reading frame; ORF) mit fusionierten gag- und pol-Genen. Datenbankrecherchen zeigten hohe Homologien von Beetle1 und Beetle2 mit den centromerischen Ty3-gypsy-Retrotransposons CRM aus Zea mays, CRR aus Oryza sativa und cereba aus Hordeum vulgare. Diese centromerischen Retrotransposons (CRs) sind in den Poaceae stark konserviert und stellen neben Satellitenrepeats eine hochabundante Sequenzklasse der Centromere der Süßgräser dar. Da sie im 3’-Bereich des gag-pol-Polyproteins eine Chromodomäne aufweisen, werden sie der eigenständigen Gruppe der Chromoviren zugeordnet. Chromodomänen sind zur Bindung von Proteinen und DNA befähigt und spielen eine wichtige Rolle in der Chromatin-Modifikation und der Bildung von Heterochromatin-Regionen. Beetle1 und Beetle2 besitzen Motive einer Chromodomäne, die vermutlich für eine gerichtete Transposition in die Centromer-Region verantwortlich ist. Neben der geringen Divergenz von Beetle1- und Beetle2-Sequenzen sowohl im Genom von Beta procumbens als auch in den anderen Arten der Sektion Procumbentes spricht auch das junge Alter von 100 000 bis 350 000 Jahren und die Transkriptionsaktivität für eine Einordnung dieser Ty3-gypsy-Retrotransposons in die Gruppe der Chromoviren. Sowohl die Southern-Hybridisierung als auch die Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung zeigten, dass Beetle1 und Beetle2 nur für die Sektion Procumbentes spezifisch sind und dort in hoher Kopienzahl vorkommen. Untersuchungen mit methylierungssensitiven Restriktionsendonukleasen veranschaulichten den hohen Grad an Cytosin-Methylierung von Beetle1 und Beetle2.

Die Gattung Beta gehört zur Familie der Chenopodiaceae und wird in die vier Sektionen Beta, Corollinae, Nanae und Procumbentes unterteilt, wobei die Zuckerrübe der Sektion Beta zugeordnet wird. Aus dem Genom der Zuckerrübe und verwandter Wildarten konnten bereits eine Vielzahl von repetitiven DNA-Familien kloniert und untersucht werden. Mit der monosomen Fragmentadditionslinie PRO1 stand eine Chromosomenmutante zur Verfügung, die neben den 18 B. vulgaris-Chromosomen ein Chromosomenfragment der Wildrübe Beta procumbens enthält. Da dieses als Minichromosom bezeichnete Fragment mitotische Stabilität aufweist, muss es ein funktionelles Centromer besitzen, das auch im genetischen Hintergrund von Beta vulgaris aktiv ist. Mit der Erstellung einer BAC (bacterial artifical chromosome)-Bank von PRO1 wurde die molekulare Charakterisierung von Ty3-gypsy-Retrotransposons eines einzelnen Wildrüben-Centromers möglich. Die für die Wildrübe Beta procumbens spezifischen Satellitenrepeats pTS5 und pTS4.1 dienten der Selektion von BACs aus der Centromer-Region des PRO1-Minichromosoms. Die Identifizierung eines unikalen genomischen Locus, mit einer Verschachtelung von zwei nicht homologen LTR-Retrotransposons, ermöglichte die gerichtete Isolation der LTR-Retrotransposons Beetle1 und Beetle2. Das Retrotransposon Beetle1 hat eine Gesamtlänge von 6736 bp und wird von LTR-Sequenzen begrenzt, die eine Länge von 1091 bp (5’-LTR) bzw. 1089 bp (3’-LTR) aufweisen. Das LTR-Retrotransposon Beetle2 weist mit 6690 bp eine ähnliche Gesamtlänge wie Beetle1 auf. Es wird von deutlich kürzeren LTR-Sequenzen mit einer Länge von 774 bp begrenzt. Aufgrund der Reihenfolge der Polyproteingene lassen sich Beetle1 und Beetle2 in die Gruppe der Ty3-gypsy-Retrotransposons (Metaviridae) einordnen. Beide Retrotransposon-Familien besitzen ein einziges offenes Leseraster (open reading frame; ORF) mit fusionierten gag- und pol-Genen. Datenbankrecherchen zeigten hohe Homologien von Beetle1 und Beetle2 mit den centromerischen Ty3-gypsy-Retrotransposons CRM aus Zea mays, CRR aus Oryza sativa und cereba aus Hordeum vulgare. Diese centromerischen Retrotransposons (CRs) sind in den Poaceae stark konserviert und stellen neben Satellitenrepeats eine hochabundante Sequenzklasse der Centromere der Süßgräser dar. Da sie im 3’-Bereich des gag-pol-Polyproteins eine Chromodomäne aufweisen, werden sie der eigenständigen Gruppe der Chromoviren zugeordnet. Chromodomänen sind zur Bindung von Proteinen und DNA befähigt und spielen eine wichtige Rolle in der Chromatin-Modifikation und der Bildung von Heterochromatin-Regionen. Beetle1 und Beetle2 besitzen Motive einer Chromodomäne, die vermutlich für eine gerichtete Transposition in die Centromer-Region verantwortlich ist. Neben der geringen Divergenz von Beetle1- und Beetle2-Sequenzen sowohl im Genom von Beta procumbens als auch in den anderen Arten der Sektion Procumbentes spricht auch das junge Alter von 100 000 bis 350 000 Jahren und die Transkriptionsaktivität für eine Einordnung dieser Ty3-gypsy-Retrotransposons in die Gruppe der Chromoviren. Sowohl die Southern-Hybridisierung als auch die Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung zeigten, dass Beetle1 und Beetle2 nur für die Sektion Procumbentes spezifisch sind und dort in hoher Kopienzahl vorkommen. Untersuchungen mit methylierungssensitiven Restriktionsendonukleasen veranschaulichten den hohen Grad an Cytosin-Methylierung von Beetle1 und Beetle2.

La méthylation de l’ADN et les modifications post-traductionnelles des histones sont desmodifications épigénétiques qui interviennent dans la régulation des éléments transposables(ET) chez de nombreuses espèces. La proportion des ET dans les génomes varie selon lesespèces considérées et pose la question des mécanismes de régulation de ces ET. Au sein del’espèce Drosophila simulans, les populations naturelles présentent un polymorphisme uniquedans le nombre de copies des ET, ce qui en fait un excellent modèle pour étudier cettequestion. L’étude de la méthylation d’ADN et des modifications post-traductionnelles deshistones associées au rétrotransposon à LTR tirant dans la lignée germinale des populationsnaturelles a permis de montrer l’influence d’une copie d’ET sur la structure de la chromatineau site d’insertion. Dans un second volet, nous avons cherché à caractériser la méthylation del’ADN chez la drosophile, chez laquelle la fonction est encore mal connue. Nous avons, pardes approches spécifiques et globales, mesuré l’abondance de cette marque épigénétique chezla drosophile. Nous concluons que les taux de méthylation de l’ADN sont très faibles maisvariables entre espèces. Notre travail n’a pas permis de mettre en évidence un rôle de laméthylation de l’ADN dans le contrôle des ET, toutefois, nous ne pouvons pas exclure cesystème de régulation. / Epigenetic modifications such as DNA methylation and post-translational histonemodifications are involved in transposable elements (TE) silencing in many species. Theirrelative abundance in genomes ask the question of differences in regulation mecanismbetween species. Within the Drosophila simulans species, natural populations exibits a uniquepolymorphism in TE copy number, providing a powerfull tool for the analysis of TEregulation in population from the same specie. We analyzed DNA methylation and posttranslationalhistone modifications associated with the LTR retrotransposon tirant in thegermline of natural populations and report the influence of this element on chromatinestructure. DNA methylation is a wide-conserved epigenetic modification involved in generegulation and TE silencing but its function in drosophila remains missunderstood. Usingdifferent methods, we determined the abundance of methylated cytosines in drosophila, andshowed that methylation level are low and variable between species. Our results show lowevidence for a TE regulation system involving DNA methylation but this cannot be so farexcluded.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:06:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_taciane_finatto.pdf: 5834731 bytes, checksum: e10f781234d54582cc17a9b8dff16c53 (MD5) Previous issue date: 2012-02-27 / Iron toxicity in plants is associated with the presence of large concentrations of reduced iron (Fe2+) in the soil solution, which occurs in flooded soils and affects rice plants grown under this condition. Symptoms of iron toxicity involve oxidative stress in leaves, as a response to excessive Fe2+ absorption by the roots. The responses of plants to stress conditions include stimulus perception, signal transduction and gene transcription activation. Besides gene expression, LTR (Long Terminal Repeat) retrotransposons represent ca. 22% of the rice genome, they can be transcriptionally activated under stress, and they can alter the expression of adjacent genes (e.g. due to alterations in chromatin structure). This study aimed to identify differentially expressed genes and LTR retrotransposons in leaves of 18-day-old rice seedlings (Oryza sativa ssp. japonica cv. Nipponbare) after four days of iron excess exposure. They were identified a differential expression of genes and LTR retrotransposons in rice exposed to iron excess using a microarray approach. Total RNA was extracted from leaves of 18-day-old rice seedlings (Oryza sativa L. ssp japonica cv. Nipponbare) after four days of cultivation in nutrient solution with iron excess (7 mM of FeSO47H2O) and in a control solution. The hybridization was performed with cDNA and rice transposome array v. 2.0 microarray (Roche/NimbleGen technology, an improvement of v.1.0, Picault et al., 2009). Data from gene expression was analyzed by the Bayesian t-test with BH adjustment method. Gene annotation, gene ontology, and LTR retrotransposon identification were performed at RAP-DB (Rice Annotation Project Database, build 5), and microarray results were validated by RT-qPCR. Considering log2 FC (log2-fold-change) ≤ -1 as underexpression and ≥ 1 as overexpression (p-values ≤ 0.05), 44 down-regulated and 1,572 up-regulated genes with described function were identified. Down-regulated genes were related to a wide range of functions and no gene family could be highlighted. Among the up-regulated genes, 166 were transcription factors, the most representative belonging to the Zinc finger RING/FYVE/PHD-type family (22) and WRKY family (19); other genes were from the kinase family, participating in biological processes of protein amino acid phosphorylation (86); had molecular function of iron ion binding (56); were involved in response to oxidative stress (scavenging of reactive oxygen species) (26); had molecular function of transport activity (84), including four genes related to heavy metal transport/detoxification and four genes of the multi antimicrobial extrusion protein MATE family; and were involved in the biological process of apoptosis (14), including 10 genes of NB-ARC. Among the up-regulated genes, 435 present at least one cis-regulatory element responsive to abscisic acid (ABA) with significant occurrence (P≤0.05) in its promoter region (1 kbp upstream of the transcription start site). These data indicate that about 28% of the up-regulated genes can be regulated by changing in the ABA content in leaves in response to iron excess. Regarding expression of LTR retrotransposons, 302 were down-regulated (53 Ty1/Copia, 172 Ty3/Gypsy and 77 unclassified), and 4342 up-regulated (466 Ty1/Copia, 2276 Ty3/Gypsy and 1600 unclassified). They were observed a large activity of LTR retrotransposons in response to iron toxicity, and furthermore, they were verified that LTR retrotransposons transcription can extend to 5' and 3' flanking regions. In addition, 16 situations that should up-regulated LTR retrotransposons are located at a very short distance (smaller than 1000 base pairs) in the same chromosome of up-regulated genes suggesting co-transcription, these occurrences are represented by eight where the LTR retrotransposon and the gene have the same sense of transcription (plus); five occurrences with the both with the same sense of transcription (minus) and one occurrence where they have opposite senses. Additionally, two occurrences that in which both, DNA sequences of up-regulated retrotransposon and gene, are overlapped and have the same sense of transcription. / A toxidez por ferro em plantas está associada com a presença de grandes concentrações de ferro (Fe) reduzido (Fe2+) na solução do solo, esta condição pode ocorrer em solos irrigados por inundação. Os sintomas de toxidez por ferro incluem estresse oxidativo nas folhas como resultado do excesso de Fe2+ absorvido pelas raízes, resultando em perdas na produtividade. As respostas das plantas às condições de estresse envolvem a percepção dos estímulos, transdução de sinais e ativação da transcrição gênica. Além da expressão gênica, os LTR retrotransposons (Long Terminal Repeat Retrotransposons) que respresentam cerca de 20% do genoma do arroz, podem ser transcricionalmente ativados em condições de estresse e desta forma, influenciar a expressão de genes adjacentes (por exemplo devido a alterações na estrutura da cromatina). Este estudo teve por objetivo identificar genes e LTR retrotransposons diferencialmente expressos em plântulas de arroz (Oryza sativa ssp. japonica cv. Nipponbare), após quatro dias de exposição ao excesso de ferro em solução nutritiva. A expressão diferencial de genes e LTR retrotransposons foi analisada utilizando a técnica de microarranjo e sua validação foi realizada por meio de RT-qPCR. O RNA total foi extraído de folhas de plântulas de arroz cv. Nipponbare, após quatro dias de cultivo em solução nutritiva adicionada de ferro na concentração de 7 mM (FeSO47H2O) (presença de toxidez) e a condição controle com presença de ferro na concentração de 10 μM. O cDNA fita dupla foi sintetitizado a partir do RNA mensageiro. A hibridização foi realizada entre o cDNA das duas condições em triplicatas biológicas e o microarranjo Rice Transposome Array v. 2.0 (Roche/NimbleGen technology, an improvement of v.1.0, Picault et al., 2009). Os valores de intensidade de cada spot foram normalizados, transformados e comparados pelo teste T Bayesiano. A identificação dos genes e LTR retrotransposons foi realizada de acordo com o banco de dados RAP-DB (Rice Annotation Project Database, build 5). Considerando log2 FC (log2-fold-change) ≤ -1 como subexpressão e ≥ 1 como superexpressão e P≤ 0.05 para ambas condições. Foram identificados 44 genes subexpressos e 1.572 superexpressos com funções descritas. Os genes subexpressos desempenham a uma vasta gama de funções. Entre elas destacam-se: 166 genes que são fatores de transcrição, sendo que os mais representativos pertencem à família Zinc finger RING/FYVE/PHD-type family (22 genes) e WRKY (19 genes); outros genes da família das cinases que participam também da sinalização celular em processos biológicos de fosforilação de aminoácidos nas proteínas (86 genes); outros genes com função molecular de ligação ao íon ferro (56 genes); 26 genes envolvidos na resposta ao estresse oxidativo (scavengers de espécies reativas de oxigênio); 84 genes com função molecular de transporte, incluindo quatro genes relacionados ao transporte e detoxificação de metais pesados e quatro genes da família MATE; 14 genes envolvidos em apoptose, incluindo 10 genes NB-ARC. Entre os genes superexpressos, 435 apresentam pelo menos um elemento regulatório de ação cis responsivo ao ácido abscisico (ABA) com ocorrência significativa (P≤0,05) em sua região promotora (1 kbp a montante do sítio de início da transcrição). Estes dados indicam que cerca de 28% dos genes superexpressos podem ser regulados pelas alterações no conteúdo de ABA nas folhas, em resposta ao estresse por excesso de ferro. Considerando a expressão do LTR retrotransposons, 302 apresentaram subexpressão (53 Ty1/Copia, 172 Ty3/Gypsy e 77 não classificados), e 4.342 apresentaram superexpressão (466 Ty1/Copia, 2276 Ty3/Gypsy e 1600 não classificados). Foi constatada grande atividade transcricional dos LTR retrotransposons em resposta à toxidez por ferro, sendo que a transcrição dos LTR retrotransposons pode se estender às suas regiões flanqueadoras 5 e 3 , além disso foram encontradas 16 ocorrencias em que o LTR retrotransposon e o gene superexpresso estão localizados a uma distância menor do que 1000 pares de bases no mesmo cromossomo, sugerindo co-transcrição entre ambos. Entre as 16 ocorrências, oito em que o LTR retrotransposon e o gene apresentam o mesmo sentido de transcrição (plus); cinco ocorrências com mesmo sentido de transcrição (minus) e uma ocorrência onde LTR retrotrotransposon e gene apresentam sentidos de transcrição opostos. Foram observadas ainda, duas ocorrências em que as sequencias de DNA do LTR retrotransposon e do gene superexpressos estão sobrepostas, e apresentam o mesmo sentido de transcrição.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:25:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_taciane_finatto.pdf: 5834731 bytes, checksum: e10f781234d54582cc17a9b8dff16c53 (MD5) Previous issue date: 2012-02-27 / Iron toxicity in plants is associated with the presence of large concentrations of reduced iron (Fe2+) in the soil solution, which occurs in flooded soils and affects rice plants grown under this condition. Symptoms of iron toxicity involve oxidative stress in leaves, as a response to excessive Fe2+ absorption by the roots. The responses of plants to stress conditions include stimulus perception, signal transduction and gene transcription activation. Besides gene expression, LTR (Long Terminal Repeat) retrotransposons represent ca. 22% of the rice genome, they can be transcriptionally activated under stress, and they can alter the expression of adjacent genes (e.g. due to alterations in chromatin structure). This study aimed to identify differentially expressed genes and LTR retrotransposons in leaves of 18-day-old rice seedlings (Oryza sativa ssp. japonica cv. Nipponbare) after four days of iron excess exposure. They were identified a differential expression of genes and LTR retrotransposons in rice exposed to iron excess using a microarray approach. Total RNA was extracted from leaves of 18-day-old rice seedlings (Oryza sativa L. ssp japonica cv. Nipponbare) after four days of cultivation in nutrient solution with iron excess (7 mM of FeSO47H2O) and in a control solution. The hybridization was performed with cDNA and rice transposome array v. 2.0 microarray (Roche/NimbleGen technology, an improvement of v.1.0, Picault et al., 2009). Data from gene expression was analyzed by the Bayesian t-test with BH adjustment method. Gene annotation, gene ontology, and LTR retrotransposon identification were performed at RAP-DB (Rice Annotation Project Database, build 5), and microarray results were validated by RT-qPCR. Considering log2 FC (log2-fold-change) ≤ -1 as underexpression and ≥ 1 as overexpression (p-values ≤ 0.05), 44 down-regulated and 1,572 up-regulated genes with described function were identified. Down-regulated genes were related to a wide range of functions and no gene family could be highlighted. Among the up-regulated genes, 166 were transcription factors, the most representative belonging to the Zinc finger RING/FYVE/PHD-type family (22) and WRKY family (19); other genes were from the kinase family, participating in biological processes of protein amino acid phosphorylation (86); had molecular function of iron ion binding (56); were involved in response to oxidative stress (scavenging of reactive oxygen species) (26); had molecular function of transport activity (84), including four genes related to heavy metal transport/detoxification and four genes of the multi antimicrobial extrusion protein MATE family; and were involved in the biological process of apoptosis (14), including 10 genes of NB-ARC. Among the up-regulated genes, 435 present at least one cis-regulatory element responsive to abscisic acid (ABA) with significant occurrence (P≤0.05) in its promoter region (1 kbp upstream of the transcription start site). These data indicate that about 28% of the up-regulated genes can be regulated by changing in the ABA content in leaves in response to iron excess. Regarding expression of LTR retrotransposons, 302 were down-regulated (53 Ty1/Copia, 172 Ty3/Gypsy and 77 unclassified), and 4342 up-regulated (466 Ty1/Copia, 2276 Ty3/Gypsy and 1600 unclassified). They were observed a large activity of LTR retrotransposons in response to iron toxicity, and furthermore, they were verified that LTR retrotransposons transcription can extend to 5' and 3' flanking regions. In addition, 16 situations that should up-regulated LTR retrotransposons are located at a very short distance (smaller than 1000 base pairs) in the same chromosome of up-regulated genes suggesting co-transcription, these occurrences are represented by eight where the LTR retrotransposon and the gene have the same sense of transcription (plus); five occurrences with the both with the same sense of transcription (minus) and one occurrence where they have opposite senses. Additionally, two occurrences that in which both, DNA sequences of up-regulated retrotransposon and gene, are overlapped and have the same sense of transcription. / A toxidez por ferro em plantas está associada com a presença de grandes concentrações de ferro (Fe) reduzido (Fe2+) na solução do solo, esta condição pode ocorrer em solos irrigados por inundação. Os sintomas de toxidez por ferro incluem estresse oxidativo nas folhas como resultado do excesso de Fe2+ absorvido pelas raízes, resultando em perdas na produtividade. As respostas das plantas às condições de estresse envolvem a percepção dos estímulos, transdução de sinais e ativação da transcrição gênica. Além da expressão gênica, os LTR retrotransposons (Long Terminal Repeat Retrotransposons) que respresentam cerca de 20% do genoma do arroz, podem ser transcricionalmente ativados em condições de estresse e desta forma, influenciar a expressão de genes adjacentes (por exemplo devido a alterações na estrutura da cromatina). Este estudo teve por objetivo identificar genes e LTR retrotransposons diferencialmente expressos em plântulas de arroz (Oryza sativa ssp. japonica cv. Nipponbare), após quatro dias de exposição ao excesso de ferro em solução nutritiva. A expressão diferencial de genes e LTR retrotransposons foi analisada utilizando a técnica de microarranjo e sua validação foi realizada por meio de RT-qPCR. O RNA total foi extraído de folhas de plântulas de arroz cv. Nipponbare, após quatro dias de cultivo em solução nutritiva adicionada de ferro na concentração de 7 mM (FeSO47H2O) (presença de toxidez) e a condição controle com presença de ferro na concentração de 10 μM. O cDNA fita dupla foi sintetitizado a partir do RNA mensageiro. A hibridização foi realizada entre o cDNA das duas condições em triplicatas biológicas e o microarranjo Rice Transposome Array v. 2.0 (Roche/NimbleGen technology, an improvement of v.1.0, Picault et al., 2009). Os valores de intensidade de cada spot foram normalizados, transformados e comparados pelo teste T Bayesiano. A identificação dos genes e LTR retrotransposons foi realizada de acordo com o banco de dados RAP-DB (Rice Annotation Project Database, build 5). Considerando log2 FC (log2-fold-change) ≤ -1 como subexpressão e ≥ 1 como superexpressão e P≤ 0.05 para ambas condições. Foram identificados 44 genes subexpressos e 1.572 superexpressos com funções descritas. Os genes subexpressos desempenham a uma vasta gama de funções. Entre elas destacam-se: 166 genes que são fatores de transcrição, sendo que os mais representativos pertencem à família Zinc finger RING/FYVE/PHD-type family (22 genes) e WRKY (19 genes); outros genes da família das cinases que participam também da sinalização celular em processos biológicos de fosforilação de aminoácidos nas proteínas (86 genes); outros genes com função molecular de ligação ao íon ferro (56 genes); 26 genes envolvidos na resposta ao estresse oxidativo (scavengers de espécies reativas de oxigênio); 84 genes com função molecular de transporte, incluindo quatro genes relacionados ao transporte e detoxificação de metais pesados e quatro genes da família MATE; 14 genes envolvidos em apoptose, incluindo 10 genes NB-ARC. Entre os genes superexpressos, 435 apresentam pelo menos um elemento regulatório de ação cis responsivo ao ácido abscisico (ABA) com ocorrência significativa (P≤0,05) em sua região promotora (1 kbp a montante do sítio de início da transcrição). Estes dados indicam que cerca de 28% dos genes superexpressos podem ser regulados pelas alterações no conteúdo de ABA nas folhas, em resposta ao estresse por excesso de ferro. Considerando a expressão do LTR retrotransposons, 302 apresentaram subexpressão (53 Ty1/Copia, 172 Ty3/Gypsy e 77 não classificados), e 4.342 apresentaram superexpressão (466 Ty1/Copia, 2276 Ty3/Gypsy e 1600 não classificados). Foi constatada grande atividade transcricional dos LTR retrotransposons em resposta à toxidez por ferro, sendo que a transcrição dos LTR retrotransposons pode se estender às suas regiões flanqueadoras 5 e 3 , além disso foram encontradas 16 ocorrencias em que o LTR retrotransposon e o gene superexpresso estão localizados a uma distância menor do que 1000 pares de bases no mesmo cromossomo, sugerindo co-transcrição entre ambos. Entre as 16 ocorrências, oito em que o LTR retrotransposon e o gene apresentam o mesmo sentido de transcrição (plus); cinco ocorrências com mesmo sentido de transcrição (minus) e uma ocorrência onde LTR retrotrotransposon e gene apresentam sentidos de transcrição opostos. Foram observadas ainda, duas ocorrências em que as sequencias de DNA do LTR retrotransposon e do gene superexpressos estão sobrepostas, e apresentam o mesmo sentido de transcrição.estresse oxidativo (scavengers de espécies reativas de oxigênio); 84 genes com função molecular de transporte, incluindo quatro genes relacionados ao transporte e detoxificação de metais pesados e quatro genes da família MATE; 14 genes envolvidos em apoptose, incluindo 10 genes NB-ARC. Entre os genes superexpressos, 435 apresentam pelo menos um elemento regulatório de ação cis responsivo ao ácido abscisico (ABA) com ocorrência significativa (P≤0,05) em sua região promotora (1 kbp a montante do sítio de início da transcrição). Estes dados indicam que cerca de 28% dos genes superexpressos podem ser regulados pelas alterações no conteúdo de ABA nas folhas, em resposta ao estresse por excesso de ferro. Considerando a expressão do LTR retrotransposons, 302 apresentaram subexpressão (53 Ty1/Copia, 172 Ty3/Gypsy e 77 não classificados), e 4.342 apresentaram superexpressão (466 Ty1/Copia, 2276 Ty3/Gypsy e 1600 não classificados). Foi constatada grande atividade transcricional dos LTR retrotransposons em resposta à toxidez por ferro, sendo que a transcrição dos LTR retrotransposons pode se estender às suas regiões flanqueadoras 5 e 3 , além disso foram encontradas 16 ocorrencias em que o LTR retrotransposon e o gene superexpresso estão localizados a uma distância menor do que 1000 pares de bases no mesmo cromossomo, sugerindo co-transcrição entre ambos. Entre as 16 ocorrências, oito em que o LTR retrotransposon e o gene apresentam o mesmo sentido de transcrição (plus); cinco ocorrências com mesmo sentido de transcrição (minus) e uma ocorrência onde LTR retrotrotransposon e gene apresentam sentidos de transcrição opostos. Foram observadas ainda, duas ocorrências em que as sequencias de DNA do LTR retrotransposon e do gene superexpressos estão sobrepostas, e apresentam o mesmo sentido de transcrição.