L'analyse directe de tissus par spectrométrie de masse MALDI est une approche en développement particulièrement importante pour l'analyse de biopsies. Elle offre l'intérêt de s'affranchir de l'extraction, de la purification et de la préparation des échantillons. De plus, elle permet d'obtenir la localisation de composés au sein du tissu puisque l'analyse est réalisée in situ par le balayage automatisé avec le faisceau laser conduisant à la création d'une matrice (intensité du signal vs coordonnées X/Y) qui pourra ensuite être visualisée sous forme d'image à l'aide d'un outil bioinformatique. Dans ce but, et en vue d'accéder aux données indépendamment du constructeur et de connaître les paramètres de calcul, le logiciel MITICS a été développé au cours de cette thèse. Pour illustrer son fonctionnement, nous avons comparé des études sur le protéome au niveau de l'embryon de sangsue médicinale et de l'adulte afin de rechercher des peptides présents chez l'embryon et se re-exprimant chez l'adulte lors de la régénération nerveuse. Ces travaux ont ensuite été confrontés aux études réalisées chez des animaux traités au 6-OHDA mimant la maladie de Parkinson. La recherche de biomarqueurs et la réalisation de carte moléculaire en liaison avec la pathologie devait également permettre la corrélation entre la présence de biomarqueurs issus de la réexpression d'éléments embryonnaires. Puis il fallait donner un nom aux peptides identifiés. Pour cela j'ai participé à l'annotation des EST du système nerveux de la sangsue médicinale grâce auxquels se fera à l'avenir la corrélation de l'image au nom de la biomolécule identifiée pour mieux appréhender sa fonction / Direct analysis of tissues by MALDI mass spectrometry is a growing approach, and very important especially conceming biopsy analysis. It offers the interest to avoid extraction, purification and preparation of the sample. Moreover it allows to get additional information by preserving composite localization in the tissue thanks to the analysis realized in situ by a laser beam scan. The automation ofthis scan enables creation ofa matrix (signal intensity versus X y coordinates); thus data conversion by bioinformatics' software is the keystone of this technology. Access to direct data, independently from the manufacturer, accessibility to computing parameters allowing the creation of the picture and transparency have been our priorities during the creation of our new imaging software: MITrCS. ln order to illustrate the efficiency of this pro gram, the survey of the medicinal leech embryos proteome versus medicinal leech adult proteome was undertaken in order to search peptides presents in the embryo that are re-expressed in the adult during nervous regeneration. This work on this invertebrate has next been compared to studies realized on 6hydroxydopamin-treated animaIs in order to simulate Parkinson disease. Research of biomarkers and achievement of a molecular map linked with the Parkinson pathology should allow a correlation between biomarkers from nervous regeneration. But identified peptides still needs to be named, so 1 participated to the annotation of medicinal leech nervous system EST. Thanks to these EST, it williater be possible with MITrCS to correlate the picture to the name of the identified biomolecule in order to better apprehend its function.

Ces travaux de recherche s'inscrivent dans le cadre du développement de nouvelles surfaces biocompatibles capables de contrôler l'adhésion d'agents pathogènes responsables de maladies neurodégénératives telles que les maladies de Creutzfeld Jacob, Alzheimer, Parkinson et Lewis. Deux axes de recherche ont été privilégiés. Notre approche se focalise en amont des dosages sur l'amélioration des procédures de stockage des prélèvements biologiques réalisés dans des tubes de type Eppendorf. Ces tubes en polypropylène induisent une perte du matériel génétique de plus de 70% accentuant la faible concentration en agent pathogène pour la détection immunoenzymatique. Dans le but de réduire les phénomènes indésirables d'adhésion des agents pathogènes à la surface des supports de stockage, deux voies de traitement ont été envisagées dans ce travail de thèse. La première consiste à modifier la surface du tube Eppendorf en une étape par décharge plasma fluoré, la seconde à créer de nouvelles surfaces hydrophiles en deux étapes couplant la technique des plasmas froids au greffage de polymères, les agents pathogènes pouvant être hydrophiles ou hydrophobes. Avec cette dernière technique, une voie originale a été abordée de part l'utilisation de solutions de greffage complexes composées à la fois de polymères et de molécules tensioactives. Les surfaces ainsi obtenues présentent une nano-structuration. Toutes les étapes de modification de la surface interne des tubes de stockage ont été caractérisées. Ces surfaces sont alors décrites selon leur caractère hydrophile ou hydrophobe grâce à la détermination des énergies de surface polaire et apolaire, selon leur charge de surface obtenue par mesure du potentiel d'écoulement, selon leur composition chimique déterminée par spectroscopie à photoélectrons X (XPS) et enfin selon leur topographie et leur rugosité relevées par microscopie à force atomique (AFM). Les interactions entre les groupements fonctionnels ainsi obtenus à la surface des tubes de stockage après les divers traitements et les protéines antigéniques considérées ont été interprétées en se référant aux différents modèles de l'adhésion pour des gammes de pH proches des protocoles biologiques usuels. Afin de s'assurer que ces nouvelles surfaces permettent bien une diminution de l'adhésion des agents infectieux sur la paroi interne des tubes de polypropylène, des analyses immunoenzymatiques ont été réalisées au sein des centres hospitaliers participant au projet STREP NEUROSCREEN n° LSHB-CT 2006-03 7719 (CRPP de Liège et CHU de Lyon). Ces analyses ont permis de montrer que la modification des surfaces entraîne une diminution de l'absorption des agents pathogènes jusqu'à 100% permettant ainsi une meilleure détection.

Les maladies à prions et d’Alzheimer appartiennent à un groupe de maladies neurodégénératives caractérisées par l’accumulation dans le système nerveux central (SNC) de protéines amyloïdes, respectivement la PrPSc et les peptides Aβ. Même si ces maladies ont des étiologies et des manifestations physiopathologiques distinctes, il est suspecté que des mécanismes communs de neurodégénérescence puissent être mobilisés dans ces différentes affections du SNC. Les maladies à prions s’imposent comme un paradigme qui permet l’étude des maladies neurodégénératives amyloïdes. Disposer d’un agent infectieux, la protéine prion scrapie, PrPSc, présente l’avantage de pouvoir initier un processus neurodégénératif et de cerner la nature et la séquence des événements menant à la perte d’homéostasie neuronale. Les mécanismes mis en évidence grâce à l’infection à prions peuvent être objectivés dans d’autres maladies neurodégénératives. Dans les maladies à prions, il est clairement établi que la PrPSc exerce sa toxicité dans les neurones en déviant la/les fonction(s) de la forme non pathologique des prions, la protéine prion cellulaire, PrPC. Les travaux du laboratoire ont permis d’assigner une fonction de signalisation à la PrPC et d’identifier plusieurs intermédiaires de signalisation contrôlés par la PrPC, ce qui a conduit à proposer plusieurs rôles pour la PrPC dans les neurones : régulation de l’équilibre d’oxydoréduction, adhérence, neuritogenèse, survie, contrôle des fonctions associées au neuromédiateur. Une partie de mes travaux de thèse a permis d’illustrer une nouvelle facette de la PrPC dans le contrôle des fonctions neuronales. Au travers d’un couplage à la kinase Lyn et d’une interaction avec la protéine LRP1 et le cuivre, la PrPC du corps cellulaire gouverne l’état d’activation de la kinase GSK3β, qui à son tour, contrôle le trafic et l’activité d’un autorécepteur sérotoninergique, le récepteur 5HT1B. En modulant l’activité de ce récepteur, la PrPC favorise la neurotransmission. A partir de l’infection à prions, mes travaux dévoilent des mécanismes de neurodégénérescence communs aux maladies à prions et à la maladie d’Alzheimer (AD). Dans les neurones infectés par les prions, comme les neurones dérivés de souris modèles pour AD, la suractivation de la kinase PDK1 provoque la phosphorylation et l’internalisation de l’αsécrétase TACE, ce qui annule l’activité neuroprotectrice de TACE à la membrane plasmique. TACE internalisée est découplée de trois de ses substrats, (i) la PrPC, ce qui favorise sa conversion en PrPSc, (ii) la protéine précurseur des peptides amyloïdes APP, ce qui augmente la production des peptides neurotoxiques Aβ et (iii) les récepteurs au TNFα, ce qui rend les neurones malades vulnérables au stress inflammatoire. In vitro comme in vivo, l’inhibition de PDK1 permet de rétablir l’activité neuroprotectrice de TACE et de contrecarrer les effets neurotoxiques de la PrPSc ou de Aβ. Mes travaux établissent également que les Rho kinases (ROCK) sont des régulateurs positifs de l’activité de PDK1. Dans un contexte physiologique, les ROCK interagissent avec PDK1 et phosphorylent PDK1, contribuant à son activité basale. Dans un contexte infectieux, le gain d’activité des ROCK augmente le « pool » de molécules de PDK1 qui interagissent avec et sont phosphorylées par les ROCK, à l’origine de la suractivation de PDK1. Inhiber les ROCK exerce un double effet protecteur dans les neurones infectés par les prions en abaissant le niveau de PrPSc via le module de signalisation PDK1TACE et en préservant la polarité et la connectivité des neurones par action sur le cytosquelette d’actine. Le module ROCKPDK1 émerge comme une cible thérapeutique potentielle pour les maladies à prions et autres maladies neurodégénératives amyloïdes. / Pas de résumé en anglais

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L’adénosine est un neuromodulateur ubiquitaire impliqué dans différents processus physiologiques et neuroprotecteurs du système nerveux central. Elle agit via quatre sous-types de récepteurs couplés à protéine G (A1, A2a, A2b et A3). Le récepteur A2a (A2aR) est fortement exprimé dans des régions riches en dopamine, avec de fortes concentrations dans la zone du caudate-putamen du cerveau, où elle a un rôle important dans la transmission neuronale et dans le processus dégénératif d’origine extrapyramidale. Ainsi, le blocage du récepteur A2a s’est révélé être une cible prometteuse pour le traitement des maladies neurodégénératives tels la Maladie de Parkinson (MP) et la Maladie d’Alzheimer (MA). A ce jour, seulement trois composés sont en phase clinique dans le cadre du traitement de la MP. Toutefois, bien que très affins, ils ne possèdent pas des propriétés ADME ou une sélectivité optimales.Au début de ce projet, la sous-structure Tic-hydantoïne a été identifiée comme présentant une bonne affinité pour A2aR. Après étude des fonctions manquantes de cette molécule et en respectant les éléments pharmacophoriques nécessaires pour une bonne activité, nous avons imaginé et évalué dans la structure co-cristallisé du A2aR et du ligand antagoniste de référence ZM241385 différentes modulations autour de l’hétérocycle. Ceci a permis de proposer la famille des Tic-guanidines, qui présente une fonction donneur de liaison hydrogène avec le résidu Asn253 du site et qui a été synthétisé après optimisation d’un chemin synthétique original. De plus, 1700 molécules ont été conçues de novo et évaluées in silico. Parmi les familles potentiellement intéressantes, deux d’entre elles, les quinolizidinones et les amino-imidazopyridines ont été synthétisées et évaluées in vitro afin de déterminer leur affinité vis-à-vis le récepteur A2a ainsi que leur cytotoxicité vis-à-vis les cellules neuronales. / Adenosine is a ubiquitous neuromodulator able to regulate many physiological processes and plays an important neuroprotective role in the central nervous system. Its effects are transmitted by four distinct G protein receptor subtypes designated A1, A2a, A2b, and A3. A2a receptors (A2aR) show a restricted distribution, being characteristic of the dopamine enriched areas, the highest concentration being in the caudate-putamen in brain, where it has an important role in neuronal signaling with this region and potential involvement in neurologic disease of extrapyramidal origin.A2a antagonism was shown to be a promising pharmacological target for neurodegenerative diseases such as Parkinson’s disease (PD) and Alzheimer disease (AD). Currently, only three compounds are still in clinical phase for PD treatment. Even if they show good affinities for the receptor, there is still a need for improving their ADME properties by keeping their selectivity towards other adenosine receptors.At the beginning of this project, a Tic-hydantoin derivative was identified as a new ligand with a good affinity for the A2a receptor. Based on the recently published crystalline structure of the A2A receptor complexed with the selective and high-affinity antagonist ZM241385 and a pharmacophoric model, we identified the missing features needed for a good affinity in our molecule. We designed and evaluated in silico many pharmacomodulations around the heterocyclic ring and Tic-guanidin substructure was proposed to present favorable hydrogen bound with Asn253 of the A2a binding site. This structure was obtained after optimization of a new synthetic pathway. Moreover, 1700 molecules were originally designed and evaluated in silico. Among potential interesting families, two of them, quinolizidinones and amino-imidazopyridines were synthesized and evaluated in vitro toward their affinity for A2a receptor and their cytotoxicity towards neuronal cells.

La contamination des ressources en eau potable et des terres agricoles par les pesticides qui entrent dans la chaine alimentaire est un problème environnemental et sanitaire majeur. Des études épidémiologiques ont montré un lien entre l’exposition aux pesticides et la maladie de Parkinson, mais peu d’études sont disponibles sur les autres pathologies neurodégénératives. Notre hypothèse est que les pesticides pourraient être des facteurs déclencheurs ou aggravants, communs aux maladies neurodégénératives.Au laboratoire, nous avons identifié par criblage sur la protéine prion, PrP, un composé nommé A6 décrit pour ses propriétés herbicides. A6 est un dérivé de l’α-terthiényl, molécule naturelle extraite des œillets d’inde. Le composé A6 a la capacité de promouvoir des formes oligomériques de la protéine prion sur une lignée cellulaire infectée par des prions. Mon projet de recherche visait à étudier les effets du bio-herbicide A6 sur l’agrégation et la propagation des prions in vivo. Des souris infectées par les prions ont été traitées avec différentes doses de cette molécule (5, 10 et 20 mg/kg). A la dose de 5 mg/kg, le composé A6 diminue le temps de survie des animaux avec une augmentation de la charge amyloïde. Tandis qu’aux plus fortes doses le traitement par A6 augmente la survie des souris avec une diminution de la charge amyloïde. Par un test de centrifugation rapide (RCA), nous avons montré que les faibles concentrations d’A6 favorisent la formation d’oligomères solubles de PrPSc SDS résistants (rSDS-PrPSc), alors que les plus fortes concentrations induisent des formes insolubles. L’analyse des cerveaux montre que seules les souris traitées avec 10 et 20 mg/kg d’A6 présentent des formes dimériques de rSDS-PrPSc. Cette étude montre une dualité d’effet du composé A6 : à de faibles doses, il favorise la pathologie probablement via des formes oligomériques solubles favorisant la réplication des prions. A de plus fortes doses, le composé A6 piègerait une partie de l’infectiosité des prions sous forme d’agrégats amorphes SDS résistants, bloquant la réplication des prions, et ayant un effet « protecteur ».Une recherche d’analogues structurels au composé A6 a permis l’identification d’une classe d’antifongiques commercialisés : les anilinopyrimidines. Cette famille est composée de 3 molécules : cyprodinil, mépanipyrim et pyriméthanil, qui luttent contre des champignons responsables de la pourriture grise des fruits. L’analyse de nombreux rapports a révélé que nous sommes chroniquement exposés à des résidus d’anilinopyrimidines. Dans cette deuxième étude, nous avons étudié l’effet de ces 3 fongicides dans plusieurs modèles de la maladie d’Alzheimer (MA) et les conséquences sur les marqueurs de la pathologie. Des études d’incubation ex vivo associées à des expériences de cinétique d’agrégation de peptides Aβ1-42 ont montré que ces composés interagissent directement avec les peptides et accélèrent sa cinétique d’agrégation. Afin de déterminer leurs effets in vivo, nous avons exposé chroniquement des souris J20 à un cocktail des 3 fongicides via l’eau de boisson. Les souris ont été traitées à 0,1 μg/L (0,44 nM) de chaque composé, correspondant à la concentration maximale autorisée dans l’eau potable. Après 9 mois de traitement, l’analyse des souris J20 a montré une augmentation du nombre et de la surface des plaques amyloïdes au niveau de l’hippocampe et du cortex. Pour déterminer à quel moment se produit l’effet proagrégant du cocktail, une étude longitudinale d’apparition des agrégats à 3, 6 et 9 mois par microscopie biphotonique, a montré que les plaques amyloïdes augmentent entre 6 et 9 mois et que les pesticides exacerbent les agrégats vasculaires. Les anilinopyrimidines modifient la production et la clairance des peptides Aβ en augmentant l’expression de BACE1 et en diminuant l’expression de la néprilysine. Nos travaux montrent que les antifongiques aggravent la MA. / Contamination of the drinking water and agricultural lands by the use of pesticides entering into the food chain is a major environmental and health problem. Epidemiological studies have shown a link between pesticide exposure and Parkinson's disease, but few studies are available on other neurodegenerative disorders. Our hypothesis is that pesticides may be triggering or aggravating factors common to neurodegenerative diseases.In the laboratory, we identified by a screening on the prion protein, PrP, a compound named A6 described for its herbicidal properties. A6 is a derivative of α-terthienyl, a natural molecule extracted from marigolds. A6 compound has the ability to promote oligomeric forms of the prion protein on a prion-infected cell line. My research project aimed to study the effects of the bioherbicide A6 on prion aggregation and propagation in vivo. Mice infected with prions were treated with different doses of this molecule (5, 10 and 20 mg/kg). At the dose of 5 mg/kg, A6 compound decreases the survival time of animals with an increase of the amyloid load. While at the higher doses, A6 treatment increases survival of mice with a decreased amyloid burden. Using a rapid centrifugation assay (RCA), we have shown that low concentrations of A6 promote soluble SDS-resistant oligomers of PrPSc (rSDS-PrPSc), while higher concentrations favour insoluble forms. Brain analysis shows that only mice treated with 10 and 20 mg/kg of A6 exhibit dimeric forms of rSDS-PrPSc. This study shows a dual effect of A6 compound: at low doses, it strenghtens the pathology probably via soluble oligomeric forms favouring the replication of prions. At higher doses, A6 compound would trap part of the infectivity of prions as SDS resistant amorphous aggregates, blocking prion replication, and thus having a “protective” effectA search for structural analogs of A6 compound allowed the identification of a class of commercial antifungals: anilinopyrimidines. This family is composed of 3 molecules: cyprodinil, mepanipyrim and pyrimethanil, used to fight against fungi responsible for the gray mold of fruits. Analysis of many reports have revealed that we are chronically exposed to residues of anilinopyrimidines. In this second study, we evaluated the impact of the 3 fungicides in several models of Alzheimer’s disease (AD) and their consequences on pathological markers. Ex vivo incubation studies associated to kinetics of fibril formation of Aβ1-42 peptides have shown that these compounds interact directly with Aβ peptides and accelerate its kinetics of aggregation. To determine their effects in vivo, we chronically exposed J20 mice to a cocktail of the 3 fungicides through drinking water. Mice were treated with 0.1 μg/L (0.44 nM) of each compound, corresponding to the maximal concentration allowed in the tap water. After 9 months of treatment, analysis of J20 mice showed an increase in the number and surface of plaques in the hippocampus and cortex. To determine the moment when the pro-aggregative effect occurs, a longitudinal study of appearance of aggregates at 3, 6 and 9 months by 2-photon microscopy was done. Our results showed that amyloid plaques increase between 6 and 9 months, and exacerbate vascular amyloid aggregates. Anilinopyrimidines modified the production and clearance of Aβ peptides by increasing BACE1 expression and by decreasing neprilysin expression. Our researches show a role of fungicides in the aggravation of AD.

Le système nerveux consiste en plusieurs types cellulaires quels interagissent avec eux-mêmes pour conduire des potentiels d’action du soma au travers l’axone vers la synapse. Dans les nerfs périphériques, les cellules de Schwann interagissent avec les neurones par enrouler autour l’axone et créer une gaine de myéline. Cette gaine de myéline permit une conduction rapide des potentiels d’action de nœud de Ranvier vers nœud de Ranvier, quels sont petits régions non-myélinisés de l’axone. En plus, les cellules de Schwann transportent du lactate vers le neurone et le neurone utilise ce lactate pour la production d’énergie sous la forme d’ATP. Cette production est nécessaire, parce que beaucoup de processus dans des cellules, comme la conduction des potentiels d’action, ont besoin d’ATP. Trois mécanismes sont impliqués à la production d’ATP : la glycolyse dans le cytosol et le cycle de Krebs et la chaîne de transport d'électrons dans les mitochondries. Par contre, la production d’ATP par des mitochondries résulte en la production du dérivés réactifs de l'oxygène (DRO), quels provoquent du stress oxydative. DRO peuvent être présent en plusieurs formes et ces formes différentes ont des traits spécifiques, mais tous les formes peuvent endommager la cellule. Par exemple, l’ion superoxyde est très réactif donc ils agissent extrêmement vite avec les molécules dans son environnement. Par contre, peroxyde d'hydrogène est un type de DRO quel est moins réactif, mais peut diffuser à plus longue distances et peut oxyder des cibles plus distales. Heureusement, les cellules sont équipées avec un système antioxydant compétant en consistent une groupe d’enzymes antioxydant, quels réduisent du DRO à l’eau. Si les mitochondries dysfonctionnent ou si l’équilibre entre DRO et antioxydants devient en disbalance, des neuropathies pourraient se développer, comme sclérose latérale amyotrophique (SLA), sclérose en plaques (SEP), maladie d'Alzheimer et maladie de Parkinson. Au SNP, des neuropathies périphériques comme la maladie Charcot-Marie-Tooth (CMT) peuvent se développer en raison d’excès du DRODans cette thèse, je présente un modèle élaboré pour la production d’ATP et DRO par les mitochondries in vivo. Je montrerai comment les cellules de Schwann utilisent l’effet Warburg, la transition de métabolisme de phosphorylation oxydative à glycolyse, pour la production de lactate, quel est transporté vers le neurone pour la production d’énergie. Je montrerai aussi que sans l’effet Warburg dans des cellules de Schwann, le métabolisme neuronal est détérioré menant à la production d’ATP diminué, déficits neuronales et des problèmes moteurs. Suite à l’activité nerveuse, la production d’ATP par des mitochondries augmente, mais aussi la production de DRO. Pourtant les deux productions ne sont pas en parallèle. En plus, je montre que la physiologie mitochondriale est affectée par des neuropathies. Aux souris avec défectueux mitofusin2, un modèle pour CMT2A, le contact entre le réticulum endoplasmique et les mitochondries est diminué, à côté d’un changement de morphologie et fonction mitochondriale. En plus, démyélinisation résulte dans des déficits de la production ATP et DRO, montrent une dissociation pathologique entre la production d’ATP et DRO.Pour obtenir ces résultats, des techniques d'imagerie avancées étaient utilisé pour imager les nerfs périphériques des souris transgéniques. Ces transgènes sont introduit dans les souris par injection des vecteurs virales, quels induisent l’expression des sondes fluorescents dans les cellules neuronales. Ces sondes fluorescentes étaient détectées par microscopie multiphotonique. En plus du modèle de la production d’ATP et DRO dans des nerfs périphériques, je présente un protocole pour introduire des vecteurs viraux dans le nerf sciatique. / The nervous system consists of several cell types that interact with each other in order to conduct action potentials from the neuronal soma through axons to the synapse. In peripheral nerves, Schwann cells interact with neurons by wrapping around the axon and creating a myelin sheath. This myelin sheath allows for fast conduction of action potentials from node of Ranvier to node of Ranvier, which are small unmyelinated areas of the axon. In addition, Schwann cells transfer lactate to the neuron, which the axonal mitochondria use to produce energy in the form of ATP. This is necessary, because many cellular processes, such as the conduction of action potentials use ATP. The production of ATP involves three mechanisms: anaerobic glycolysis in the cytosol and the Kreb’s cycle and electron transport chain within mitochondria. However, the production of ATP by mitochondria also results in the production of reactive oxygen species (ROS), which cause cell damage. ROS can be present in several different forms and these different forms have specific properties. For example, superoxide anions are highly reactive and subsequently react rapidly with the molecules in their environment. Hydrogen peroxide on the other hand is less reactive but hence can diffuse over longer distances and react with their targets more distally. Fortunately, the cell contains a competent antioxidant system, which can reduce ROS to water. When mitochondria malfunction or when the equilibrium between ROS and antioxidants becomes in disbalance, neuropathies can develop, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), multiple sclerosis (MS), Alzheimer’s disease or Parkinson’s disease. In the PNS, peripheral neuropathies can develop such as Charcot-Marie-Tooth disease as a result from an excess of ROS.In this thesis, I will provide an elaborate model for ATP and ROS production by axonal mitochondria in vivo. I will show how Schwann cells use the Warburg effect, the shift in metabolism from oxidative phosphorylation to anaerobic glycolysis, to produce lactate, which is then transported to the neuron for energy production. I also demonstrate that without the Warburg effect in Schwann cells neuronal metabolism would be impaired, leading to impaired ATP production, neuronal deficits and motor problems. Following action potential firing, not only ATP is produced by mitochondria, but also ROS, although with independent dynamics. In addition, I show that mitochondrial physiology is affected by several neuropathologies. In mitofusin2 deficient mice, a model for CMT2A, contact between the endoplasmic reticulum and mitochondria is impaired next to affected mitochondrial morphology and function. Also demyelination causes deficits in mitochondrial ATP and ROS production, showing a pathologic decoupling between ATP and ROS.To obtain these results, advanced imaging techniques were used to image peripheral nerves of transgenic mice. These transgenes were introduced in mice via injection of viral vectors which induce expression of fluorescent probes in neuronal cells. These fluorescent probes were detected via multiphoton microscopy. Next to the model for ATP and ROS production in peripheral nerves, I provide a protocol for introducing viral vectors into mouse sciatic nerves.

La conversion de la protéine prion cellulaire (PrPC) en protéine prion scrapie (PrPSc) est à l’origine des encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST). La toxicité de la PrPSc est restreinte aux neurones et implique la déviation de la (des) fonction(s) de la PrPC. Une action neurospécifique de la PrPC est le recrutement de la src kinase Fyn. Dans ce travail, nous montrons que la PrPC est capable de mobiliser une autre src kinase, Lyn, via la cavéoline (cav) dans les neurones. Une cible du couplage PrPC-cav-Lyn, restreint aux corps cellulaires, est la kinase GSK3ß. L’inactivation de GSK3ß par la PrPC intervient dans la régulation des fonctions neuronales, en limitant l’activité du récepteur sérotoninergique 1B. D’autre part, nous montrons que dans les cellules infectées par les prions, l’accumulation de PrPSc induit le recrutement constitutif de la plateforme PrPC-cav-Fyn, à l’origine d’un stress oxydant. Ce gain de fonction entraine notamment un défaut de clivage par la metalloprotéase MMP-9, dont une des conséquences est l’accumulation du peptide Aß. Un autre impact de l’infection est la suractivation de la kinase PDK1, qui génère une perte de fonction de la metalloprotéase TACE. Dans des neurones « Alzheimer », on observe également cette cascade délétère, qui dépend de la PrPC. L’inhibition de PDK1 dans des modèles d’infection par les prions ou de maladie d’Alzheimer permet de rétablir l’activité d’alpha-clivage de TACE vis-à-vis de ses substrats, la PrPC, APP et le récepteur au TNF-alpha. L’effet bénéfique observé in vivo permet de définir PDK1 comme une cible thérapeutique potentielle pour les EST et la maladie d’Alzheimer. En résumé, ce travail illustre comment une meilleure connaissance de la fonction de signalisation de la PrPC peut permettre de progresser dans la compréhension des mécanismes de neurodégénérescence associés non seulement aux maladies à prions, mais également à la maladie d’Alzheimer. / Transmissible spongiform encephalopathies (TSE) are characterized by the conversion of the cellular prion protein (PrPC) into its scrapie isoform (PrPSc). PrPSc-mediated toxicity is restricted to neurons and results from the subversion of PrPC function(s). Some neuronal specificity of PrPC signaling relates to its coupling to the Fyn src kinase. In this work, we report that PrPC has the capacity to mobilize another src kinase, Lyn, via caveolin in neurons. A downstream effector of the PrPC-cav-Lyn signaling complex, which is spatially restricted to cell bodies, is the GSK3ß kinase. The inactivation of GSK3ß by PrPC takes part to the control of neuronal functions by negatively regulating the activity of the serotonin 1B receptor. Furthermore, we show that in prion-infected cells, PrPSc constitutively activates the PrPC-cav-Fyn platform, leading to oxidative-stress conditions. This toxic gain of PrPC function induces a defect in metalloproteinase MMP-9 activity, leading to increased Aß levels. Another impact of prion infection is the overactivation of the PDK1 kinase, which results in the loss of function of the TACE metalloproteinase. PDK1 overactivation is also observed in neurons from Alzheimer’s disease model mice, and is shown to be PrPC dependent. PDK1 inhibition in models of prion infection or Alzheimer’s disease restores TACE-mediated alpha-cleavage of PrPC, APP and TNF-alphareceptor. Since positive effects of PDK1 inhibition are observed in vivo, our data posit PDK1 as a putative therapeutic target to combat TSE disorders and Alzheimer’s disease. In summary, achieving a better knowledge of PrPC signaling function may help to improve our understanding of the mechanisms sustaining neurodegeneration in prion and Alzheimer’s diseases.

L'analyse à grande échelle de l'expression des gènes dans le cerveau est une approche puissante et relativement nouvelle, susceptible d'identifier des gènes candidats pour l'analyse des fonctions cérébrales. Nous avons utilisé la méthode Serial Analysis of Gene Expression pour établir un profil d'expression quantitatif de 11 régions du cerveau de souris, dont plusieurs régions corticales, le noyau accumbens, le striatum, le thalamus, la substance noire et l'aire tegmentale ventrale. Plus d'un million d'étiquettes SAGE ont été générées, permettant la détection de transcrits peu abondants. La comparaison des banques SAGE a mis en évidence 308 gènes différentiellement exprimés dans le cerveau de souris, dont la majorité n'a pas de fonction connue. Ces données ont été validées par la RT-PCR quantitative ou l'hybridation in situ (HIS). Le cerveau étant un organe de composition hétérogène, nous avons utilisé une technique combinant l'HIS et l'immunohistochimie afin d'étudier la distribution cellulaire des ARNm de trois marqueurs mésencéphaliques. Nous avons également entrepris d'étendre à l'homme les analyses d'expression réalisées chez la souris. Nos données montrent que les patterns d'expression génique entre des régions comparables du cerveau humain et du cerveau murin sont généralement conservés. Par ailleurs, nous nous sommes interrogés sur la régulation des gènes différentiellement exprimés dans un contexte physiopathologique affectant des régions cérébrales spécifiques. Ainsi, nous avons montré la régulation de plusieurs marqueurs striataux, corticaux et mésencéphaliques dans des modèles murins des maladies de Huntington et Parkinson.

Le concept de "cognition incarnée" considère que le schéma classique Perception-Cognition-Action proposant un flux séquentiel de traitement de l’information n'est pas approprié pour comprendre l'effet comportemental des troubles neurodégénératifs et trouver des solutions thérapeutiques innovantes. La découverte des neurones miroirs (NM) a donné un substrat biologique à cette théorie: on pense maintenant que les NM relient les connaissances sur les actions et les perceptions non seulement pour intégrer la perception dans la planification et l'exécution, mais aussi pour soutenir un large éventail de fonctions cognitives, par ex. empathie et langage. En même temps, il est maintenant clair que dans chaque maladie neurodégénérative les symptômes cognitifs et moteurs sont représentés le long d'un continuum. Les maladies neurodégénératives liées au vieillissement, comme la maladie d'Alzheimer (MA), la forme la plus courante de démence, sont devenues un enjeu social très important. Comme il n'y a pas de remède pour la MA, les études se concentrent sur la prévention. Une catégorie qui représente maintenant une cible privilégiée est le trouble cognitif léger (TCL), considéré comme une étape intermédiaire entre le vieillissement normal et la MA. Même si MA et TCL ont été caractérisées comme des maladies «cognitives» jusqu'à présent, un lien entre la fonction motrice et le risque de développer la MA a été reconnu.Le but principal de cette recherche est d'étudier l'intégrité du réseau NM dans la MA, le TCL et le vieillissement normal. La caractérisation de son fonctionnement dans les maladies neurodégénératives serait utile pour une meilleure compréhension de leurs mécanismes fonctionnels et manifestations cliniques. Cela permettrait également d’exploiter le NM dans la réhabilitation des symptômes.La thèse comprend deux parties : la première inclue une vaste recherche bibliographique destinée à décrire le cadre scientifique qui justifie une telle recherche.Nous avons d'abord passé en revue les preuves sur l'existence d'un système NM chez les singes et les humains, et ses multiples rôles possibles et après brièvement décrit le tableau clinique des principaux troubles neurodégénératifs, en montrant comment les symptômes cognitifs et moteurs s’entrecroisent. Ensuite, nous avons détaillé les résultats de la recherche documentaire sur les maladies neurodégénératives, NM et cognition incarnée, en les commentant à la lumière de cette théorie.La deuxième partie de la thèse décrit la procédure expérimentale qui a été réalisée dans le but de la recherche.Trois groupes appariés de 16 sujets chacun (CA-contrôles âgées, TCL amnésique avec atrophie hippocampique et MA) ont été évalués avec une batterie neuropsychologique centrée sur les fonctions liées au système NM, et une tâche IRMf spécifiquement créée pour tester les NM: celle- ci était constituée d'une tache d’observation, où aux sujets ont été montrés des vidéos d'une main droite saisissant différents objets, et d'une tache motrice où les sujets ont observé des images d'objets orientés pour être saisis avec la main droite, et ont fait le geste correspondant.Chez les CA, l'analyse de conjonction (comparant l'activation de l'IRMf pendant l'observation et l'exécution) a indiqué l'activation d'un réseau bilatéral fronto-pariétal dans les zones NM « classiques» et du gyrus temporal supérieur (STG), entrée visuelle corticale aux NM. Le groupe TCL a montré une activation similaire, cependant, les zones pariétales ont été moins activées et le STG n'a pas été activé, tandis que l'inverse était vrai pour la zone de Broca droite. Nous n'avons observé aucune activation du réseau fronto-pariétal chez le groupe MA. Dans tous les tests neuropsychologiques (y compris les tests de fonctions attribuées à NM), les sujets MA ont été plus mauvais que les CA, alors que les sujets TCL montraient seulement des troubles de mémoire épisodique et fluidité sémantique (...). / The concept of “embodied cognition” considers that the classical Perception-Cognition-Action architecture proposing a sequential flow of processing with clean cuts between all modules is not appropriate to understand the behavioral effect of neurodegenerative disorders and to find innovative therapeutic solutions. In the last decades, the discovery of the mirror neurons (MN) has given a biological substrate to this theoretical perspective: the MN are now thought linking together knowledge about actions and perceptions not only to integrate perception in action planning and execution but also as a neural mechanism supporting a wide range of cognitive functions, e.g. empathy and language. At the same time, it is now clear that in each neurodegenerative disease both cognitive and motor symptoms are represented along a continuum. In the current demographic context, neurodegenerative diseases linked to aging have become a very important social issue. Alzheimer Disease (AD), the most common form of dementia, is a neurodegenerative disease strictly linked to aging. As actually there is no cure, several studies are focusing on prevention. A category which now represents a preferential target of intervention is Mild Cognitive Impairment (MCI), considered as an intermediate stage between normal aging and AD. Even if AD and MCI have been characterized as “cognitive” diseases until now, a link between motor function and the risk of developing AD has been recognized.The main purpose of this research is to investigate the integrity of the MN network in AD, MCI and normal aging. Characterizing the functioning of the MN network in neurodegenerative diseases would be useful to better understand functional mechanisms and their clinical manifestations. It would also allow to capitalize on these kinds of neurons in the rehabilitation of motor and cognitive symptoms.The thesis consists of two parts: the first part includes an extensive bibliographic research intended to describe the scientific frame which justifies such a research.We first reviewed the evidence about the existence of a MN system in monkeys and humans, and its multiple possible roles in humans.We then briefly reviewed the clinical picture of the main neurodegenerative disorders, showing how cognitive and motor symptoms intersect in all of them.Next, we detailed the results of literature searching on neurodegenerative diseases, MN, and embodied cognition, commenting them at the light of this hypothesis.The second part of the thesis describe the experimental procedure which has been performed to evaluate the integrity of the MN network in normal elderly and people with AD and MCI, and its results.Three matched groups of 16 subjects each (normal elderly-NE, amnesic MCI with hippocampal atrophy and AD) were evaluated with a neuropsychological battery centered on functions thought to be linked to the MN system, and a fMRI task specifically created to test MN: that comprised of an observation run, where subjects were shown videos of a right hand grasping different objects, and of a motor run, where subjects observed visual pictures of objects oriented to be grasped with the right hand, and made the corresponding gesture.In NE subjects, the conjunction analysis (comparing fMRI activation during observation and execution), indicated the activation of a bilateral fronto-parietal network in “classical” MN areas, and of the superior temporal gyrus (STG), an area thought to provide the cortical visual input to the MN. The MCI group showed the activation of areas belonging to the same network, however, parietal areas were activated to a lesser extent and the STG was not activated, while the opposite was true for the right Broca’s area. We did not observe any activation of the fronto-parietal network in AD participants (...).