Orientadores: Iscia Teresinha Lopes Cendes, Fábio Rossi Torres / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T06:33:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souza_DanielaAguiar_D.pdf: 4993968 bytes, checksum: b0d9bcf5acf25db217c9dedcd7aa4bbc (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: As malformações do desenvolvimento cortical (MDC) são distúrbios resultantes de defeitos na embriogênese do córtex cerebral e estão entre as principais causas conhecidas de atraso do desenvolvimento e epilepsia. Dentre os principais tipos de MDC podemos citar a heterotopia nodular periventricular (HNP), o espectro lissencefalia/heterotopia subcortical em banda (LIS/HSB) e a esquizencefalia. Alterações moleculares em genes que atuam em mecanismos que vão desde o controle da divisão celular até a migração neuronal foram identificadas como responsáveis pela etiologia de vários tipos de MDC. Tais descobertas, além de auxiliar na compreensão dos mecanismos envolvidos no desenvolvimento do córtex cerebral e doenças relacionadas, fornecem informações importantes para um melhor diagnóstico e tratamento dos pacientes. Neste contexto, o principal objetivo deste trabalho foi analisar do ponto de vista molecular um grande grupo de pacientes com MDC. A casuística foi composta por um grupo de 107 pacientes: 27 possuem HNP, 33 são afetados por LIS/HSB e 47 possuem esquizencefalia. Em um primeiro momento, foi realizada triagem de mutações de ponto em genes candidatos (FLNA, DCX, LIS1, EMX2, TUBA1A, TUBB2B e TUBA8) por sequenciamento (Sanger). Posteriormente, a técnica de MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) foi utilizada para detectar variações estruturais em regiões candidatas, incluindo os genes FLNA, DCX e LIS1. Finalmente, a técnica de SNP-Array foi utilizada para análise das variações no número de cópias alélicas em regiões genômicas de alguns pacientes (copy number variation - CNV). Todas as mutações de ponto encontradas nas sequencias de DNA foram verificadas em um grupo de 200 indivíduos controles. Através do sequenciamento, foram identificadas três alterações patogênicas localizadas nos genes FLNA e DCX, através do MLPA foram encontradas seis alterações estruturais patogênicas nos genes FLNA, DCX e LIS1. Os ensaios de SNP-Array permitiram a identificação de vários CNVs com potencial deletério, incluindo 12 pacientes com 17 novas CNVs ainda não descritas na literatura. Tais CNVs envolvem vários potenciais genes candidatos para as MDC, incluindo os genes TSNARE, DAAM1, ARX, PLXNA1 e HAUS7. Concluindo, nossos resultados mostram uma baixa frequência de mutações em genes candidatos previamente relacionados às MDC, somente 2.8% (n=3/107) dos pacientes possuem variantes deletérias nas sequencias dos genes analisados e 18% (n=6/33 testados) dos pacientes analisados possuem alterações estruturais em regiões candidatas. Porém, através da abordagem genômica para identificação de variações estruturais, foram identificadas vá-rias regiões/genes candidatos potencialmente envolvidos com a etiologia das MDC (12/40= 30%). Nossos dados mostram que as MDC apresentam grande heterogeneidade genética, porém uma proporção significativa dos pacientes possuem variações estruturais que podem ser identificadas pela técnica de SNP-Array / Abstract: Malformations of cortical development (MCD) are disorders resulting from defects in the embryogenesis of the cerebral cortex and are one of the most important causes of developmental delay and epilepsy. The main types of MCDs are periventricular nodular heterotopia (PNH), lissencephaly/subcortical band heterotopia spectrum (LIS/SBH) and schizen-cephaly. Mutations in genes acting in mechanisms ranging from control of cell division to neuronal migration were identified as responsible for several types of MCDs. These advances not only improved our understanding about the mechanisms involved in the development of the cerebral cortex but have also provided relevant information that can be used for better diagnosis and management of patients. In this scenario, the main objective of this study was to access and perform a comprehensive molecular genetics study in a large cohort of patients with MCD. We have studied a total of 107 patients with MCDs divided in the following groups: 27 with PNH, 33 with LIS/SBH and 47 with schizencephaly. We first searched for sequence variations in candidate genes (FNLA, DCX, LIS1, EMX2, TU-BA1A, TUBB2B and TUBA8) using the Sanger sequencing method. Subsequently, we checked for structural variants in FLNA, DCX and LIS1 using Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) technique. Finally, we took a genomic approach by using single nucleotide polymorphism (SNP)-array technology to studied copy number variations (CNV) in some patients. All sequence variants found were subsequently verified in a group of 200 control individuals. Our results showed 3 pathogenic sequence variants in FNLA and DCX, as well as 6 pathogenic structural variants detected by MLPA in FLNA, LIS1 and DCX. SNP-array technique detected 17 genomic regions, in 12 patients, containing new CNVs. These CNVs involve a number of potential new candidate genes for MCDs, including: TSNARE, DAAM1, ARX, PLXNA1 and HAUS7. In conclusion, our results show a low frequency of mutations in candidate genes previously associated with MCDs, only 2.8% (n=3/107) of our patients have deleterious sequence variants and 18% (n=6/33) have abnormal structural variants in candidate regions. However, by using a genomic approach to look for CNVs we were able to identify several candidate regions/genes that have the potential to be involved in MCDs (12/40= 30%). Our data show that MCDs are genetic heterogeneous; however, it seems that a significant proportion of patients have structural abnormalities that can be identified by SNP-array technology / Doutorado / Fisiopatologia Médica / Doutora em Ciências

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Orientadores: IsciaTeresinha Lopes Cendes, Fábio Rossi Torres / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-21T05:32:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Avansini_SimoniHelena_M.pdf: 4063977 bytes, checksum: fd585dcd7befa8b76aa15db5e445d1d2 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A displasia cortical focal (DCF) é uma malformação do córtex cerebral humano que ocorre na fase de proliferação e diferenciação neuronal e está frequentemente associada com a refratariedade das crises epilépticas. É designada como um espectro de anormalidades da estrutura laminar do córtex, associada com características citopatológicas que incluem neurônios gigantes, dismórficos e células em balão e, sua etiologia é pouco conhecida. Os microRNAs (miRNAs) são uma classe de RNAs de fita simples não codificadores de proteínas que regulam a expressão gênica pós-transcricional. Há evidências que indicam que eles estão envolvidos em importantes processos do sistema nervoso e que os mesmos podem ter um papel nas DCF. A elucidação das vias moleculares desta malformação pode permitir uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes e levar a novas estratégias de tratamento, melhora na conduta clínica e identificação de novos alvos terapêuticos, bem como a descoberta de biomarcadores que possam ser associados ao diagnóstico, prognóstico e resposta ao tratamento. Com isso, o objetivo deste trabalho foi investigar o padrão de expressão dos miRNAs em tecidos com DCF obtidos através de cirurgia para o controle de crises refratárias, verificar os prováveis genes alvos para esses miRNAs diferencialmente expressos e comparar a assinatura molecular baseada nos miRNAs em tipos distintos de DCF do tipo 2. Foi utilizado para isso o RNA total de 17 pacientes com DCF e de 20 controles oriundos de autópsia. Os experimentos de microarranjos de miRNAs revelaram 39 miRNAs diferencialmente hipoexpressos e um miRNA hiperexpresso. Utilizouse a técnica de qPCR para validação desses miRNAs e foi possível identificar uma diferença na expressão de três miRNAs: hsa-miR-31, hsa-miR-34a e hsa-let-7f em pacientes com DCF tipo 2 em relação ao grupo controle. Além disso, o hsa-miR-31 foi identificado como um possível biomarcador para o subtipo 2b de DCF. Na busca por genes alvos foi encontrado hiperexpresso o NEUROG2. Também foi verificada a desregulação do gene DICER1, encontrado hipoexpresso, o que justifica a predominância de miRNAs com expressão diminuída encontrados. E por fim, observou-se que o padrão diferencial de expressão dos três miRNAs e os dois genes identificados em nosso estudo fornecem subsídios importantes para esclarecer os mecanismos moleculares envolvidos na falha da diferenciação neuroglial em DCF tipo 2 / Abstract: Focal cortical dysplasia (FCD) is a malformation of human cerebral cortex that occurs during proliferation and neuronal differentiation frequently associated with drug-resistant epilepsy. It is designated as a spectrum of abnormalities of laminar structure of the cortex, associated with cellular abnormalities that consist of giant and dysmorphic neurons and balloon cells; however, its etiology is poorly understood. MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs which regulate post-transcriptional gene expression. There is evidence that they are involved in important processes in the nervous system and that they may play a role in FCD. The elucidation of the molecular pathways involved in FCD may allow a better understanding of the underlying mechanisms and may lead to new treatment strategies, improvement in clinical management and identification of new therapeutic targets, as well as the discovery of biomarkers that may be associated with the diagnosis, prognosis and response to treatment. Thus, the aim of this study was to investigate miRNAs expression pattern in tissue with FCD obtained at surgery for control of refractory seizures. In addition, we aimed to identify target genes for these miRNAs differentially expressed, as well as to compare the molecular signature based on miRNAs in different types of FCD. We used total RNA isolated from brain tissue obtained after surgery for the treatment of medically refractory seizures from 17 patients with DCF and 20 controls from autopsy. Microarray analysis revealed 39 miRNAs differentially downregulated and only one miRNA overexpressed. Decreased expression of three miRNAs was confirmed by qPCR when patients with type 2 FCD were compared with controls: hsa-miR-31, hsa-miR34a and hsa-let-7f. In addition, we found that hsa-miR-31 could be a potential biomarker for type 2b FCD. In the search for target genes, NEUROG2 was found upregulated and DICER1 was found underexpressed, which explains the predominance of miRNAs with decreased expression. Finally, we observed that the differential pattern of expression of three miRNAs, and the two genes identified in our study provide important information which may help to clarify the molecular mechanisms involved in the failure of neuroglial differentiation in type 2 FCD / Mestrado / Neurociencias / Mestra em Fisiopatologia Médica

Orientador: Iscia Teresinha Lopes Cendes, Fábio Rossi Torres / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-21T06:16:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tsuneda_SimoneSayuri_D.pdf: 5548129 bytes, checksum: b0213ba3907f298ca16dddb2df837b62 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A polimicrogiria (PMG) é uma malformação do córtex cerebral causada por falhas no seu desenvolvimento, caracterizando-se por um número excessivo de pequenos giros e laminação anormal, dando à superfície cortical uma aparência irregular e grosseira. A gravidade de suas manifestações clínicas se relaciona diretamente com a extensão da malformação e das regiões cerebrais afetadas, sendo que a presença de lesões bilaterais ou unilaterais extensas indica um pior prognóstico. Uma das síndromes de polimicrogiria mais frequentes e, consequentemente, mais bem descritas clinicamente, é a polimicrogiria perisylviana bilateral (PPB). Essa forma de polimicrogiria atinge a região que tange a fenda Sylviana, podendo apresentar-se tanto unilateralmente quanto em ambos os hemisférios. O padrão de herança da PPB foi descrito inicialmente como ligada ao cromossomo X por Borgatti et al. em 1999. Já em 2000, Guerreiro et al. confirmaram o padrão de herança consistente com herança ligada ao cromossomo X, mas ainda nenhum gene havia sido identificado como responsável pelo distúrbio. Nosso grupo recentemente mapeou uma nova região candidata para a PPB em Xq27.1-q27.3, e esta tese se propôs a avaliar essa região através da técnica de sequenciamento em larga escala aliada à tecnologia de captura para o cromossomo X. Os resultados apontaram como potenciais patogênicos os genes MAGEC1, UBE2NL, além da região do gene SPANXC, todos localizados na região candidata, mas uma avaliação mais detalhada levantou a hipótese de uma relação complexa entre as alterações encontradas no gene MAGEC1 e o quadro clínico dos pacientes. Além da análise da região Xq27.1-q27.3, considerando o grande número de genes de microtúbulo que tem sido relacionado a malformações do córtex cerebral, esse trabalho também avaliou pacientes esporádicos e famílias com histórico de PPB realizando triagem de mutações nas regiões codificantes dos genes AFF2, SLITRK2 e SLITRK4, localizados na região candidata, nos genes de microtúbulo TUBA1A, TUBB2B e TUBA8, além dos genes SRPX2 e WDR62, presentes em trabalhos na literatura de malformações corticais. A triagem foi realizada utilizando as técnicas de DHPLC e de sequenciamento utilizando a técnica de Sanger por eletroforese capilar. Foi encontrada uma alteração potencialmente patogênica no gene AFF2. As alterações identificadas neste estudo que resultam em troca de aminoácidos foram avaliadas utilizando as ferramentas in silico MutPred, SNPs&GO, Polyphen 2, Panther e SIFT, de forma a fornecer mais informações a respeito de seu potencial patogênico. Além disso, as variantes inéditas identificadas nesse trabalho foram estudadas em uma amostra de indivíduos normais (grupo controle). Com esses dados foi possível sugerir que algumas dessas variantes encontradas possuem potencial patogênico que deve ser futuramente investigado através de estudos funcionais / Abstract: Polimicrogyria (PMG) is a cortical malformation caused by failures during the brain cortex development process and is characterized by an excessive number of small gyri, resulting in an irregular cortical surface. The severity of its clinical manifestations is directly related to the extension of the tissue abnormalities. Bilateral Perisylvian Polimicrogyria (BPP) is the most comum and, consequently, a very well described syndrome that affects the cortex surrounding the Sylvian fissures in both hemispheres. The genetic pattern for BPP was initially described by Borgatti et al. as an X-linked pattern, confirmed by Guerreiro et al. in 2000, but with no specific gene identified. We have recently described a candidate site for BPP at the Xq27.1-27.3 region and, in this project, we proposed to evaluate this site through next generation sequencing technology combined with capture technology. Our results suggest that MAGEC1 and UBE2NL genes, or the SPANXC gene area might be related to the pathogeny in this case, however a further analysis brought up the hypothesis of a complex relation between the MAGEC1 mutations and the clinical manifestations in each different patient. Considering recurrent description of relations between microtubule genes and cortex malformations, we also performed the evaluation of exon regions of eight selected genes from sporadic patients and BPP families through DHPLC and sequencing. The analysis focused on AFF2, SLITRK2 and SLITRK4 genes, located at the identified site, microtubule genes TUBA1A, TUBB2B and TUBA8, and SRPX2 and WDR62 genes, also related to cortical malformations. As a result from this screening, we identified a potentially pathogenic mutation in gene AFF2. All non-synonymous SNPs were evaluated using the in silico tools MutPred, SNPs&GO, Polyphen 2, Panther and SIFT, providing further insights for their analysis. A control group of individuals was analyzed for the presence of the non-described SNPs. These data suggest a pathogenic potential for these genetic alterations that must be investigated through function studies / Doutorado / Fisiopatologia Médica / Doutora em Ciências

Children with focal intractable epilepsy caused by MCD, FCD and TSC are in a high risk of development of cognitive delay, as a result of both drug resistant epilepsy and genetically determined abnormal structure of the neuronal networks. Epilepsy surgery represents an established and safe treatment method of focal drug resistant epilepsy, and increases the chances for these patients to be rid of epileptic seizures, anti-epileptic medication and cognitive comorbidities. Current data on genetic background of focal MCD and FCD and their comorbidities provide space to expand the diagnostic process in epilepsy surgery candidates. However, available information on genetic causes of MCD and FCD do not allow us to infer prognostic estimates on chances of seizure freedom and optimal cognitive development. Future studies should elucidate these uncertainties.

Des mutations hétérozygotes faux-sens dans le gène de la tubuline gamma TUBG1, ont été identifiées dans le contexte des malformations du développement cortical, associées à une déficience intellectuelle et à l'épilepsie. Ici, nous avons étudié par la technique d’électroporation in-utero et par des études in vivo, l’effet de quatre de ces variantes sur le développement cortical. Nous montrons que les mutations dans TUBG1 affectent le positionnement neuronal dans la plaque corticale, en perturbant la locomotion des neurones nouvellement nés, mais sans affecter la neurogenèse. Nous proposons que la γ-tubuline mutante affecte le fonctionnement global de ses complexes, et en particulier leur rôle dans la régulation de la dynamique des microtubules. De plus, nous avons développé un modèle de souris knock-in Tubg1Y92C/+ et évalué les conséquences de la mutation sur le développement cortical, les caractéristiques neuroanatomiques et le comportement. Les souris mutantes présentent une microcéphalie globale, des anomalies du néocortex et de l'hippocampe, des altérations du comportement et une susceptibilité épileptique. Ainsi, nous montrons que les souris Tubg1Y92C/+ miment au moins partiellement le phénotype humain et représentent donc un modèle pertinent pour d'autres investigations de la physiopathologie des malformations du développement cortical. / Missense heterozygous variants in the gamma tubulin gene TUBG1 have been linked to malformations of cortical development, associated with intellectual disability and epilepsy. Here, we investigated through in-utero electroporation and in-vivo studies, how four of these variants affect cortical development. We show that TUBG1 mutants affect neuronal positioning within the cortical wall, by a disrupting the locomotion of newly born neurons but without affecting neurogenesis. We propose that mutant γ-tubulin affects overall functioning of γ-tubulin complexes, and in particular their role in the regulation of microtubule dynamics. Additionally, we developed a knock-in Tubg1Y92C/+ model and assessed consequences of the mutation on cortical development, neuroanatomical features and behaviour. Mutant mice present with global microcephaly, neocortical and hippocampal abnormalities, behavioural alterations and epileptic susceptibility. Thus, we show that Tubg1Y92C/+ mice partially mimic the human phenotype and therefore represent a relevant model for further investigations of the physiopathology of malformations of cortical development.

Epilepsy, as the most common chronic neurological disease, affects a significant part of population (0.5-1%). Drug resistant epilepsy has a significant negative effect on the quality of life, psychiatric comorbidities, neurocognitive performance and the risk of SUDEP in children. Therefore, resective epilepsy surgery, the only curative treatment of this condition, can fundamentally reverse this unfavorable prognosis. An inevitable prerequisite for a good postoperative result is complete removal of the epileptogenic zone (EC) and preservation of eloquent areas (EC). At present, even with improving and new preoperative non-invasive methods, we don't have an exclusive diagnostic method for theirs delineation. The aim of this PhD study is to assess benefit of individual intraoperative electrophysiological (iEF) methods in pediatric patients with focal intractable epilepsy. The first study evaluates the importance of intraoperative electrocorticography (iECoG) in the localization of EZ. The study proved that iECoG serves as a reliable tool to guide surgical resection and may predict results of epilepsy surgery. iECoG-based modification of surgical plan is not associated with increased risk of significant complications. The second presented study analyzed the contribution of intraoperative electrical...