Thesis (Ph. D.)--University of Missouri--Columbia, 2001. / "May 2001." Typescript. Vita. Includes bibliographical references (leaves 145-152). Also available on the Internet.

Introdução: A Doença da Urina do Xarope do Bordo (DXB) é um Erro Inato do Metabolsimo (EIM), causada pela deficiência da atividade do complexo enzimático desidrogenase dos L-cetoácidos de cadeia ramificada (CACR). O programa público brasileiro de triagem neonatal não inclui o diagnóstico e o tratamento da DXB. Objetivo: Caracterizar aspectos relacionados ao diagnóstico e ao tratamento de pacientes brasileiros com DXB. Metodologia: Estudo retrospectivo. Os pacientes foram identificados a partir dos registros de laboratório considerado referência nacional para o diagnóstico de DXB, e de contato com demais serviços nacionais de referência em genética médica. O diagnóstico foi realizado entre 1992-2011. Os dados analisados foram obtidos a partir da revisão de prontuários. Resultados: Oitenta e três pacientes, oriundos de 75 famílias, foram incluídos no estudo (mediana de idade= 3 anos; IQ25- 75= 0,57-7). A mediana da idade de início dos sintomas foi de 10 dias (IQ= 5-30), enquanto que a mediana da idade ao diagnóstico foi de 60 dias (IQ= 29-240, p= 0,001). Apenas três (3,6%) pacientes foram diagnosticados antes de desenvolverem manifestações clínicas. A comparação entre os pacientes com (n=12) e sem (n=71) diagnóstico precoce mostrou que o mesmo associa-se com a presença de história familiar positiva e diminuição da prevalência de manifestações clínicas ao diagnóstico, mas não com melhor resultado; além disso, a maioria desses diagnósticos foi realizada entre 2002-2011 (n= 10/12). Considerando a amostra total, 98,8% dos pacientes apresentam atraso de desenvolvimento neuropsicomotor. Conclusão: Os pacientes com DXB são diagnosticados tardiamente no Brasil, de forma que as complicações associadas a esta condição não são prevenidas. Entretanto, existem indícios de que está havendo um melhora gradual desse panorama desde a última década. Os nossos dados indicam que o diagnóstico precoce dessa condição, mesmo que em fase sintomática, associa-se a um melhor prognóstico do paciente. Sugere-se a elaboração de políticas públicas específicas para doenças raras no país. / Introduction: Maple syrup urine disease (MSUD) is an Inborn Errors of Metabolism, is caused by a deficiency in activity of the branched-chain L-keto acid dehydrogenase complex. The Brazilian neonatal screening program does not include the diagnosis and treatment of MSUD. Objective: To draw a profile of aspects related to the diagnosis and treatment of Brazilian patients who received. Methods: In this retrospective study, patients were identified through a search of records from a national reference laboratory for the diagnosis of MSUD and through contact with other medical genetics services across Brazil. A diagnosis of MSUD between 1992 and 2011. Data were collected by means of a chart review. Results: Eighty-three patients from 75 families were enrolled in the study (median age 3 years; interquartile range, 0.57–7). Median age at onset of symptoms was 10 days (IQR 5–30), whereas median age at diagnosis was 60 days (IQR 29–240, p=0.001). Only three (3.6%) patients were diagnosed before the onset of clinical manifestations. A comparison between patients with (n=12) and without (n=71) an early diagnosis show that early diagnosis is associated with the presence of positive familial history and decreased prevalence of clinical manifestations at the time of diagnosis, but not with a better outcome. Overall, 98.8% of patients have some psychomotor or neurodevelopmental delay. Conclusion: In Brazil, patients with MSUD receive a late diagnosis and show neurological compromise and poor survival even with an early diagnosis. We suggest that specific public policies for rare diseases should be developed and implemented in the country.

Introdução: A Doença da Urina do Xarope do Bordo (DXB) é um Erro Inato do Metabolsimo (EIM), causada pela deficiência da atividade do complexo enzimático desidrogenase dos L-cetoácidos de cadeia ramificada (CACR). O programa público brasileiro de triagem neonatal não inclui o diagnóstico e o tratamento da DXB. Objetivo: Caracterizar aspectos relacionados ao diagnóstico e ao tratamento de pacientes brasileiros com DXB. Metodologia: Estudo retrospectivo. Os pacientes foram identificados a partir dos registros de laboratório considerado referência nacional para o diagnóstico de DXB, e de contato com demais serviços nacionais de referência em genética médica. O diagnóstico foi realizado entre 1992-2011. Os dados analisados foram obtidos a partir da revisão de prontuários. Resultados: Oitenta e três pacientes, oriundos de 75 famílias, foram incluídos no estudo (mediana de idade= 3 anos; IQ25- 75= 0,57-7). A mediana da idade de início dos sintomas foi de 10 dias (IQ= 5-30), enquanto que a mediana da idade ao diagnóstico foi de 60 dias (IQ= 29-240, p= 0,001). Apenas três (3,6%) pacientes foram diagnosticados antes de desenvolverem manifestações clínicas. A comparação entre os pacientes com (n=12) e sem (n=71) diagnóstico precoce mostrou que o mesmo associa-se com a presença de história familiar positiva e diminuição da prevalência de manifestações clínicas ao diagnóstico, mas não com melhor resultado; além disso, a maioria desses diagnósticos foi realizada entre 2002-2011 (n= 10/12). Considerando a amostra total, 98,8% dos pacientes apresentam atraso de desenvolvimento neuropsicomotor. Conclusão: Os pacientes com DXB são diagnosticados tardiamente no Brasil, de forma que as complicações associadas a esta condição não são prevenidas. Entretanto, existem indícios de que está havendo um melhora gradual desse panorama desde a última década. Os nossos dados indicam que o diagnóstico precoce dessa condição, mesmo que em fase sintomática, associa-se a um melhor prognóstico do paciente. Sugere-se a elaboração de políticas públicas específicas para doenças raras no país. / Introduction: Maple syrup urine disease (MSUD) is an Inborn Errors of Metabolism, is caused by a deficiency in activity of the branched-chain L-keto acid dehydrogenase complex. The Brazilian neonatal screening program does not include the diagnosis and treatment of MSUD. Objective: To draw a profile of aspects related to the diagnosis and treatment of Brazilian patients who received. Methods: In this retrospective study, patients were identified through a search of records from a national reference laboratory for the diagnosis of MSUD and through contact with other medical genetics services across Brazil. A diagnosis of MSUD between 1992 and 2011. Data were collected by means of a chart review. Results: Eighty-three patients from 75 families were enrolled in the study (median age 3 years; interquartile range, 0.57–7). Median age at onset of symptoms was 10 days (IQR 5–30), whereas median age at diagnosis was 60 days (IQR 29–240, p=0.001). Only three (3.6%) patients were diagnosed before the onset of clinical manifestations. A comparison between patients with (n=12) and without (n=71) an early diagnosis show that early diagnosis is associated with the presence of positive familial history and decreased prevalence of clinical manifestations at the time of diagnosis, but not with a better outcome. Overall, 98.8% of patients have some psychomotor or neurodevelopmental delay. Conclusion: In Brazil, patients with MSUD receive a late diagnosis and show neurological compromise and poor survival even with an early diagnosis. We suggest that specific public policies for rare diseases should be developed and implemented in the country.

Introdução: A Doença da Urina do Xarope do Bordo (DXB) é um Erro Inato do Metabolsimo (EIM), causada pela deficiência da atividade do complexo enzimático desidrogenase dos L-cetoácidos de cadeia ramificada (CACR). O programa público brasileiro de triagem neonatal não inclui o diagnóstico e o tratamento da DXB. Objetivo: Caracterizar aspectos relacionados ao diagnóstico e ao tratamento de pacientes brasileiros com DXB. Metodologia: Estudo retrospectivo. Os pacientes foram identificados a partir dos registros de laboratório considerado referência nacional para o diagnóstico de DXB, e de contato com demais serviços nacionais de referência em genética médica. O diagnóstico foi realizado entre 1992-2011. Os dados analisados foram obtidos a partir da revisão de prontuários. Resultados: Oitenta e três pacientes, oriundos de 75 famílias, foram incluídos no estudo (mediana de idade= 3 anos; IQ25- 75= 0,57-7). A mediana da idade de início dos sintomas foi de 10 dias (IQ= 5-30), enquanto que a mediana da idade ao diagnóstico foi de 60 dias (IQ= 29-240, p= 0,001). Apenas três (3,6%) pacientes foram diagnosticados antes de desenvolverem manifestações clínicas. A comparação entre os pacientes com (n=12) e sem (n=71) diagnóstico precoce mostrou que o mesmo associa-se com a presença de história familiar positiva e diminuição da prevalência de manifestações clínicas ao diagnóstico, mas não com melhor resultado; além disso, a maioria desses diagnósticos foi realizada entre 2002-2011 (n= 10/12). Considerando a amostra total, 98,8% dos pacientes apresentam atraso de desenvolvimento neuropsicomotor. Conclusão: Os pacientes com DXB são diagnosticados tardiamente no Brasil, de forma que as complicações associadas a esta condição não são prevenidas. Entretanto, existem indícios de que está havendo um melhora gradual desse panorama desde a última década. Os nossos dados indicam que o diagnóstico precoce dessa condição, mesmo que em fase sintomática, associa-se a um melhor prognóstico do paciente. Sugere-se a elaboração de políticas públicas específicas para doenças raras no país. / Introduction: Maple syrup urine disease (MSUD) is an Inborn Errors of Metabolism, is caused by a deficiency in activity of the branched-chain L-keto acid dehydrogenase complex. The Brazilian neonatal screening program does not include the diagnosis and treatment of MSUD. Objective: To draw a profile of aspects related to the diagnosis and treatment of Brazilian patients who received. Methods: In this retrospective study, patients were identified through a search of records from a national reference laboratory for the diagnosis of MSUD and through contact with other medical genetics services across Brazil. A diagnosis of MSUD between 1992 and 2011. Data were collected by means of a chart review. Results: Eighty-three patients from 75 families were enrolled in the study (median age 3 years; interquartile range, 0.57–7). Median age at onset of symptoms was 10 days (IQR 5–30), whereas median age at diagnosis was 60 days (IQR 29–240, p=0.001). Only three (3.6%) patients were diagnosed before the onset of clinical manifestations. A comparison between patients with (n=12) and without (n=71) an early diagnosis show that early diagnosis is associated with the presence of positive familial history and decreased prevalence of clinical manifestations at the time of diagnosis, but not with a better outcome. Overall, 98.8% of patients have some psychomotor or neurodevelopmental delay. Conclusion: In Brazil, patients with MSUD receive a late diagnosis and show neurological compromise and poor survival even with an early diagnosis. We suggest that specific public policies for rare diseases should be developed and implemented in the country.

A doença da urina do xarope do bordo (MSUD) é causada pela deficiência na atividade do complexo da desidrogenase dos U-cetoácidos de cadeia ramificada (BCKAD), promovendo o acúmulo dos aminoácidos de cadeia ramificada (BCAA) leucina (Leu), isoleucina (Ile) e valina (Val) e seus U-cetoácidos correspondentes (BCKA). A MSUD caracteriza-se por cetoacidose, ataxia, coma, retardo mental e psicomotor. Estudos em animais demonstraram que BCAA e BCKA estimulam a lipoperoxidação e reduzem capacidade antioxidante cerebral em ratos. Também há evidências de que o estresse oxidativo ocorra em pacientes com MSUD no diagnóstico e durante o tratamento e que devido à terapia com dieta restrita e hipoproteica eles possuam deficiência de L-carnitina (L-car), um importante composto para o metabolismo energético. Recentemente, estudos demonstraram o papel antioxidante e anti-inflamatório da L-car, através de sua ação antiperoxidativa, sequestradora de espécies reativas e efeito estabilizador de danos às membranas celulares. Considerando que a fisiopatologia da MSUD ainda é pouco compreendida e que existe um crescente número de estudos enfatizando o envolvimento do estresse oxidativo na doença, neste trabalho foi investigado o efeito in vitro e in vivo da L-car sobre o estresse oxidativo e o dano inflamatório na MSUD tendo como objetivos: A) estudar a indução ao dano oxidativo pelos metabólitos acumulados na MSUD, verificando o possível papel antioxidante da L-car sobre o dano ao DNA in vitro; B) avaliar o efeito in vivo da suplementação de 50 mg/kg/dia de L-car sobre: b.1) a indução do dano ao DNA em leucócitos de pacientes com a MSUD tratados com dieta de restrição proteica, correlacionando as concentrações dos principais metabólitos acumulados nesta doença e verificando o possível papel antioxidante da suplementação da Lcar; b.2) a concentração de citocinas pró-inflamatórias em plasma de pacientes com MSUD tratados com dieta de restrição proteica e a correlação com o estresse oxidativo; b.3) os parâmetros de dano oxidativo à biomoléculas em urina de pacientes com MSUD sob dieta de restrição proteica; C) avaliar o efeito da L-car sobre o estresse oxidativo causado pelos metabólitos acumulados na MSUD em córtex cerebral e cerebelo de ratos Wistar, através de um modelo crônico de indução química da doença. Verificou-se que a Leu e o seu - cetoácido correspondente, o ácido -cetoisocapróico (KIC), causaram danos ao DNA in vitro e L-car foi capaz de diminuir significativamente essas alterações, principalmente as causadas pelo KIC. Quando testado o efeito da suplementação de L-car sobre o dano ao DNA em pacientes MSUD, observou-se um aumento significativo de lesões ao DNA em pacientes com dieta de restrição proteica quando comparados aos controles e a terapia com L-car foi capaz de diminuir significativamente os níveis desses danos. Também foram verificadas correlações do tipo negativa entre as concentrações de L-car e os índices de dano ao DNA e do tipo positiva entre as lesões ao DNA e níveis de MDA, marcador de lipoperoxidação, explicitando uma relação entre o dano ao DNA observado nos pacientes com MSUD, estresse oxidativo e o benefício da suplementação de L-car. Também averiguou-se o efeito da terapia de L-car sobre as citocinas pró-inflamatórias interleucina 1Y (IL-1Y), interleucina 6 (IL-6) e interferon gama (INF- Z). Constatou-se aumentos significativos de IL-1Y, IL-6 e INF- Z no plasma de pacientes com MSUD antes da suplementação de L-car e uma reversão completa desses valores aos níveis dos controles para IL-1Y e INF- Z após a administração de L-car. Ainda, verificou-se que a L-car pode auxiliar na defesa celular contra a inflamação e o estresse oxidativo, observando-se uma correlação negativa entre todas citocinas testadas e as concentrações de L-car, e uma correlação positiva entre o conteúdo de MDA e níveis de IL-1Y e IL-6. Constatou-se também que as medidas de di-tirosina (dano oxidativo a proteínas) e isoprostanos (dano de lipoperoxidação) estavam aumentadas e a capacidade antioxidante total diminuída na urina de pacientes com MSUD sem terapia com L-car e a suplementação deste composto induziu efeitos benéficos sobre estes parâmetros, reduzindo os níveis de di-tirosina e isoprostanos e aumentando a capacidade antioxidante medida em urina. Foi também observado um aumento de KIC urinário após dois meses de tratamento com L-car, quando comparado com o grupo controle, demonstrando um incremento da excreção deste metabolito tóxico. Desta forma, esses resultados sugerem um efeito de reversão de dano oxidativo pela L-car e que a urina pode ser utilizada para monitorar este tipo de lesão em pacientes afetados pela MSUD. Por fim, foram analisados em córtex cerebral e cerebelo de ratos Wistar submetidos ao modelo crônico de MSUD: espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), para avaliar lipoperoxidação, conteúdo de carbonilas (dano oxidativo proteico), oxidação de diclorofluoresceína (DCF), para quantificar produção de espécies reativas teciduais, conteúdo de glutationa reduzida (GSH) que é um importante antioxidante não enzimático e a atividade das enzimas antioxidantes catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GPx) e glicose-6-fosfato-desidrogenase (G6PD). Os resultados mostraram que a administração crônica de BCAA estimulou a lipoperoxidação, o dano oxidativo proteico, aumento de espécies reativas e diminuição das defesas antioxidantes enzimáticas e não enzimáticas, especialmente em córtex cerebral e o tratamento com L-car foi capaz de prevenir estes efeitos, exceto o dano oxidativo a proteínas. Em conjunto, estes resultados demonstram que os metabólitos acumulados na MSUD induzem dano oxidativo a biomoléculas (lipídios, proteínas e DNA), diminuem o status antioxidante e promovem aumento de processos inflamatórios. Ainda, estes dados podem contribuir para a compreensão dos mecanismos de ação dos efeitos citotóxicos dos metabólitos acumulados na MSUD e evidenciar o papel do estresse oxidativo e da inflamação na neuropatofiosiologia desta doença, além do efeito protetor da L-car sobre este processo. O estudo de antioxidantes, como a L-car, pode propor uma abordagem terapêutica adicional ao que é empregado atualmente para pacientes com MSUD, que é essencialmente dietética e, portanto, de difícil manejo. / Maple syrup urine disease (MSUD) is caused by deficiency of the activity of the mitochondrial enzyme complex branched-chain U-ketoacid dehydrogenase (BCKAD). The metabolic defect leads to accumulation of the branched chain amino acids (BCAA) leucine (Leu), isoleucine (Ile) and valine (Val) and the corresponding branched-chain U-keto acids. The clinical features of MSUD include ketoacidosis, seizures, coma, psychomotor delay and mental retardation. Treatment consists in Leu, Val and Ile restricted diet. Studies in animals have demonstrated that lipid peroxidation is stimulated by BCAA and BCKA in brain of rats and these metabolites reduce in vitro and in vivo the cerebral capacity to modulate the damage associated to increased free radical production. Also, there is evidence that oxidative stress occurs in MSUD patients at diagnosis and during treatment and that due to terapy with protein restricted diet they present L-carnitine (L-car) deficiency, an important compound for energy metabolism. Recent studies have demonstrated the antioxidant and anti-inflammatory role of L-carnitine (L-car), through its action against peroxidation in different tissues by various mechanisms, a scavenger of reactive oxygen species and the stabilizing effect of damage to cell membranes. Considering that the pathophysiology of MSUD is still poorly understood, and that there is an increasing number of studies emphasizing the oxidative stress involvement in the disease, this study investigated the in vitro and in vivo effect of L-car on oxidative stress and inflammatory damage in MSUD with the following purposes: A) to study the induction of damage by accumulated metabolites in MSUD, analyzing the possible antioxidant role of L-car on DNA damage in vitro; B) to evaluate the in vivo effect of 50 mg/kg/day of L-car supplementation about: b.1) the induction of DNA damage in leukocytes of MSUD patients treated with protein-restricted diet, correlating this damage with the concentrations of the major metabolites accumulated in this disorder and checking the possible antioxidant role of L-car supplementation; b.2) plasma inflammatory cytokines in treated MSUD patients with protein-restricted diet and the correlation with oxidative stress; b.3) oxidative damage parameters in urine of MSUD patients with protein-restricted diet supplemented with L-car; C) to investigate the BCAA effect on some oxidative stress parameters and evaluate the L-car efficacy against these possible pro-oxidant effects in cerebral cortex and cerebellum of rats submitted to a chronic chemically-induced model of MSUD. DNA damage index (DI) showed that Leu and -ketoisocaproic acid (KIC) groups was significantly higher than that of the control group, and that L-car was able to significantly prevent this damage, especially that due to KIC. Accordingly, DNA DI in MSUD patients under BCAA-restricted diet was significantly increased as compared to controls and L-car supplementation was able to significantly decrease this parameter. It was also verified a significant positive correlation between DNA DI and MDA content, a marker of lipid peroxidation. Furthermore, we found an inverse significant correlation between DI and L-car levels. These results strengthen a relationship between DNA damage observed in MSUD patients, oxidative stress and the L-car supplementation benefit. The role of L-car on plasma inflammatory cytokines interleukin-1Y (IL-1Y), interleukin-6 (IL-6) and interferon-gamma (INF- Z) was also evaluated in these patients. Significant increases of IL-1Y, IL-6, and INF- Z were observed before the treatment with L-car. Moreover, there is a negative correlation between all cytokines tested and L-car concentrations and a positive correlation among the MDA content and IL-1Y and IL-6 values after L-car supplementation. It was also demonstrated that the oxidative stress parameters di-tyrosine (oxidative protein damage) and isoprostanes (lipid peroxidation assay) were increased and the antioxidant capacity was reduced in urine of MSUD patients without L-car therapy and that the supplementation of this compound induced beneficial effects on these parameters, so reducing the di-tyrosine and isoprostanes levels and increasing the antioxidant capacity. It was also showed a significant increase in urinary KIC after 2 months of L-car treatment compared to control group, demonstrating an increased excretion of this toxic metabolite. In conclusion, these results suggest a reversion effect of the oxidative damage by L-car and that urine can be used to monitorize oxidative damage in patients affected by this disease. The following parameters were analysed in cerebral cortex and cerebellum of Wistar rats submitted to MSUD chemically-induced chronic model: thiobarbituric acid reactive species (TBA-RS), to evaluate lipid peroxidation, carbonyl content to evaluate protein oxidative damage, DCF oxidation to quantify reactive species production, reduced glutathione (GSH), an important non-enzymatic antioxidant and the activities of antioxidant enzymes catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GPx) and glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD). The results showed that the chronic administration of BCAA was able to promote both lipid and protein oxidation, increase of reactive species production and decreased brain antioxidant defenses, especially in cerebral cortex and that L-car was able to prevent these effects, except for oxidative damage to proteins. Taken together, these results demonstrate that the metabolites accumulated in MSUD cause oxidative damage to biomolecules (lipids, proteins and DNA), decrease antioxidant status and promote increased inflammatory processes. These results may contribute to the understanding of the mechanism of action of the cytotoxic effect of the metabolites accumulated in MSUD and the role of oxidative stress and inflammation in the MSUD neuropathophysiology besides the protective effect of L-car on this process. The study of antioxidants like L-car can opens an additional therapeutic approach to that currently employed for MSUD patients, which is primarily dietary and therefore difficult to handle.

A doença da urina do xarope do bordo (MSUD) é causada pela deficiência na atividade do complexo da desidrogenase dos U-cetoácidos de cadeia ramificada (BCKAD), promovendo o acúmulo dos aminoácidos de cadeia ramificada (BCAA) leucina (Leu), isoleucina (Ile) e valina (Val) e seus U-cetoácidos correspondentes (BCKA). A MSUD caracteriza-se por cetoacidose, ataxia, coma, retardo mental e psicomotor. Estudos em animais demonstraram que BCAA e BCKA estimulam a lipoperoxidação e reduzem capacidade antioxidante cerebral em ratos. Também há evidências de que o estresse oxidativo ocorra em pacientes com MSUD no diagnóstico e durante o tratamento e que devido à terapia com dieta restrita e hipoproteica eles possuam deficiência de L-carnitina (L-car), um importante composto para o metabolismo energético. Recentemente, estudos demonstraram o papel antioxidante e anti-inflamatório da L-car, através de sua ação antiperoxidativa, sequestradora de espécies reativas e efeito estabilizador de danos às membranas celulares. Considerando que a fisiopatologia da MSUD ainda é pouco compreendida e que existe um crescente número de estudos enfatizando o envolvimento do estresse oxidativo na doença, neste trabalho foi investigado o efeito in vitro e in vivo da L-car sobre o estresse oxidativo e o dano inflamatório na MSUD tendo como objetivos: A) estudar a indução ao dano oxidativo pelos metabólitos acumulados na MSUD, verificando o possível papel antioxidante da L-car sobre o dano ao DNA in vitro; B) avaliar o efeito in vivo da suplementação de 50 mg/kg/dia de L-car sobre: b.1) a indução do dano ao DNA em leucócitos de pacientes com a MSUD tratados com dieta de restrição proteica, correlacionando as concentrações dos principais metabólitos acumulados nesta doença e verificando o possível papel antioxidante da suplementação da Lcar; b.2) a concentração de citocinas pró-inflamatórias em plasma de pacientes com MSUD tratados com dieta de restrição proteica e a correlação com o estresse oxidativo; b.3) os parâmetros de dano oxidativo à biomoléculas em urina de pacientes com MSUD sob dieta de restrição proteica; C) avaliar o efeito da L-car sobre o estresse oxidativo causado pelos metabólitos acumulados na MSUD em córtex cerebral e cerebelo de ratos Wistar, através de um modelo crônico de indução química da doença. Verificou-se que a Leu e o seu - cetoácido correspondente, o ácido -cetoisocapróico (KIC), causaram danos ao DNA in vitro e L-car foi capaz de diminuir significativamente essas alterações, principalmente as causadas pelo KIC. Quando testado o efeito da suplementação de L-car sobre o dano ao DNA em pacientes MSUD, observou-se um aumento significativo de lesões ao DNA em pacientes com dieta de restrição proteica quando comparados aos controles e a terapia com L-car foi capaz de diminuir significativamente os níveis desses danos. Também foram verificadas correlações do tipo negativa entre as concentrações de L-car e os índices de dano ao DNA e do tipo positiva entre as lesões ao DNA e níveis de MDA, marcador de lipoperoxidação, explicitando uma relação entre o dano ao DNA observado nos pacientes com MSUD, estresse oxidativo e o benefício da suplementação de L-car. Também averiguou-se o efeito da terapia de L-car sobre as citocinas pró-inflamatórias interleucina 1Y (IL-1Y), interleucina 6 (IL-6) e interferon gama (INF- Z). Constatou-se aumentos significativos de IL-1Y, IL-6 e INF- Z no plasma de pacientes com MSUD antes da suplementação de L-car e uma reversão completa desses valores aos níveis dos controles para IL-1Y e INF- Z após a administração de L-car. Ainda, verificou-se que a L-car pode auxiliar na defesa celular contra a inflamação e o estresse oxidativo, observando-se uma correlação negativa entre todas citocinas testadas e as concentrações de L-car, e uma correlação positiva entre o conteúdo de MDA e níveis de IL-1Y e IL-6. Constatou-se também que as medidas de di-tirosina (dano oxidativo a proteínas) e isoprostanos (dano de lipoperoxidação) estavam aumentadas e a capacidade antioxidante total diminuída na urina de pacientes com MSUD sem terapia com L-car e a suplementação deste composto induziu efeitos benéficos sobre estes parâmetros, reduzindo os níveis de di-tirosina e isoprostanos e aumentando a capacidade antioxidante medida em urina. Foi também observado um aumento de KIC urinário após dois meses de tratamento com L-car, quando comparado com o grupo controle, demonstrando um incremento da excreção deste metabolito tóxico. Desta forma, esses resultados sugerem um efeito de reversão de dano oxidativo pela L-car e que a urina pode ser utilizada para monitorar este tipo de lesão em pacientes afetados pela MSUD. Por fim, foram analisados em córtex cerebral e cerebelo de ratos Wistar submetidos ao modelo crônico de MSUD: espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), para avaliar lipoperoxidação, conteúdo de carbonilas (dano oxidativo proteico), oxidação de diclorofluoresceína (DCF), para quantificar produção de espécies reativas teciduais, conteúdo de glutationa reduzida (GSH) que é um importante antioxidante não enzimático e a atividade das enzimas antioxidantes catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GPx) e glicose-6-fosfato-desidrogenase (G6PD). Os resultados mostraram que a administração crônica de BCAA estimulou a lipoperoxidação, o dano oxidativo proteico, aumento de espécies reativas e diminuição das defesas antioxidantes enzimáticas e não enzimáticas, especialmente em córtex cerebral e o tratamento com L-car foi capaz de prevenir estes efeitos, exceto o dano oxidativo a proteínas. Em conjunto, estes resultados demonstram que os metabólitos acumulados na MSUD induzem dano oxidativo a biomoléculas (lipídios, proteínas e DNA), diminuem o status antioxidante e promovem aumento de processos inflamatórios. Ainda, estes dados podem contribuir para a compreensão dos mecanismos de ação dos efeitos citotóxicos dos metabólitos acumulados na MSUD e evidenciar o papel do estresse oxidativo e da inflamação na neuropatofiosiologia desta doença, além do efeito protetor da L-car sobre este processo. O estudo de antioxidantes, como a L-car, pode propor uma abordagem terapêutica adicional ao que é empregado atualmente para pacientes com MSUD, que é essencialmente dietética e, portanto, de difícil manejo. / Maple syrup urine disease (MSUD) is caused by deficiency of the activity of the mitochondrial enzyme complex branched-chain U-ketoacid dehydrogenase (BCKAD). The metabolic defect leads to accumulation of the branched chain amino acids (BCAA) leucine (Leu), isoleucine (Ile) and valine (Val) and the corresponding branched-chain U-keto acids. The clinical features of MSUD include ketoacidosis, seizures, coma, psychomotor delay and mental retardation. Treatment consists in Leu, Val and Ile restricted diet. Studies in animals have demonstrated that lipid peroxidation is stimulated by BCAA and BCKA in brain of rats and these metabolites reduce in vitro and in vivo the cerebral capacity to modulate the damage associated to increased free radical production. Also, there is evidence that oxidative stress occurs in MSUD patients at diagnosis and during treatment and that due to terapy with protein restricted diet they present L-carnitine (L-car) deficiency, an important compound for energy metabolism. Recent studies have demonstrated the antioxidant and anti-inflammatory role of L-carnitine (L-car), through its action against peroxidation in different tissues by various mechanisms, a scavenger of reactive oxygen species and the stabilizing effect of damage to cell membranes. Considering that the pathophysiology of MSUD is still poorly understood, and that there is an increasing number of studies emphasizing the oxidative stress involvement in the disease, this study investigated the in vitro and in vivo effect of L-car on oxidative stress and inflammatory damage in MSUD with the following purposes: A) to study the induction of damage by accumulated metabolites in MSUD, analyzing the possible antioxidant role of L-car on DNA damage in vitro; B) to evaluate the in vivo effect of 50 mg/kg/day of L-car supplementation about: b.1) the induction of DNA damage in leukocytes of MSUD patients treated with protein-restricted diet, correlating this damage with the concentrations of the major metabolites accumulated in this disorder and checking the possible antioxidant role of L-car supplementation; b.2) plasma inflammatory cytokines in treated MSUD patients with protein-restricted diet and the correlation with oxidative stress; b.3) oxidative damage parameters in urine of MSUD patients with protein-restricted diet supplemented with L-car; C) to investigate the BCAA effect on some oxidative stress parameters and evaluate the L-car efficacy against these possible pro-oxidant effects in cerebral cortex and cerebellum of rats submitted to a chronic chemically-induced model of MSUD. DNA damage index (DI) showed that Leu and -ketoisocaproic acid (KIC) groups was significantly higher than that of the control group, and that L-car was able to significantly prevent this damage, especially that due to KIC. Accordingly, DNA DI in MSUD patients under BCAA-restricted diet was significantly increased as compared to controls and L-car supplementation was able to significantly decrease this parameter. It was also verified a significant positive correlation between DNA DI and MDA content, a marker of lipid peroxidation. Furthermore, we found an inverse significant correlation between DI and L-car levels. These results strengthen a relationship between DNA damage observed in MSUD patients, oxidative stress and the L-car supplementation benefit. The role of L-car on plasma inflammatory cytokines interleukin-1Y (IL-1Y), interleukin-6 (IL-6) and interferon-gamma (INF- Z) was also evaluated in these patients. Significant increases of IL-1Y, IL-6, and INF- Z were observed before the treatment with L-car. Moreover, there is a negative correlation between all cytokines tested and L-car concentrations and a positive correlation among the MDA content and IL-1Y and IL-6 values after L-car supplementation. It was also demonstrated that the oxidative stress parameters di-tyrosine (oxidative protein damage) and isoprostanes (lipid peroxidation assay) were increased and the antioxidant capacity was reduced in urine of MSUD patients without L-car therapy and that the supplementation of this compound induced beneficial effects on these parameters, so reducing the di-tyrosine and isoprostanes levels and increasing the antioxidant capacity. It was also showed a significant increase in urinary KIC after 2 months of L-car treatment compared to control group, demonstrating an increased excretion of this toxic metabolite. In conclusion, these results suggest a reversion effect of the oxidative damage by L-car and that urine can be used to monitorize oxidative damage in patients affected by this disease. The following parameters were analysed in cerebral cortex and cerebellum of Wistar rats submitted to MSUD chemically-induced chronic model: thiobarbituric acid reactive species (TBA-RS), to evaluate lipid peroxidation, carbonyl content to evaluate protein oxidative damage, DCF oxidation to quantify reactive species production, reduced glutathione (GSH), an important non-enzymatic antioxidant and the activities of antioxidant enzymes catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GPx) and glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD). The results showed that the chronic administration of BCAA was able to promote both lipid and protein oxidation, increase of reactive species production and decreased brain antioxidant defenses, especially in cerebral cortex and that L-car was able to prevent these effects, except for oxidative damage to proteins. Taken together, these results demonstrate that the metabolites accumulated in MSUD cause oxidative damage to biomolecules (lipids, proteins and DNA), decrease antioxidant status and promote increased inflammatory processes. These results may contribute to the understanding of the mechanism of action of the cytotoxic effect of the metabolites accumulated in MSUD and the role of oxidative stress and inflammation in the MSUD neuropathophysiology besides the protective effect of L-car on this process. The study of antioxidants like L-car can opens an additional therapeutic approach to that currently employed for MSUD patients, which is primarily dietary and therefore difficult to handle.

A doença da urina do xarope do bordo (MSUD) é causada pela deficiência na atividade do complexo da desidrogenase dos U-cetoácidos de cadeia ramificada (BCKAD), promovendo o acúmulo dos aminoácidos de cadeia ramificada (BCAA) leucina (Leu), isoleucina (Ile) e valina (Val) e seus U-cetoácidos correspondentes (BCKA). A MSUD caracteriza-se por cetoacidose, ataxia, coma, retardo mental e psicomotor. Estudos em animais demonstraram que BCAA e BCKA estimulam a lipoperoxidação e reduzem capacidade antioxidante cerebral em ratos. Também há evidências de que o estresse oxidativo ocorra em pacientes com MSUD no diagnóstico e durante o tratamento e que devido à terapia com dieta restrita e hipoproteica eles possuam deficiência de L-carnitina (L-car), um importante composto para o metabolismo energético. Recentemente, estudos demonstraram o papel antioxidante e anti-inflamatório da L-car, através de sua ação antiperoxidativa, sequestradora de espécies reativas e efeito estabilizador de danos às membranas celulares. Considerando que a fisiopatologia da MSUD ainda é pouco compreendida e que existe um crescente número de estudos enfatizando o envolvimento do estresse oxidativo na doença, neste trabalho foi investigado o efeito in vitro e in vivo da L-car sobre o estresse oxidativo e o dano inflamatório na MSUD tendo como objetivos: A) estudar a indução ao dano oxidativo pelos metabólitos acumulados na MSUD, verificando o possível papel antioxidante da L-car sobre o dano ao DNA in vitro; B) avaliar o efeito in vivo da suplementação de 50 mg/kg/dia de L-car sobre: b.1) a indução do dano ao DNA em leucócitos de pacientes com a MSUD tratados com dieta de restrição proteica, correlacionando as concentrações dos principais metabólitos acumulados nesta doença e verificando o possível papel antioxidante da suplementação da Lcar; b.2) a concentração de citocinas pró-inflamatórias em plasma de pacientes com MSUD tratados com dieta de restrição proteica e a correlação com o estresse oxidativo; b.3) os parâmetros de dano oxidativo à biomoléculas em urina de pacientes com MSUD sob dieta de restrição proteica; C) avaliar o efeito da L-car sobre o estresse oxidativo causado pelos metabólitos acumulados na MSUD em córtex cerebral e cerebelo de ratos Wistar, através de um modelo crônico de indução química da doença. Verificou-se que a Leu e o seu - cetoácido correspondente, o ácido -cetoisocapróico (KIC), causaram danos ao DNA in vitro e L-car foi capaz de diminuir significativamente essas alterações, principalmente as causadas pelo KIC. Quando testado o efeito da suplementação de L-car sobre o dano ao DNA em pacientes MSUD, observou-se um aumento significativo de lesões ao DNA em pacientes com dieta de restrição proteica quando comparados aos controles e a terapia com L-car foi capaz de diminuir significativamente os níveis desses danos. Também foram verificadas correlações do tipo negativa entre as concentrações de L-car e os índices de dano ao DNA e do tipo positiva entre as lesões ao DNA e níveis de MDA, marcador de lipoperoxidação, explicitando uma relação entre o dano ao DNA observado nos pacientes com MSUD, estresse oxidativo e o benefício da suplementação de L-car. Também averiguou-se o efeito da terapia de L-car sobre as citocinas pró-inflamatórias interleucina 1Y (IL-1Y), interleucina 6 (IL-6) e interferon gama (INF- Z). Constatou-se aumentos significativos de IL-1Y, IL-6 e INF- Z no plasma de pacientes com MSUD antes da suplementação de L-car e uma reversão completa desses valores aos níveis dos controles para IL-1Y e INF- Z após a administração de L-car. Ainda, verificou-se que a L-car pode auxiliar na defesa celular contra a inflamação e o estresse oxidativo, observando-se uma correlação negativa entre todas citocinas testadas e as concentrações de L-car, e uma correlação positiva entre o conteúdo de MDA e níveis de IL-1Y e IL-6. Constatou-se também que as medidas de di-tirosina (dano oxidativo a proteínas) e isoprostanos (dano de lipoperoxidação) estavam aumentadas e a capacidade antioxidante total diminuída na urina de pacientes com MSUD sem terapia com L-car e a suplementação deste composto induziu efeitos benéficos sobre estes parâmetros, reduzindo os níveis de di-tirosina e isoprostanos e aumentando a capacidade antioxidante medida em urina. Foi também observado um aumento de KIC urinário após dois meses de tratamento com L-car, quando comparado com o grupo controle, demonstrando um incremento da excreção deste metabolito tóxico. Desta forma, esses resultados sugerem um efeito de reversão de dano oxidativo pela L-car e que a urina pode ser utilizada para monitorar este tipo de lesão em pacientes afetados pela MSUD. Por fim, foram analisados em córtex cerebral e cerebelo de ratos Wistar submetidos ao modelo crônico de MSUD: espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), para avaliar lipoperoxidação, conteúdo de carbonilas (dano oxidativo proteico), oxidação de diclorofluoresceína (DCF), para quantificar produção de espécies reativas teciduais, conteúdo de glutationa reduzida (GSH) que é um importante antioxidante não enzimático e a atividade das enzimas antioxidantes catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GPx) e glicose-6-fosfato-desidrogenase (G6PD). Os resultados mostraram que a administração crônica de BCAA estimulou a lipoperoxidação, o dano oxidativo proteico, aumento de espécies reativas e diminuição das defesas antioxidantes enzimáticas e não enzimáticas, especialmente em córtex cerebral e o tratamento com L-car foi capaz de prevenir estes efeitos, exceto o dano oxidativo a proteínas. Em conjunto, estes resultados demonstram que os metabólitos acumulados na MSUD induzem dano oxidativo a biomoléculas (lipídios, proteínas e DNA), diminuem o status antioxidante e promovem aumento de processos inflamatórios. Ainda, estes dados podem contribuir para a compreensão dos mecanismos de ação dos efeitos citotóxicos dos metabólitos acumulados na MSUD e evidenciar o papel do estresse oxidativo e da inflamação na neuropatofiosiologia desta doença, além do efeito protetor da L-car sobre este processo. O estudo de antioxidantes, como a L-car, pode propor uma abordagem terapêutica adicional ao que é empregado atualmente para pacientes com MSUD, que é essencialmente dietética e, portanto, de difícil manejo. / Maple syrup urine disease (MSUD) is caused by deficiency of the activity of the mitochondrial enzyme complex branched-chain U-ketoacid dehydrogenase (BCKAD). The metabolic defect leads to accumulation of the branched chain amino acids (BCAA) leucine (Leu), isoleucine (Ile) and valine (Val) and the corresponding branched-chain U-keto acids. The clinical features of MSUD include ketoacidosis, seizures, coma, psychomotor delay and mental retardation. Treatment consists in Leu, Val and Ile restricted diet. Studies in animals have demonstrated that lipid peroxidation is stimulated by BCAA and BCKA in brain of rats and these metabolites reduce in vitro and in vivo the cerebral capacity to modulate the damage associated to increased free radical production. Also, there is evidence that oxidative stress occurs in MSUD patients at diagnosis and during treatment and that due to terapy with protein restricted diet they present L-carnitine (L-car) deficiency, an important compound for energy metabolism. Recent studies have demonstrated the antioxidant and anti-inflammatory role of L-carnitine (L-car), through its action against peroxidation in different tissues by various mechanisms, a scavenger of reactive oxygen species and the stabilizing effect of damage to cell membranes. Considering that the pathophysiology of MSUD is still poorly understood, and that there is an increasing number of studies emphasizing the oxidative stress involvement in the disease, this study investigated the in vitro and in vivo effect of L-car on oxidative stress and inflammatory damage in MSUD with the following purposes: A) to study the induction of damage by accumulated metabolites in MSUD, analyzing the possible antioxidant role of L-car on DNA damage in vitro; B) to evaluate the in vivo effect of 50 mg/kg/day of L-car supplementation about: b.1) the induction of DNA damage in leukocytes of MSUD patients treated with protein-restricted diet, correlating this damage with the concentrations of the major metabolites accumulated in this disorder and checking the possible antioxidant role of L-car supplementation; b.2) plasma inflammatory cytokines in treated MSUD patients with protein-restricted diet and the correlation with oxidative stress; b.3) oxidative damage parameters in urine of MSUD patients with protein-restricted diet supplemented with L-car; C) to investigate the BCAA effect on some oxidative stress parameters and evaluate the L-car efficacy against these possible pro-oxidant effects in cerebral cortex and cerebellum of rats submitted to a chronic chemically-induced model of MSUD. DNA damage index (DI) showed that Leu and -ketoisocaproic acid (KIC) groups was significantly higher than that of the control group, and that L-car was able to significantly prevent this damage, especially that due to KIC. Accordingly, DNA DI in MSUD patients under BCAA-restricted diet was significantly increased as compared to controls and L-car supplementation was able to significantly decrease this parameter. It was also verified a significant positive correlation between DNA DI and MDA content, a marker of lipid peroxidation. Furthermore, we found an inverse significant correlation between DI and L-car levels. These results strengthen a relationship between DNA damage observed in MSUD patients, oxidative stress and the L-car supplementation benefit. The role of L-car on plasma inflammatory cytokines interleukin-1Y (IL-1Y), interleukin-6 (IL-6) and interferon-gamma (INF- Z) was also evaluated in these patients. Significant increases of IL-1Y, IL-6, and INF- Z were observed before the treatment with L-car. Moreover, there is a negative correlation between all cytokines tested and L-car concentrations and a positive correlation among the MDA content and IL-1Y and IL-6 values after L-car supplementation. It was also demonstrated that the oxidative stress parameters di-tyrosine (oxidative protein damage) and isoprostanes (lipid peroxidation assay) were increased and the antioxidant capacity was reduced in urine of MSUD patients without L-car therapy and that the supplementation of this compound induced beneficial effects on these parameters, so reducing the di-tyrosine and isoprostanes levels and increasing the antioxidant capacity. It was also showed a significant increase in urinary KIC after 2 months of L-car treatment compared to control group, demonstrating an increased excretion of this toxic metabolite. In conclusion, these results suggest a reversion effect of the oxidative damage by L-car and that urine can be used to monitorize oxidative damage in patients affected by this disease. The following parameters were analysed in cerebral cortex and cerebellum of Wistar rats submitted to MSUD chemically-induced chronic model: thiobarbituric acid reactive species (TBA-RS), to evaluate lipid peroxidation, carbonyl content to evaluate protein oxidative damage, DCF oxidation to quantify reactive species production, reduced glutathione (GSH), an important non-enzymatic antioxidant and the activities of antioxidant enzymes catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GPx) and glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD). The results showed that the chronic administration of BCAA was able to promote both lipid and protein oxidation, increase of reactive species production and decreased brain antioxidant defenses, especially in cerebral cortex and that L-car was able to prevent these effects, except for oxidative damage to proteins. Taken together, these results demonstrate that the metabolites accumulated in MSUD cause oxidative damage to biomolecules (lipids, proteins and DNA), decrease antioxidant status and promote increased inflammatory processes. These results may contribute to the understanding of the mechanism of action of the cytotoxic effect of the metabolites accumulated in MSUD and the role of oxidative stress and inflammation in the MSUD neuropathophysiology besides the protective effect of L-car on this process. The study of antioxidants like L-car can opens an additional therapeutic approach to that currently employed for MSUD patients, which is primarily dietary and therefore difficult to handle.